CN104593300B - 一种水产动物肠道改良用的菌株及其应用 - Google Patents

一种水产动物肠道改良用的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明从福建省宁德市网箱养殖的健康大黄鱼鱼肠中分离并筛选得到对水产养殖动物肠道的改良具有促进作用的功能菌株，通过对该菌株进行生理生化特性测定和16s rDNA鉴定，最终确认其为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）的一个菌株；同时揭露了利用其制备能够对水产动物肠道起到促进作用的微生物制剂；所得的微生物制剂对水产病原菌溶藻弧菌、嗜水气单胞菌都有较好的抑制作用，且能快速降低pH值，能够降低水产养殖动物的饵料系数，并能提高水产动物成活率。

Description

一种水产动物肠道改良用的菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种水产动物肠道改良的菌株及其应用。
背景技术
水产养殖动物的疾病发生与养殖环境、病原菌和水产动物机体本身有关。因此在养殖过程中除了改善养殖环境的同时，关注水产动物肠道健康也至关重要。研究表明乳酸菌可以有效改善水产动物的肠道健康，从而促进水产动物的生长，降低饵料系数。如专利号：201210465656.1的中国专利公开了一种海参养殖用麦饭石载体乳酸菌剂的制备方法，其将乳酸菌与营养饲料混合，适用于海参养殖使用。但目前已报导的应用于水产养殖的益生菌功效都比较单一，筛选分离具有多重功效的益生菌能创造巨大经济利益，具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种水产动物肠道改良用的菌株，该菌株为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）菌株DS31，于2014年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院2号，保藏编号为CGMCC No.10073。并同时揭露了利用该菌株制备所得的微生物制剂。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
申请人从采自福建省宁德市网箱养殖的健康大黄鱼鱼肠中分离并筛选得到对水产养殖动物肠道改良具有促进作用的功能菌株，通过对该菌株进行生理生化特性测定和16s rDNA鉴定，最终确认其为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）的一个菌株。
同时，利用该菌株制备水产动物肠道改良用的微生物制剂，该微生物制剂的制备操作步骤如下：
（1）菌株扩培：取所述的水产动物肠道改良用的菌株并将其接种至MRS培养基中，且于30-45℃、摇床150-200rpm下活化培养5-10h；活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于30-45℃、摇床150-200rpm条件下培养12-24h；
（2）菌株吸附：于步骤（1）扩培后的菌液中添加粉碎细度120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸石粉50g/L-2000g/L，并于100-150rpm下吸附1-5h；
（3）浓缩与干燥：步骤（2）吸附后的菌液于8000-10000rpm离心5-10min，弃上清得湿菌液，并加入0.1-1.0ml/L的保护剂，30-40℃搅拌干燥后，分装包装即得所述微生物制剂的产品。
进一步地，所述保护剂为甘油、海藻酸钠、糊精中的任一种。
进一步地，所述MRS培养基的组分均为：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0g、柠檬酸三铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、Tween-80 1.0 mL、NaAc 5.0 g、K2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.25 g、H2O 1000 mL、pH 6.2-6.6。
本发明的有益效果在于：提供了一种水产动物肠道改良用的菌株即干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）DS31，同时揭露了利用其制备能够对水产动物肠道起到促进作用的微生物制剂，所得的微生物制剂对水产病原菌溶藻弧菌、嗜水气单胞菌都有较好的抑制作用，且能快速降低pH值，能够降低水产养殖动物的饵料系数，并能提高水产动物成活率；因此具有较好的应用前景。
具体实施方式
本发明一种水产动物肠道改良用的菌株即干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）DS31是采自福建省宁德市网箱养殖的健康大黄鱼鱼肠中分离并筛选得到对水产养殖动物肠道的改良具有促进作用的功能菌株，并揭露了利用该菌株FA08制备改善水产动物肠道的微生物制剂。
一、菌株DS31的分离与鉴定：
1、初筛：
将新鲜大黄鱼于冰盘上进行解剖，刮取鱼肠内壁粘膜置于0.85%NaCl中，搅拌均匀后经梯度稀释并涂布于BCP培养基，于37℃生化培养箱中培养24-48h直至菌落长出，挑取周围变黄的菌落，保存到MRS斜面备用。
本发明中，BCP培养基的组分：酵母膏25g、蛋白胨5.0g、葡萄糖5.0g、溴甲酚紫0.004g、琼脂15g、水1000ml，pH7.0；MRS培养基的组分为：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、Tween-80 1.0 mL、NaAc 5.0 g、K2HPO4 2.0g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.25 g、H2O 1000 mL、琼脂15g，pH 6.2-6.6；
2、复筛：
挑取初筛保存的菌落并接种至MRS试管中活化6h，活化好的菌液按5%接种量接种至MRS培养基中，于37℃、180rpm、摇床培养24h，摇床培养期间每隔2h取样测pH，进而筛选出产酸能力最强的菌株，将该菌株标记为菌株DS31。
3、鉴定：
将筛选所得菌株DS31接种至MRS固体培养基中，37℃下培养，观察菌落形态，并做部分生理生化特性的测定，结果如下：菌落乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，革兰氏阳性，无芽孢，葡萄糖发酵阳性，乳糖发酵阳性。同时对该菌株进行16S rDNA鉴定，得其16srDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
将测得的16s rDNA序列输入NCBI进行同源性搜索，发现其相似度最高的为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）；则结合生理生化鉴定结果及16s rDNA序列数据库比对结果，确定该菌株DS31为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）的一个菌株。
二、微生物制剂的制备：
利用菌株DS31制备水产动物肠道改良用的微生物制剂，其操作步骤如下：
（1）菌株扩培：取所述的干酪乳杆菌菌株DS31（Lactobacillus casei）并将其接种至MRS培养基中，且于30-45℃、摇床150-200rpm下活化培养5-10h；活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于30-45℃、摇床150-200rpm条件下培养12-24h；
（2）菌株吸附：于步骤（1）扩培后的菌液中添加粉碎细度120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸石粉50g/L-2000g/L，并于100-150rpm下吸附1-5h；
（3）浓缩与干燥：步骤（2）吸附后的菌液于8000-10000rpm离心5-10min，弃上清得湿菌液，并加入0.1-1.0ml/L的保护剂，30-40℃搅拌干燥后，分装包装即得所述微生物制剂的产品。
本发明中，保护剂选用甘油、海藻酸钠、糊精中的任一种；所述MRS培养基的组分均为：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、Tween-80 1.0 mL、NaAc 5.0 g、K2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.25 g、H2O 1000mL、pH 6.2-6.6。
为了更好的对本发明中微生物制剂进行进一步阐述说明，申请人例举了如下实施例。
实施例1
