CN104587528A - 人心脏瓣膜组织脱细胞基质及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备及其应用。所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：将人的心脏瓣膜组织切成厚度为50-100μm的薄片；将所得的薄片进行脱细胞处理，得到心脏瓣膜脱细胞基质，冷冻干燥、消毒备用。本发明将得到的人组织先切成薄片后再进行脱细胞操作，在保证脱细胞彻底性的同时极大的缩短了脱细胞时间，从而节省了大量的时间，确保今后商品化的可能。本发明中还发现了人心脏瓣膜脱细胞基质在体外细胞培养中具有促进干细胞黏附，增殖及心肌方向分化的作用，移植到心梗心脏表面可以有效改善心功能，因此可以作为新的体外细胞培养介质及移植物用于心脏病干细胞治疗。

Description

人心脏瓣膜组织脱细胞基质及其制备和应用

技术领域

本发明涉及心脏组织脱细胞基质的制备及其在细胞培养及组织工程的基础研究及应用，属于生物医药，组织工程学，细胞生物学，干细胞生物学及心脏大血管外科领域。

背景技术

心血管疾病是一个全球性的健康问题。世界上大约三分之一的人是死于心血管疾病。心肌梗死及充血性心力衰竭是心血管疾病导致死亡的主要原因，而心肌梗死又是引起充血性心力衰竭的重要原因。对于心肌梗死的治疗目前主要是恢复缺血区周围心肌组织的血流量，一般采取药物护心、冠状动脉支架植入和实施搭桥手术等传统方法，但这些治疗措施只能保护残存的心肌，对已梗死的心肌无法修复。而心脏移植的供体不足和强烈的免疫反应以及高昂的治疗费用，故难以在临床上大范围应用。最近研究显示应用骨髓干细胞移植可改善心肌修复，具有传统治疗方法所无可比拟的优越性，为治疗心肌梗死提供了一种全新治疗前景。

骨髓干细胞在心肌再生及心脏损伤修复中已有成功的报道。C-kit作为心脏干细胞标记物，已有报道显示小鼠c-kit阳性骨髓干细胞移植入梗死心肌周边区后发现在梗死区重新产生新的心肌细胞，梗死区及周边毛细血管密度显著增加。这一重要发现提供了骨髓干细胞能分化为心肌细胞和血管的初步实验依据。

目前利用骨髓干细胞修复心脏损伤的研究中主要采用的是细胞移植的方法，将骨髓细胞直接移植到心梗区中。心肌细胞作为分化成熟的细胞自身的损伤后很难再生，而仅仅通过干细胞原位注入治疗的效果有限。而心肌细胞是存在于大量外基质(ECM)中的，其主要成分是心肌间隙中成纤维母细胞产生和分泌的胶原纤维，对维持心脏正常的形态和功能起重要作用，心肌胶原纤维相互交织，形成多层次、多方位、复杂的三维空间结构，在支持、保护心肌细胞、协调心肌收缩、舒张等方面发挥重要作用。因此，给骨髓细胞提供一个心脏的基质环境可以更有助于其对心肌缺损的修复。

脱细胞材料由于其成分最接近与相对应的组织的成分，所以其应用越来越广泛。然而因为细胞不易脱净，应用较多的都是膜状的组织的脱细胞基质材料，如羊膜，小肠粘膜下层(SIS)等。而心脏这样的实质性器官并未见脱细胞基质研究。然而羊膜，真皮，小肠粘膜下层这些膜状组织，其胶原纤维层次及结构与心脏组织相差甚远，并不能提供相似于心脏的基质环境。

