CN110002609A - 一种微生物水质改良剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物水质改良剂及其制备方法，其中制备方法包括以下步骤：（1）碳微球制备；（2）平板培养基制备；（3）接种；（4）平板培养；（5）摇瓶培养；（6）悬菌液制备；（7）小球状微生物水质改良剂制备。本发明采用葡萄糖、聚木糖和甘露糖作为混合碳源，制备出高质量碳微球作为菌株的载体，菌株合理固定，成活率高，有助于形成稳定的菌落。使用聚乙烯醇、海藻酸钠和二氧化硅将菌落固定，保证芽孢杆菌对COD的降解效率，提高芽孢杆菌菌落对有毒有害物质的抵抗能力，从而提高养殖水域的水质改良效果。
Description
技术领域
本发明涉及水质改良技术领域，尤其涉及一种微生物水质改良剂及其制备方法。
背景技术
随着水产养殖业的迅速发展，不合理养殖行为和日益扩大的养殖规模对水质的恶性影响越来越严重。良好的养殖水域生态环境是水产品赖以生存和繁衍的必要条件，在水产人工养殖过程中，池塘等养殖水域水质状况较差时，不仅会影响水产品正常的生长发育及繁殖的质量，甚至还会引起水产品的死亡，造成很大的经济损失，也能间接影响人类的身体健康。解决人工养殖水体水质问题已成为发展绿色、健康、无害、高效生态水产养殖业的必然要求。
微生物水质改良剂在水产养殖中的功能不同于药物，他可以进化养殖水体达到水资源可持续再利用，加强对饲料的充分吸收转化，通过微生物水质改良剂对水质的调节，改善水体藻相平衡，获得安全无污染的健康食用水产品，保护生态平衡。
现有技术中，微生物水质改良剂的产品通常是液体或固体粉末，使用时直接将其投放至水中。微生物菌株的流失严重，成活率低，难以形成稳定的菌落结构，导致水质改良效果欠佳，养殖水体质量难以改善。
发明内容
本发明提供了一种微生物水质改良剂及其制备方法，以解决微生物水质改良剂中微生物菌株难以存活，流失严重，从而导致的水质改良效果欠佳的问题。
本发明提供的微生物水质改良剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，加入三氯化铁混合，转移到反应釜中，在真空干燥箱中150-200℃下，水热反应10-15h，洗涤、过滤后，70-100℃下干燥10-15h，得到碳微球；
（2）按培养基配方配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板；
（3）将芽孢杆菌以无菌操作技术接种在平板上,涂布均匀，选用适宜三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，得到芽孢杆菌平板；
（4）芽孢杆菌平板于37℃恒温培养1-2d，得到芽孢杆菌菌种；
（5）制备胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，将步骤（1）得到的碳微球加入胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，将步骤（4）中得到的芽孢杆菌菌种接种，在130-170rpm，芽孢杆菌摇瓶于37℃恒温培养1-2d，得到芽孢杆菌菌种浊液；
（6）将步骤（5）中得到的芽孢杆菌菌种浊液，离心10-15min后弃上清，得到悬菌液；
（7）在80-100℃水浴下，将聚乙烯醇和水混和成胶体状，加入海藻酸钠和二氧化硅，搅拌均匀直至全部溶解，制得水凝胶，冷却至室温后备用，在水凝胶中，加入悬菌液混合均匀，缓慢使用注射器滴入到饱和硼酸溶液中，通过磁力搅拌不断搅拌成小球，于4-6℃下交联18-24h，后用蒸馏水洗涤小球2−3次，得到微生物水质改良剂。
可选地，步骤（7）还包括活化，所述步骤（7）：
在80-100℃水浴下，将聚乙烯醇和水混和成胶体状，加入海藻酸钠和二氧化硅，搅拌均匀直至全部溶解，制得水凝胶，冷却至室温后备用，在水凝胶中，加入悬菌液混合均匀，缓慢使用注射器滴入到饱和硼酸溶液中，通过磁力搅拌不断搅拌成小球，于4-6℃下交联18-24h，后用蒸馏水洗涤小球2−3次，将小球转移至养殖水体中进行活化培养，采用间歇培养方式，以24h为一个活化周期，周期结束后重新换入新鲜的养殖水体，直至COD去除率达到较高稳定值，得到微生物水质改良剂。
可选地，所述芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。
可选地，步骤（1）中，反应釜中还加入NaCl、MgCl2或/和CaCl2。
可选地，步骤（1）中，葡萄糖、聚木糖和甘露糖的摩尔比为：1：（0.5-1）：（0.5-1）。
可选地，步骤（1）中，葡萄糖的浓度为0.2-0.8mol/L。
本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的微生物水质改良剂。
本发明具有以下有益效果：
一方面，本发明采用葡萄糖、聚木糖和甘露糖作为混合碳源，在不添加模板剂和表面活性剂的条件下，制备出粒径为5-10μm的单分散碳微球。碳微球作为菌株的载体，菌株合理固定，成活率高，有助于形成稳定的菌落；另一方面，使用聚乙烯醇、海藻酸钠和二氧化硅将菌落固定，保证芽孢杆菌对COD的降解效率，提高芽孢杆菌菌落对有毒有害物质的抵抗能力，从而提高养殖水域的水质改良效果。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。
具体实施方式
本发明提供了一种微生物水质改良剂及其制备方法，以解决微生物水质改良剂中微生物菌株难以存活，流失严重，从而导致的水质改良效果欠佳的问题。下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的微生物水质改良剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤S001：取摩尔比为1:0.5:0.5的葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2混合，葡萄糖与FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2的摩尔比为1:0.1:0.1:0.1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。