菌株扩培：取干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）菌株DS31并将其接种至MRS培养基中，且于30℃、摇床150rpm下活化培养10h；活化好即得种子液，接着按10%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于30℃、摇床200rpm条件下培养12h；
菌株吸附：于扩培后的菌液中添加粉碎细度120-250目的硅藻土2000g/L，并于150rpm下吸附1h；
浓缩与干燥：吸附后的菌液于10000rpm离心8min，弃上清得湿菌液，并加入0.1ml/L的甘油， 40℃搅拌干燥后，分装包装即得所述微生物制剂的产品。
实施例2
菌株扩培：取所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）菌株DS31并将其接种至MRS培养基中，且于45℃、摇床150rpm下活化培养5h；活化好即得种子液，接着按1%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于34℃、摇床150rpm条件下培养24h；
菌株吸附：于扩培后的菌液中添加粉碎细度120-250目的麦饭石粉1000g/L，并于100rpm下吸附5h；
浓缩与干燥：吸附后的菌液于9000rpm离心5min，弃上清得湿菌液，并加入1.0ml/L的海藻酸钠，30℃搅拌干燥后，分装包装即得所述微生物制剂的产品。
实施例3
菌株扩培：取所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）菌株DS31并将其接种至MRS培养基中，且于37℃、摇床180rpm下活化培养7h；活化好即得种子液，接着按5%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于35℃、摇床180rpm条件下培养18h；
菌株吸附：于扩培后的菌液中添加粉碎细度120-250目的沸石粉50g/L，并于140rpm下吸附3h；
浓缩与干燥：吸附后的菌液于8000rpm离心10min，弃上清得湿菌液，并加入0.5ml/L的糊精，35℃搅拌干燥后，分装包装即得所述微生物制剂的产品。
三、菌株DS31及微生物制剂的效果试验：
试验1：
取菌株DS31并将其接种于MRS培养基，37℃、170rpm下活化5h；活化好的菌液按5%接种MRS培养基（组分为：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、Tween-80 1.0 mL、NaAc 5.0 g、K2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.25 g、H2O 1000 mL、pH 6.2-6.6），37℃，170rpm，培养20h；培养好后于10000rpm离心6min，弃去沉淀，得发酵上清液；制作抑菌板，打孔后，孔内添加50uL发酵上清液后置于37℃培养过夜；且该抑菌板：45℃ 熔融SLB添加1%活化好的病原菌（溶藻弧菌、嗜水气单胞菌）；观察记录抑菌板上抑菌圈径。
试验结果：
指示菌 抑菌圈（mm）
溶藻弧菌 13.92±0.88
嗜水气单胞菌 13.27±0.53
试验2：
取菌株DS31并将其接种于MRS培养基，37℃、170rpm下活化5h；活化好的菌液按1%接种量接种至MRS培养基，37℃、170rpm下发酵培养20h；检测、记录发酵培养过程中发酵液pH的变化情况。
试验结果：培养12h时，发酵液pH降至4.1；24h，发酵液pH降至3.5以下。
试验3：
取本发明微生物制剂（以实施例3制得的为例）在养殖甲鱼池塘使用：设计一对照组与一实验组；实验组中在甲鱼饲料中按4g/kg的拌饵量添加本发明微生物制剂，每天拌饵一次进行饲喂；对照组为空白对照，即喂饲相同饵料但不添加本发明微生物制剂；试验5个月后，计算甲鱼池塘中甲鱼的饵料系数及成活率。
通过计算得试验结果为：没有使用本发明益生菌制剂的对照组饵料系数1.56，成活率80.1%；而实验组饵料系数1.40，成活率87.5%。
试验4：
取本发明微生物制剂（以实施例3制得的为例）在养殖甲鱼池塘使用：设计一对照组与一实验组；实验组中在甲鱼饲料中按8g/kg的拌饵量添加本发明微生物制剂，每天拌饵一次进行饲喂；对照组为空白对照，即喂饲相同饵料但不添加本发明微生物制剂；试验5个月后，计算甲鱼池塘中甲鱼的饵料系数及成活率。
通过计算得试验结果为：没有使用本发明益生菌制剂的对照组饵料系数1.56，成活率80.1%；而实验组饵料系数1.37，成活率89.3%。
经由试验3与试验4相比，可知，增加本品的使用量能降低饵料系数，能够略提高成活率。
综上，本发明提供了一种水产动物肠道改良用的菌株即干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）DS31，利用其制备所得的微生物制剂对水产病原菌溶藻弧菌、嗜水气单胞菌都有较好的抑制作用，且能快速降低pH值，能够降低水产养殖动物的饵料系数，并能提高水产动物成活率；因此具有较好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家***第三海洋研究所
<120> 一种水产动物肠道改良用的菌株及其应用
<130> 10000
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1453
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）
<400> 1
gccgcctatg atggagtcgt acgagttctg tgcggtgaag ggtgcttgca ccgtgattca 60
acttaaaacg agtggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgccctt aagtggggga 120
taacatttgg aaacagatgc taataccgca taaatccaag aaccgcatgg ttcttggctg 180
aaagatggcg taagctatcg cttttggatg gacccgcggc gtattagcta gttggtgagg 240
taacggctca ccaaggcgat gatacgtagc cgaactgaga ggttgatcgg ccacattggg 300
actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg 360
caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt 420
gttggagaag aatggtcggc agagtaactg ttgtcggcgt gacggtatcc aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggat 540
ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccctcggctt 600
aaccgaggaa gcgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc 660
atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg 780
tagtccatgc cgtaaacgat gaatgctagg tgttggaggg tttccgccct tcagtgccgc 840
agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatct tttgatcacc tgagagatca ggtttcccct tcgggggcaa 1020
aatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttatg actagttgcc agcattcagt tgggcactct agtaagactg 1140
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200
ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg agaccgcgag gtcaagctaa 1260
tctcttaaag ccattctcag ttcggactgt aggctgcaac tcgcctacac gaagtcggaa 1320
tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc cgaagccggt ggcgtaaccc tttaggagcg 1440
agccgtttaa agg 1453