本发明创立了薄片状的脱细胞方法，可以解决传统的实质性组织脱细胞方法耗时较长，很难将中间部分的细胞脱尽的问题，切成膜片后由于膜片厚度接近于细胞的直径，故组织中的细胞大部分能够暴露在脱细胞溶液中，较容易脱尽细胞，耗时可以大大缩短。再者，膜片形式的构建细胞也能解决细胞难以进入材料的问题，使细胞更好的材料复合。因此本发明提出：将人心脏瓣膜切成薄片的形式，进行脱细胞处理，切成膜片的组织较易脱尽细胞。将脱细胞基质及骨髓c-kit阳性干细胞复合制成复合补片，利用脱细胞基质提供生物信号，提高细胞增殖、黏附、分泌等生物学特性。细胞，并用其修复心肌损伤，心肌损伤修复改善明显。

发明内容

本发明的目的是提供一种人心脏瓣膜组织脱细胞基质及其制备和用途。

为了达到上述目的，本发明提供了一种人心脏瓣膜组织脱细胞基质，其特征在于，其制备方法包括：将人的心脏瓣膜组织切成厚度为50-100μm的薄片；将所得的薄片进行脱细胞处理，得到心脏瓣膜脱细胞基质，冷冻干燥、消毒备用。

优选地，所述的心脏瓣膜组织来自瓣膜置换术患者的废弃瓣膜组织。

优选地，所述的脱细胞处理包括：将所得的薄片加入离心管中，加入质量分数为0.5～1.5％的十二烷基硫酸钠(SDS)，放入温度为36～38℃、转速为150～200r/min的摇床中消化12～24h，洗涤，得到消化后的人心脏瓣膜组织，加入150～250mg/L DNA酶I溶液，反应2～6小时，洗涤，得到心脏瓣膜脱细胞基质。

本发明还提供了上述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法。

本发明还提供了上述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质作为组织工程支架在制备组织工程移植物中的应用。

优选地，所述的组织工程移植物为用于修复缺血性心肌损伤、改善心脏功能、改善心力衰竭或其他原因造成的心肌重构的组织工程移植物。

本发明还提供了上述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质作为细胞体外培养介质提供促进细胞黏附、存活、增殖和心脏方向分化的微环境及细胞外基质架构中的应用。

本发明还提供了一种心脏补片(或称心脏移植物或心肌补片)，其特征在于，包含种子细胞以及上述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质。

优选地，所述的种子细胞为骨髓来源的c-kit+细胞骨髓单个核细胞、间充质干细胞、心肌去分化细胞、心肌干细胞及胚胎干细胞来源的细胞(如人来源的干细胞)中的至少一种。

本发明还提供了上述的心脏补片的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：将种子细胞种于上述人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法所制备的人心脏瓣膜组织脱细胞基质上，培养得到心肌补片。

优选地，所述的种子细胞为c-kit阳性细胞。

更优选地，所述的c-kit阳性细胞为小鼠骨髓来源的c-kit阳性的细胞，其制备方法包括：取心梗3天后的小鼠的胫骨和肱骨，用Hanks平衡盐溶液冲出骨髓，分离出骨髓单个核细胞，磁珠分离得到c-kit阳性细胞。

优选地，所述的培养步骤包括用含有10％～25％的FBS的IMDM培养基在含3～8％CO₂的36～38℃培养箱培养5～15天。

更优选地，所述的培养过程中每隔2～3天换半量换培养液。

本发明验证了此心脏补片对心功能的修复状况以及心脏组织脱细胞基质作为细胞体外培养介质提供促进细胞黏附，存活，增殖，心脏方向分化的微环境及细胞外基质架构。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明将得到的人组织先切成薄片后再进行脱细胞操作，在保证脱细胞彻底性的同时极大的缩短了脱细胞时间，从而节省了大量的时间，确保今后商品化的可能。人来源心脏组织脱细胞基质体外具有促进细胞黏附，增殖及其向心肌方向分化的能力，与合成材料相比，更能充分模拟人心肌细胞生长微环境，具有更适宜的生长及诱导环境。因此可以作为细胞体外培养介质提供促进细胞黏附，存活，增殖，心脏方向分化的微环境及细胞外基质架构。