步骤S002：按培养基配方配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板。
步骤S003：将芽孢杆菌以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀，选用适宜三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，得到芽孢杆菌平板。
步骤S004：芽孢杆菌平板于37℃恒温培养1-2d，得到芽孢杆菌菌种。
步骤S005：制备胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，将步骤S001得到的碳微球加入胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，将步骤S004中得到的芽孢杆菌菌种接种，在130-170rpm，芽孢杆菌摇瓶于37℃恒温培养1-2d，得到芽孢杆菌菌种浊液。
步骤S006：将步骤S005中得到的芽孢杆菌菌种浊液，离心10-15min后弃上清，得到悬菌液。
步骤S007：在80-100℃水浴下，将聚乙烯醇和水混和成胶体状，加入海藻酸钠和二氧化硅，搅拌均匀直至全部溶解，制得水凝胶，冷却至室温后备用，在水凝胶中，加入悬菌液混合均匀，缓慢使用注射器滴入到饱和硼酸溶液中，通过磁力搅拌不断搅拌成小球，于4-6℃下交联18-24h，后用蒸馏水洗涤小球2−3次，得到微生物水质改良剂。
上述实施例中所述的步骤S001-S007并非限定各个步骤之间的先后顺序，其中，各个步骤之间可以根据具体实施过程中的要求进行工艺流程的变化，在此不详细阐述。
为提高菌株活性，步骤S007还包括对菌株的活化，可替换为：在80-100℃水浴下，将聚乙烯醇和水混和成胶体状，加入海藻酸钠和二氧化硅，搅拌均匀直至全部溶解，制得水凝胶，冷却至室温后备用，在水凝胶中，加入悬菌液混合均匀，缓慢使用注射器滴入到饱和硼酸溶液中，通过磁力搅拌不断搅拌成小球，于4-6℃下交联18-24h，后用蒸馏水洗涤小球2−3次，将小球转移至养殖水体中进行活化培养，采用间歇培养方式，以24h为一个活化周期，周期结束后重新换入新鲜的养殖水体，直至COD去除率达到较高稳定值，得到微生物水质改良剂。
其中，对于制备微生物水质改良剂的具体实施方式可以参看以下几个实施例：
实施例1
本实施例1提供的一种微生物水质改良剂，其制备方法包括以下步骤：
步骤S101：取摩尔比为1:0.5:0.5的葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2混合，葡萄糖与FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2的摩尔比为1:0.1:0.1:0.1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。
步骤S102：按培养基配方配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板。
步骤S103：将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀，选用适宜三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，得到芽孢杆菌平板。
步骤S104：芽孢杆菌平板于37℃恒温培养2d，得到芽孢杆菌菌种。
步骤S105：制备胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，将步骤S101得到的碳微球加入胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，将步骤S104中得到的芽孢杆菌菌种接种，在150rpm，芽孢杆菌摇瓶于37℃恒温培养2d，得到芽孢杆菌菌种浊液。
步骤S106：将步骤S105中得到的芽孢杆菌菌种浊液，离心10min后弃上清，得到悬菌液，每毫升悬菌液中的菌总量为5×108～7×108个。
步骤S107：在100℃水浴下，将聚乙烯醇和水混和成胶体状，加入海藻酸钠和二氧化硅，搅拌均匀直至全部溶解，制得水凝胶，冷却至室温后备用，在水凝胶中，加入悬菌液混合均匀，缓慢使用注射器滴入到饱和硼酸溶液中，通过磁力搅拌不断搅拌成小球，于5℃下交联20h，后用蒸馏水洗涤小球3次，将小球转移至养殖水体中进行活化培养，采用间歇培养方式，以24h为一个活化周期，周期结束后重新换入新鲜的养殖水体，直至COD去除率达到较高稳定值，得到微生物水质改良剂。
实施例2
本实施例2提供的另一种微生物水质改良剂，其制备方法包括以下步骤：
步骤S201：取摩尔比为1:0.5:0.5的葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2混合，葡萄糖与FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2的摩尔比为1:0.1:0.1:0.1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。
步骤S202：按培养基配方配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板。