Claims (3)

1.一种水产动物肠道改良用的菌株，其特征在于：所述菌株为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）菌株DS31，于2014年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10073。
2.一种水产动物肠道改良用的微生物制剂，其特征在于：该微生物制剂的制备操作步骤如下：
（1）菌株扩培：取权利要求1所述的水产动物肠道改良用的菌株并将其接种至MRS培养基中，且于30-45℃、摇床150-200rpm下活化培养5-10h；活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于30-45℃、摇床150-200rpm条件下培养12-24h；
（2）菌株吸附：于步骤（1）扩培后的菌液中添加粉碎细度120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸石粉50g/L-2000g/L，并于100-150rpm下吸附1-5h；
（3）浓缩与干燥：步骤（2）吸附后的菌液于8000-10000rpm离心5-10min，弃上清得湿菌液，并加入0.1-1.0ml/L的保护剂，30-40℃搅拌干燥后，分装包装即得所述微生物制剂的产品；
其中，所述保护剂为甘油、海藻酸钠、糊精中的任一种。
3.根据权利要求2所述的一种水产动物肠道改良用的微生物制剂，其特征在于：所述MRS培养基的组分为：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、Tween-80 1.0 mL、NaAc 5.0 g、K2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O0.25 g、H2O 1000 mL，pH 6.2-6.6。
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