2、c-kit阳性细胞作为骨髓中一群干细胞已经被证实可向心肌，平滑肌，内皮细胞方向分化，在心梗修复中发挥重大作用。C-kit阳性细胞在体外无法长期存活，增殖能力差，对于细胞治疗来说无法达到足够的细胞数量。本发明中心脏组织脱细胞基质在体外可以促进c-kit阳性细胞大量增殖，从而为细胞治疗创造可以获得足够种子细胞的方法。本发明首次将骨髓来源的c-kit阳性细胞种植于本发明中提到的人瓣膜脱细胞基质上，并在体外证实脱细胞基质可促进其向心肌方向发生分化。该发明首次将上述组织工程化获得基于人瓣膜脱细胞基质的心肌移植物移植到心梗区可明显防止心肌重塑和改善心功能。

3、本发明中还发现了人心脏瓣膜脱细胞基质在体外细胞培养中具有促进干细胞黏附，增殖及心肌方向分化的作用，移植到心梗心脏表面可以有效改善心功能，因此可以作为新的体外细胞培养介质及移植物用于心脏病干细胞治疗。

附图说明

图1A为来自瓣膜置换术患者的废弃人心脏瓣膜组织照片；

图1B为50um和100um厚的薄片制成的人心脏瓣膜脱细胞基质的电镜照片；

图2为人心脏瓣膜脱细胞基质材料电镜图。其中，A，C为厚度为50μm薄片制成的心脏瓣膜脱细胞基质脱细胞前后的DAPI染色图；B，D为厚度为50μm薄片制成的心脏瓣膜脱细胞基质脱细胞前后的HE染色图。E，G为厚度为100μm薄片制成的心脏瓣膜脱细胞基质脱细胞前后的DAPI染色图。F，H为厚度为100μm薄片制成的心脏瓣膜脱细胞基质脱细胞前后的HE染色图。标尺50μm。

图3为扫描电镜下人瓣膜组织脱细胞后的显微结构图。A：800倍观察；B：8000倍观察。

图4为人心脏瓣膜组织脱细胞基质与细胞的粘附图。A：人心脏瓣膜组织脱细胞基质未种植细胞B：人心脏瓣膜组织脱细胞基质与c-kit阳性细胞粘附。标尺20μm。

图5为人心脏瓣膜组织脱细胞基质体外促进细胞增殖图。A：c-kit阳性细胞普通培养7天后免疫荧光染色增殖标志Ki67；B：c-kit阳性细胞在心脏瓣膜脱细胞基质支架上培养7天后免疫荧光染色Ki67。C：c-kit阳性细胞在人心脏瓣膜组织脱细胞基质及直接在培养板中培养的增殖曲线(hDHVS，人心脏瓣膜脱细胞基质)。

图6为人心脏组织脱细胞基质支架可促进c-kit阳性细胞心肌方向分化图。A：c-kit阳性细胞培养30天后免疫荧光染色心肌分化标志Gata4；B：c-kit阳性细胞在心脏瓣膜脱细胞基质支架上培养30天后免疫荧光染色心肌分化标志Gata4；标尺20μm。C：在细胞培养的第10、20、30天分别收集细胞，提取RNA，行PCR。1：c-kit阳性细胞组；2：人心脏组织脱细胞基质加c-kit阳性细胞组，β-actin：内参，a-SA(alpha-sarcomeric actin)，GATA4，心肌分化标志。

图7A为基于上述人心脏瓣膜脱细胞基质的心脏补片移植后4周，心梗未治疗组、人心脏瓣膜脱细胞基质组加c-kit阳性细胞治疗组及单纯脱细胞基质治疗组典型心脏超声图。B为超声检测的EF(射血分数)统计图(hDHVS，人心脏瓣膜脱细胞基质)*代表P＜0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例：

