CN106676040B - 一种灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂 - Google Patents

一种灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂。该灰平链霉菌的保藏编号为CGMCC No.13249。本发明研究发现该灰平链霉菌具有较好的溶磷特性、较强的合成铁载体的能力，可抑制多种引起植物病害的病原真菌活性。本发明灰平链霉菌具有植物抗病、促生潜能，为研究开发环境友好型的溶磷植物促生放线菌菌剂提供优质的材料。

Description

一种灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂。
背景技术
磷矿资源的日益枯竭已成为限制农业可持续发展的世界性问题。磷是植物生长的必要元素，在生产实践中，为了提高作物产量，大量可溶性磷肥施入土壤中，但多被土壤固定，以难溶性无机磷的形式存在，无法被植物吸收和利用。因此，土壤无效磷素的活化成为资源学和肥料学急需解决的重要问题。
溶磷菌能够将难溶性磷酸盐溶解，活化磷素状态。不仅可以“动员”农田土壤磷库资源，促进土壤肥力的提高，减少化学磷肥的使用量和高品位磷矿资源的消耗量，解决土壤无效磷素活化和磷矿资源日渐枯竭的问题；还可以有效开发利用我国大量的低品位磷矿及尾矿，提高磷肥利用率，解决磷矿开采和加工过程中产生的环境污染问题。因此，生物磷肥的开发和应用是解决“磷”问题的最佳途径。
目前，国内外研究中有关溶磷菌的研究成果很多，但多集中在溶磷细菌和溶磷真菌的分类和溶磷机理的研究领域，如公开/公告号为CN103834584A的发明专利提供了一种溶磷菌，命名为DDC 95，可作为溶磷菌辅助植物生长。该菌株分离自大豆根际，对促进大豆对土壤中难溶的无机磷素吸收利用效果明显。又如公开/公告号为CN102618449A的发明提供了一种溶磷菌，该溶磷菌分类命名为臭曲霉Aspergillus foetidus，其保藏登记号为CGMCC No.5857。该溶磷菌用于生产微生物肥料，并用于烟叶的栽培，通过溶磷、解钾等功能微生物的直接作用，释放土壤中的不易被吸收的养分，改良了土壤品质，促进土壤中有益微生物的繁殖，提高了土壤中有益微生物的数量，调节土壤中的营养平衡，从而提高了烟株对矿质营养的平衡吸收，提高烟叶质量和肥料利用率，并减少了环境污染。
放线菌因其耐贫瘠、极端环境生存能力强、产多种活性物质和抗病促生等多重功效而备受关注，但国内外对溶磷放线菌资源和溶磷机理的研究甚少，限制了溶磷放线菌的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂。该放线菌具有较好的溶磷特性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种灰平链霉菌，其保藏编号为CGMCC No.13249。
本发明从玉米根际土壤这种特定植物的根际环境中筛选具有植物抗病、促生潜能的灰平链霉菌，以获得与植物亲和性好，易于在植物根际定殖的溶磷植物促生放线菌菌株，为研究开发环境友好型的溶磷植物促生放线菌菌剂提供优质的材料。
在本发明提供的实施例中，保藏编号为CGMCC No.13249的灰平链霉菌的筛选方法为：将采集的玉米根际的新鲜土样采用水稀释，将稀释液涂布于NBRIP培养基上，经培养、纯化，得到灰平链霉菌。
在本发明中，NBRIP培养基的配方为：葡萄糖10g、Ca3(PO4)2 5g、MgCl2 5g、MgSO40.25g、KCl 0.2g、(NH4)2SO4 0.1g，溶于1L去离子水中，调节pH7.2，灭菌。该培养基加入20g琼脂即为固体NBRIP培养基。
在本发明提供的实施例中，筛选时培养的温度为28℃。
在本发明提供的实施例中，筛选时培养的时间为48h。
作为优选，该灰平链霉菌采用ISP4培养基进行发酵种子的培养。
在本发明中，ISP4液体培养基配方：可溶性淀粉10g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 1g，(NH4)2SO4 2g，CaCO3 2g，溶于1L水，调节pH7.2，灭菌。
作为优选，灰平链霉菌发酵种子的培养方法为：将成熟菌株及孢子接种于ISP4液体培养基中120r/m，28℃培养5～7d。
在本发明中，该灰平链霉菌采用固体发酵培养基进行发酵培养。