步骤S203：将枯草芽孢杆菌以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀，选用适宜三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，得到芽孢杆菌平板。
步骤S204：芽孢杆菌平板于37℃恒温培养2d，得到芽孢杆菌菌种。
步骤S205：制备胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，将步骤S201得到的碳微球加入胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，将步骤S204中得到的芽孢杆菌菌种接种，在150rpm，芽孢杆菌摇瓶于37℃恒温培养2d，得到芽孢杆菌菌种浊液。
步骤S206：将步骤S205中得到的芽孢杆菌菌种浊液，离心10min后弃上清，得到悬菌液，每毫升悬菌液中的菌总量为5×108～7×108个。
步骤S207：在100℃水浴下，将聚乙烯醇和水混和成胶体状，加入海藻酸钠和二氧化硅，搅拌均匀直至全部溶解，制得水凝胶，冷却至室温后备用，在水凝胶中，加入悬菌液混合均匀，缓慢使用注射器滴入到饱和硼酸溶液中，通过磁力搅拌不断搅拌成小球，于5℃下交联20h，后用蒸馏水洗涤小球3次，将小球转移至养殖水体中进行活化培养，采用间歇培养方式，以24h为一个活化周期，周期结束后重新换入新鲜的养殖水体，直至COD去除率达到较高稳定值，得到微生物水质改良剂。
实施例3-5
实施例3-5提供的微生物水质改良剂，制备方法与实施例2类似，区别在于：
实施例3的步骤S303：将巨大芽孢杆菌以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀，选用适宜三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，得到芽孢杆菌平板。
实施例4的步骤S403：将短小芽孢杆菌以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀，选用适宜三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，得到芽孢杆菌平板。
实施例5的步骤S503：将地衣芽孢杆菌以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀，选用适宜三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，得到芽孢杆菌平板。
对比例1-2
对比例1-2提供的微生物水质改良剂，制备方法与实施例1类似，区别在于：
对比例1的步骤S101’：取葡萄糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2混合，葡萄糖与FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2的摩尔比为1:0.1:0.1:0.1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。对比例1的步骤S201’：取葡萄糖和聚木糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2混合，葡萄糖与FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2的摩尔比为1:0.1:0.1:0.1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。
对比例3
对比例3提供的一种微生物水质改良剂，其制备方法包括以下步骤：
步骤S301’：取摩尔比为1:0.5:0.5的葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，使葡萄糖的浓度为0.5mol/L，再加入FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2混合，葡萄糖与FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2的摩尔比为1:0.1:0.1:0.1:0.1。将混合溶液转移到反应釜中，在真空干燥箱中180℃下，水热反应12h，洗涤、过滤后，80℃下干燥12h，得到碳微球。
步骤S302’：按培养基配方配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板。
步骤S303’：将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀，选用适宜三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，得到芽孢杆菌平板。
步骤S304’：芽孢杆菌平板于37℃恒温培养2d，得到芽孢杆菌菌种。
步骤S305’：制备胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，将步骤S301’得到的碳微球加入胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，将步骤S304’中得到的芽孢杆菌菌种接种，在150rpm，芽孢杆菌摇瓶于37℃恒温培养2d，得到芽孢杆菌菌种浊液。
步骤S306’：将步骤S305’中得到的芽孢杆菌菌种浊液，离心10min后弃上清，得到悬菌液，每毫升悬菌液中的菌总量为5×108～7×108个。
步骤S307’：将悬菌液转移至养殖水体中进行活化培养，采用间歇培养方式，以24h为一个活化周期，周期结束后重新换入新鲜的养殖水体，直至COD去除率达到较高稳定值，得到微生物水质改良剂。