应用人心脏瓣膜脱细胞基质构建心肌补片修复梗死心肌：

1、人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法：

取来自瓣膜置换术患者废弃的人心脏瓣膜组织(如图1A所示)放入包埋剂O.C.T(Sakura Finetek，4583，日本)中包埋，-20℃冰冻后，用冰冻切片机(莱卡)切成厚度为50μm薄片和厚度为100μm的薄片。将所得的薄片进行脱细胞处理，具体为：将所得的薄片转移入50ml离心管，加入质量分数为1％的SDS(Sigma，L5750，美国，配制方法为取1g SDS，溶于99g双蒸水中高压灭菌备用)，放入温度为37℃、转速为180r/min的摇床中消化12h。双蒸水洗涤数次，得到消化后的人心脏瓣膜组织，加入200mg/L DNase I(Roche，14399900，德国)溶液50ml，反应4小时去除核酸成分，双蒸水洗涤数次至没有泡沫，得到心脏瓣膜脱细胞基质，转入冷冻真空干燥机-40℃冷冻干燥12小时，75％酒精消毒2小时。紫外照射灭菌6小时备用。如图1B所示，为50um和100um厚的薄片制成的心脏瓣膜脱细胞基质的电镜照片。

将上述的厚度为50μm和100μm薄片制成的心脏瓣膜脱细胞基质分别进行HE及DAPI染色，如图2所示，经HE及DAPI染色后示脱细胞后无细胞残留。如图3所示，扫描电镜结果显示脱细胞基质无细胞残留，高倍镜示脱细胞基质存在网格状结构，此结构的存在可能与细胞的粘附有关。

2、分离c-kit阳性细胞：

取6-8周龄的C57BL/6小鼠结扎左冠状动脉前降支制备心梗模型。取心梗3天后的小鼠，脱颈处死小鼠后，分离股、胫骨，用Hanks平衡盐溶液(Biowest，L0606，法国)冲出骨髓，在15ml离心管中加入3ml淋巴细胞分离液(达科为，DKW33-R0100，中国)，将骨髓悬液平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。室温，水平转子700-800g(2000-2500rpm)离心20-30分钟。离心结束后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆层与分离液层之间是一层薄较致密的白膜，即：单个核细胞层。小心吸取白膜层到另一离心管中。用PBS等量稀释，吸管吹打混匀。室温，水平转子1000rpm，离心5min，弃上清。加入3ml staning buffer(1％BSA和0.02％EDTA(sigma，RNBD0725，美国)等体积混合制得)重悬，室温，水平转子1000rpm，离心5min，弃上清。加入3ml 1％BSA(1gBSA(sigma，SLBJ9162ZV，美国)溶于99g双蒸水中，0.22阳滤网过滤)重悬封闭，室温，水平转子1000rpm，离心5min，弃上清。加入80μl staningbuffer重悬，加入20μl anti-mouse-c-kit磁珠(美天旎)于细胞悬液后，吹打混匀，4℃，旋转避光孵育，15分钟。孵育后，添加400μl Staining buffer，终体积为500μl；将分离柱置于磁场中，用0.5ml Staining buffer使其流下，分离柱平衡；次数为2-3次；过柱收集阴性细胞：将细胞悬液装入平衡后的的分离柱上，进行过柱；收集c-kit阴性细胞；用0.5ml的Staining buffer重复两次；收集到1.5ml的阴性细胞悬液。(根据细胞量可重复三次，收集2ml悬液)。收集阳性细胞：将分离柱与磁铁分开后，添加1ml staining buffer，并轻轻按下柱塞避免产生气泡，收集c-kit阳性细胞；(自然流下亦可)。将收集到的细胞混匀，计数板进行计数。

3、心脏补片及其制备方法：

将步骤2分离得到的c-kit阳性细胞以3×10⁵个/cm²的密度种于步骤1所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法所制备的人心脏瓣膜组织脱细胞基质上，用含有20％的FBS(Biowest，S1810，法国)的IMDM培养基(Lot.12440-053，Gibco，美国)在含5％CO₂的37℃培养箱培养10天，每隔两天半量换培养液(即隔两天倒出一半培养液，并补充相同体积的新鲜培养液)，培养20天，即得到心肌补片。如图4所示，细胞与脱细胞基质粘附良好。