在本发明中，固体发酵培养基的配方为：玉米碴550g，大米400g，小米50g，CaCO310g，用2倍浓缩的高氏一号液体培养基调节含水率为60％，灭菌。
作为优选，灰平链霉菌的固体发酵培养方法为：将灰平链霉菌液体发酵菌株接种于固体发酵培养基中，28℃培养5～7d。
作为优选，该灰平链霉菌的贮存方法为：将该菌放置于阴凉干燥处保存或0～4℃条件下保存。
本发明还提供了该灰平链霉菌在溶解无效磷中的应用。
本发明还提供了该灰平链霉菌在合成铁载体中的应用。
本发明还提供了该灰平链霉菌在抑制引起植物病害的病原真菌活性中的应用。
在本发明提供的实施例中，引起植物病害的病原真菌为禾谷镰孢菌、黄瓜枯萎病菌、人参菌核病菌、人参根腐病菌和人参枯萎病菌。
本发明还提供了一种微生物菌剂，包括本发明的灰平链霉菌。
作为优选，微生物菌剂中还包括农药学上可接受的辅料。
本发明提供了一种灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂。该灰平链霉菌的保藏编号为CGMCC No.13249。本发明至少具有如下优势之一：
1、本发明研究发现该灰平链霉菌具有较好的溶磷特性；
2、本发明研究发现该灰平链霉菌具有较强的合成铁载体的能力；
3、本发明研究发现该灰平链霉菌可抑制多种引起植物病害的病原真菌活性。
4、本发明灰平链霉菌具有植物抗病、促生潜能，为研究开发环境友好型的溶磷植物促生放线菌菌剂提供优质的材料。
生物保藏说明
分类命名：灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)，于2016年11月08日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13249。
附图说明
图1示菌株PSA1在NBRIP培养基上的生长；
图2示菌株PSA1溶磷性能测定；
图3示菌株PSA1在不同培养基上的培养特征；
图4示菌株PSA1***发育树的构建；
图5示灰平链霉菌PSA1产铁载体情况；
图6示灰平链霉菌PSA1对禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抑制作用；其中6-1所示培养皿添加有灰平链霉菌PSA1，6-2为对照；
图7示灰平链霉菌PSA1对黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporiumf.sp.cucumerinum)的抑制作用；其中7-1所示培养皿添加有灰平链霉菌PSA1，7-2为对照；
图8示灰平链霉菌PSA1对人参菌核病菌(Sclerotinia libertiana Fuck.)的抑制作用；其中8-1所示培养皿添加有灰平链霉菌PSA1，8-2为对照；
图9示灰平链霉菌PSA1对人参根腐病菌(Fusarium solani)的抑制作用；其中9-1所示培养皿添加有灰平链霉菌PSA1，9-2为对照；
图10示灰平链霉菌PSA1对人参枯萎病菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用；其中10-1所示培养皿添加有灰平链霉菌PSA1，10-2为对照。
具体实施方式
本发明公开了一种灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的灰平链霉菌及其应用和微生物菌剂中所用培养基、试剂等均可由市场购得。
在本发明实施例中，NBRIP培养基的配方为：葡萄糖10g、Ca3(PO4)2 5g、MgCl2 5g、MgSO4 0.25g、KCl 0.2g、(NH4)2SO4 0.1g，溶于1L去离子水中，调节pH7.2，121.3℃高压蒸汽灭菌20min。该培养基加入20g琼脂即为固体NBRIP培养基。
ISP4液体培养基配方：可溶性淀粉10g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 1g，(NH4)2SO4 2g，CaCO3 2g，溶于1L水，调节pH7.2，121.3℃高压蒸汽灭菌20min。将平皿中成熟菌株及孢子接种于液体发酵培养基中120r/m，28℃培养5～7d。
固体发酵培养基：玉米碴550g，加入大米400g，小米50g，CaCO310g，用2倍浓缩的高氏一号液体培养基调节含水率为60％，110℃条件下高压蒸汽灭菌2小时。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1溶磷放线菌的筛选