通过对比实施例1和对比例1-2中制备的碳微球的扫描电镜图，发现实施例1得到的碳微球不仅形状规整，分散均匀，而且粒径处于5-10μm的碳微球的数量最多。对比例1中碳微球的形状不太规整，既有圆球状，椭圆球状，也有哑铃状，这说明单一碳源制备的碳微球出现较多黏连，分散性较差。由于对比例1得到的碳微球的形状各异，导致粒径难以估算，但是可以肯定的是尺寸大于实施例1得到的碳微球。对比例2中得到的碳微球也存在形状上不够规整圆润，多为多面体状，但是分散性与实施例1相比差距不大，粒径处于15-20μm的数量最多。通过对以上三种碳微球的比表面积的测定，发现实施例1得到的碳微球的比表面积最大，说明其吸附能力最强。因此，三种碳源联用，加上FeCl3、NaCl、MgCl2、CaCl2的配合，得到的碳微球最适合作为菌株的载体。
除此之外，还做了不加NaCl、MgCl2、CaCl2，加入两种或单独一种的实验，发现制备的碳微球分散性相对较差，因此，NaCl、MgCl2、CaCl2全部加入制备碳微球，是本发明提供的优选方案。
为证明本发明提供的微生物水质改良剂在水产养殖方面的作用。选取8个相同的四大家鱼养殖池进行试验。其中，1-5号养殖池为试验池，对应施用实施例1-5提供的水质改良剂，6-8号为对比池，对应施用对比例1-3提供的水质改良剂。施用标准为以对应步骤6得到的悬菌液计算，每次每亩施用0.5L悬菌液（实施例1-5对应为使用0.5L悬菌液制备的小球）。每半个月施用一次。
上述试验发现，1-8号池中养殖水体的COD均有降低，但是降低程度不同。实施例1和对比例1-2对比发现，COD降低程度由高到低依次为实施例1＞对比例2＞对比例1。这说明碳微球的质量对最终制备的微生物水质改良剂有影响，只有当碳微球形状规整，尺寸较小，分散度高时，它的比表面积才适用于菌株的吸附，菌株合理固定，成活率高，有助于形成稳定的菌落，进而提高养殖水域的水质改良效果。实施例1-5的对比则发现混合菌种枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的水质处理效果最好，优选混合菌种用于微生物水质改良剂的制备。1-8号池中COD的降低程度最低的为8号池，相应地，将实施例1和对比例3对比发现，实施例1使用聚乙烯醇、海藻酸钠和二氧化硅将菌落固定，保证芽孢杆菌对COD的降解效率，提高芽孢杆菌菌落对有毒有害物质的抵抗能力，从而提高养殖水域的水质改良效果。
以上所述的本发明实施方式并不构成对本发明保护范围的限定。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
Claims (7)
1.一种微生物水质改良剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将葡萄糖、聚木糖和甘露糖，加入去离子水溶解，加入三氯化铁混合，转移到反应釜中，在真空干燥箱中150-200℃下，水热反应10-15h，洗涤、过滤后，70-100℃下干燥10-15h，得到碳微球；
（2）按培养基配方配置牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基100mL，灭菌后分别倒平板；
（3）将芽孢杆菌以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀，选用适宜三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，得到芽孢杆菌平板；
（4）芽孢杆菌平板于37℃恒温培养1-2d，得到芽孢杆菌菌种；
（5）制备胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，将步骤（1）得到的碳微球加入胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，将步骤（4）中得到的芽孢杆菌菌种接种，在130-170rpm，芽孢杆菌摇瓶于37℃恒温培养1-2d，得到芽孢杆菌菌种浊液；
（6）将步骤（5）中得到的芽孢杆菌菌种浊液，离心10-15min后弃上清，得到悬菌液；
（7）在80-100℃水浴下，将聚乙烯醇和水混和成胶体状，加入海藻酸钠和二氧化硅，搅拌均匀直至全部溶解，制得水凝胶，冷却至室温后备用，在水凝胶中，加入悬菌液混合均匀，缓慢使用注射器滴入到饱和硼酸溶液中，通过磁力搅拌不断搅拌成小球，于4-6℃下交联18-24h，后用蒸馏水洗涤小球2−3次，得到微生物水质改良剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（7）还包括活化，所述步骤（7）：
在80-100℃水浴下，将聚乙烯醇和水混和成胶体状，加入海藻酸钠和二氧化硅，搅拌均匀直至全部溶解，制得水凝胶，冷却至室温后备用，在水凝胶中，加入悬菌液混合均匀，缓慢使用注射器滴入到饱和硼酸溶液中，通过磁力搅拌不断搅拌成小球，于4-6℃下交联18-24h，后用蒸馏水洗涤小球2−3次，将小球转移至养殖水体中进行活化培养，采用间歇培养方式，以24h为一个活化周期，周期结束后重新换入新鲜的养殖水体，直至COD去除率达到较高稳定值，得到微生物水质改良剂。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，反应釜中还加入NaCl、MgCl2或/和CaCl2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，葡萄糖、聚木糖和甘露糖的摩尔比为：1：（0.5-1）：（0.5-1）。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，葡萄糖的浓度为0.2-0.8mol/L。
7.一种由权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的微生物水质改良剂。
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