4、检测心脏瓣膜脱细胞基质对体外培养细胞的影响：

取步骤2分离得到的c-kit阳性细胞，先以密度3×10⁵个/cm²种植到心脏瓣膜组织脱细胞基质上，再置于培养板中进行培养，同时取等量的c-kit阳性细胞直接置于培养板中进行培养，培养基以及培养条件与步骤3相同，在第1、3、5、7、10、15天按20μl/100μl培养基分别加入MTT(promega，G5421，美国)，在含5％CO₂的37℃培养箱孵育4小时，监测吸光光度值。如图5C所示，MTT增殖曲线结果示脱细胞基质可促进细胞增殖。

在培养第7天，取培养的c-kit阳性细胞(有和没有脱细胞基质)，用多聚甲醛固定15分钟，0.5％Triton透膜15分钟，PBS微振荡洗涤3次，3分钟/次。用5％驴血清(Jakson，109558，美国)封闭室温1小时；按1∶200用1％BSA稀释免疫荧光染色增殖标志ki67(BD，556003，美国)；4℃冰箱孵育过夜；孵育后用PBS微振荡洗涤3次，5分钟/次；用PBS稀释二抗donkeyanti-mouseAlexa 488(Invitrogen，106829，USA)，比例为1∶500；室温孵育1小时。孵育后用PBS微振荡洗涤3次，5分钟/次；DAPI染色30秒，PBS洗涤一次，5分钟/次。荧光显微镜观察。

结果如图5A和图5B所示，与单纯细胞(图5A)相比细胞在脱细胞基质上(图5B)增殖活跃。

在培养第30天，取培养的c-kit阳性细胞(有和没有脱细胞基质)，多聚甲醛固定15分钟，0.5％Triton透膜15分钟，PBS微振荡洗涤3次，3分钟/次。用5％驴血清(Jakson，109558，美国)封闭室温1小时；按1∶200用1％BSA稀释免疫荧光染色分化标志GATA4(Santa，SC-1237，美国)；4℃冰箱孵育过夜；孵育后用PBS微振荡洗涤3次，5分钟/次；用PBS稀释二抗Donkeyanti-mouse 555(Invitrogen，1249013，USA)，比例为1∶500；室温孵育1小时。孵育后用PBS微振荡洗涤3次，5分钟/次；DAPI染色30秒，PBS洗涤一次，5分钟/次。荧光显微镜观察。结果如图6A和6B所示，种植于脱细胞基质上的细胞向心肌方向分化，而单纯细胞培养组分化很少。

在细胞培养的第10、20、30天分别收集c-kit阳性细胞组和人心脏瓣膜组织脱细胞基质加c-kit阳性细胞组细胞，加入1ml Trizol，室温放置5分钟；每1ml裂解液加0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟；于4℃12，000rpm/min离心10分钟，样品分成三层：下层为有机相，中间层和上层为无色的水相，RNA存在于水相中；将无色水相转移至新的EP管中，按每1ml Trizol加入500ul预冷的异丙醇，轻轻震荡混匀，室温放置10分钟，然后4℃10000rpm离心10分钟。离心后可见RNA呈白色絮状，沉淀于管底。弃上清液，用75％乙醇1ml洗涤RNA沉淀，漩涡震荡混匀；4℃7500rpm离心5分钟；弃乙醇，在空气中干燥5分钟，然后用DEPC水30ul溶解；测定RNA浓度和纯度：使用微量紫外/可见光分光光度计NanoDrop 2000(Termo Scientific NanoDrop 2000c)；取1-2ulRNA，经紫外线扫描，吸收峰位于波长260nm处；RNA纯度为OD260/280＝1.8～2。