称取10g从公主岭采集的玉米根际新鲜土样加到100mL无菌水中，采用平板稀释法制备土壤稀释液，涂布至NBRIP培养基上，28℃培养48h，挑取生长状态良好的菌落进行纯化。将纯化后的菌株分别于4℃和-80℃保存备用。溶磷放线菌的筛选结果如图1所示。命名为PSA1菌株。
实施例2溶磷性能测定
将实施例1筛选纯化后的玉米根际放线菌接种于液体高氏一号培养基进行扩大培养7d，8000rpm离心5min收集菌体，用去离子水重悬菌体沉淀后8000rpm离心5min，此操作重复3次，将菌体表面的高氏一号培养基成分洗净，无菌操作称取0.5g菌体(湿重)接种于100mL NBRIP液体培养基(NBRIP培养基：葡萄糖10g，磷酸钙5g，氯化镁5g，硫酸镁0.25g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～8.0)中，28℃摇床培养20d，采用钼锑抗比色法测定不同培养时间发酵液上清中有效磷含量，对玉米根际溶磷放线菌进行溶磷性能测定。以不接菌的培养基为对照。
将PSA1接种于液体NBRIP培养基中，测定发酵液上清中的有效磷含量，结果如图2所示。
实施例3玉米根际溶磷放线菌的鉴定
1、玉米根际溶磷放线菌的培养特征和生理生化特性鉴定
采用插片法观察实施例1玉米根际溶磷放线菌菌丝体形态，并参照范丽霞等的方法，采用国际链霉菌计划培养基(ISP)，将溶磷放线菌菌株分别接种到酵母膏麦芽膏琼脂培养基(ISP2)、燕麦粉琼脂培养基(ISP3)、无机盐淀粉琼脂培养基(ISP4)、甘油天门冬酰胺琼脂培养基(ISP5)、蛋白胨酵母膏铁盐琼脂培养基(ISP6)、酪氨酸琼脂培养基(ISP7)、察氏培养基和PDA培养基上，28℃培养5～10d，观察并记录菌株在7种不同培养基上的培养特征。参照徐丽华等的方法进行玉米根际溶磷放线菌的生理生化特征鉴定。
生理生化鉴定结果如图3所示：
PSA1在高氏一号培养基上生长旺盛，菌落为乳脂色，气丝丰茂呈绒粉状，孢子丝直、柔曲，松敞螺旋形，基丝好，浅黄色至浅褐色；
PSA1在ISP系列培养基及察氏培养基和PDA培养基上均不产生可溶性色素。ISP2培养基：气生菌丝丰茂，灰色至暗灰色，基内菌丝好，浅灰黄色至灰黄褐色。ISP3：气生菌丝丰茂，灰色，基内菌丝好，浅灰黄色。ISP4：气生菌丝生长一般，灰色至橄榄灰色，基内菌丝好，浅灰黄色至橄榄灰色。ISP5：气生菌丝生长一般，灰色，基内菌丝灰色。ISP6：气生菌丝浅灰黄色，基内菌丝浅灰黄色。ISP7：气生菌丝橄榄灰色，基内菌丝暗灰色。
察氏培养基：气生菌丝丰茂，白色至浅灰色，基内菌丝好，浅灰黄色至浅褐色。PSA1菌株明胶液化、淀粉水解、硝酸盐还原、纤维素水解，但不产生硫化氢、黑色素。
PDA培养基：气生菌丝丰茂，浅灰色，基内菌丝好，浅灰黄色。
由上述试验结果可见，该菌株利用葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠效果较好，对棉子糖、肌醇、乳糖效果一般，L-鼠李糖效果最差。
2、玉米根际溶磷放线菌的分子鉴定
将具有溶磷特性的玉米根际放线菌接种于高氏一号液体培养基中，28℃摇床培养7d，离心收集菌体后抽真空冷冻干燥48小时。冷冻干燥后的菌体，提取基因组DNA。参照Hanane Hamdali et(2008)的方法进行16S rDNA扩增。扩增产物送上海生物工程技术服务有限公司测序，用Clustal W对测序结果与GenBank中相关的16S rRNA序列进行比对，通过MEGA6.0软件对菌株进行***发育分析，采用邻接法(neighbor-joining)构建***进化树，用Bootstrap法(1000次重复)检验。
16S rDNA分子鉴定结果：以菌株PSA1总DNA为模板，对PSA1菌株的16S rDNA进行PCR扩增并测序。将测序结果提交到NCBI GenBank(KX226414)。用Clustal W对测序结果与GenBank中相关的16S rRNA序列进行比对，通过MEGA6.0软件对菌株进行***发育分析，采用邻接法(neighbor-joining)构建***进化树，用Bootstrap法(1000次重复)检验。结果如图4表明，菌株PSA1与已报道的灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus亲缘关系最近，同源性达99％，与Blast结果一致。因此，菌株PSA1在分类学地位上初步确定为灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus strain PSA1。
实施例4产铁载体活性的定性分析
将具有溶磷功能的玉米根际放线菌接种于CAS固体培养基(CAS检测培养基(100mL)：20％葡萄糖1mL，10％酸水解酪素3mL，1mmol/L CaCl2 100μL，1mmol/L MgSO4·7H2O 2mL，琼脂粉1.8g，115℃灭菌，冷却至60℃时缓慢加入过滤除菌的10×磷酸盐缓冲液和CAS检测液各5mL混匀。CAS检测液：2mL 1mmol/L FeCl3加入含有0.012g铬天青(CAS)溶于10mL去离子水中，充分混合后缓慢倒入含有0.015g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的8mL去离子水中，过滤除菌，避光保存。10×磷酸盐缓冲液(pH6.8)：每100mL缓冲液含Na2HPO4·2H2O 2.427g，NaH2PO4·2H2O 0.5905g；KH2PO4·3H2O 0.075g；NHCl4 0.25g；NaCl 0.125g，调节pH6.8。用时稀释10倍。将PSA1菌株接种于CAS固体培养基表面，28℃培养15d，观察菌落周围是否有透明圈。
结果如图5所示：将玉米根际溶磷放线菌PSA1接种于CAS固体平板培养15d后，在其菌落周围出现明显的橙红色颜色圈，说明玉米根际溶磷放线菌PSA1具有合成铁载体的活性。
实施例5玉米根际土壤溶磷放线菌拮抗活性筛选
植物病原菌菌种及来源：人参立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani Kuhn)、人参菌核病菌(Sclerotinia libertiana Fuck.)、人参枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、人参根腐病菌(Fusarium solani)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum)、串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)、玉米弯孢叶斑病菌(Curvularia lunata)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)。以上菌株均由吉林农业大学农学院植物病理实验室提供。
以上述9种引起植物病害的病原真菌为指示菌，采用对峙培养法，筛选具有拮抗活性的溶磷放线菌。在PDA培养基表面一端接种指示菌，另一端接种玉米根际溶磷放线菌，每组试验重复3次，培养至病原菌长满整个培养皿时结束培养，以抑菌带宽度确定放线菌的拮抗活性。以不接放线菌的平板做对照。结果如图6～10所示。
结果显示，实施例1筛选得到的玉米根际溶磷放线菌可明显抑制禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum)、人参菌核病菌(Sclerotinia libertiana Fuck.)、人参根腐病菌(Fusarium solani)和人参枯萎病菌(Fusarium oxysporum)的生长，显示该菌具有拮抗植物病原菌的活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)在溶解无效磷中的应用，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.13249。
2.一种灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)在合成铁载体中的应用，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.13249。
3.一种灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)在抑制引起植物病害的病原真菌活性中的应用，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.13249。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引起植物病害的病原真菌为禾谷镰孢菌、黄瓜枯萎病菌、人参菌核病菌、人参根腐病菌和人参枯萎病菌。
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