RT(反转录)(cDNA合成)：1.取高压好的200ulEP管，加入以下试剂：总RNA 1ug加DEPC水至9.5ul，离心混匀，70℃变性5分钟，然后冰上冷却，然后往此EP管中加入以下试剂：25mMMgCl₂4μl；Reverse Transcription 20×buffer2μl；10mMdNTP Mixture 2μl；Recombinanr RecombinantRibonucleaseInhibitor 0.5μl；AMV Reverse Transcriptase(High Conc.)1μl；Oligo(dT)15Primer 1μl；以上总体积共20ul，离心混匀，然后42℃孵育15分钟；然后95℃孵育5分钟，结束后冰上冷却。按如下体系配制20μl PCR反应体系：10μM前引物：1μl，10μM后引物：1μl，Green Master Mix(Promega，M7122，美国)：10μl，cDNA；1μl。无核酶水7μl。初始变性：95℃3分钟，后续的变性步骤30秒。退火温度为55℃，时间为30秒，延伸温度为72℃，时间为30秒，循环数为30个，终延伸温度为72℃，时间为5分钟，4℃冷却。所用引物全部由生工生物有限公司合成。具体序列如下：

配制琼脂糖凝胶，称取琼脂糖0.6g，倒入烧瓶中，加入30mlTAE(20ml50×TAE加双蒸水980ml配制)，微波炉中高火3分钟，待冷却至70℃左右，加入约3μlGengreen(Genview，GG1301，美国)充分混匀，倒入胶槽内，***梳子。待大约20min后，轻轻拔掉梳子。将凝胶放入电泳槽中，每孔加入5μlPCR产物，加样后的凝胶板立即通电进行电泳电压设置为100V，电泳时间为25分钟。电泳完毕，取出凝胶，放入ChemiDoc MP凝胶成像***(Bio-Rad，美国)，观察拍照图像。所得图像如图6C所示，与单纯细胞相比，细胞在脱细胞基质上表达心肌分化的标志Gata4，αSA更高。

5、心肌补片对心功能的修复状况：

取6-8周龄的C57BL/6小鼠，异氟烷麻醉，固定，脱毛，分离肌肉挤出心脏，结扎左冠状动脉前降支制作心梗模型，将未种植c-kit阳性细胞的单纯人心脏瓣膜组织脱细胞基质以及步骤3制得的心脏补片分别移植到心梗区域周边，关闭胸腔。移植4周后，小动物心脏超声监测小鼠心功能状况。

如图7A和7B所示，心梗组小鼠未移植人心脏瓣膜组织脱细胞基质或心脏补片，其心功能较差，移植未种植c-kit阳性细胞的单纯人心脏瓣膜组织脱细胞基质的小鼠(脱细胞基质组)可改善心功能，移植心脏补片的小鼠(脱细胞基质复合C-kit阳性细胞组)可明显改善心功能。

Claims (10)

1.一种人心脏瓣膜组织脱细胞基质，其特征在于，其制备方法包括：将人的心脏瓣膜组织切成厚度为50-100μm的薄片；将所得的薄片进行脱细胞处理，得到心脏瓣膜脱细胞基质，冷冻干燥、消毒备用。

2.如权利要求1所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质，其特征在于，所述的脱细胞处理包括：将所得的薄片加入离心管中，加入质量分数为0.5～1.5％的十二烷基硫酸钠，放入温度为36～38℃、转速为150～200r/min的摇床中消化12～24h，洗涤，得到消化后的人心脏瓣膜组织，加入150～250mg/L DNA酶I溶液，反应2～6小时，洗涤，得到心脏瓣膜脱细胞基质。

3.权利要求1或2所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法。

4.权利要求1或2所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质作为组织工程支架在制备组织工程移植物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的组织工程移植物为用于修复缺血性心肌损伤、改善心脏功能、改善心力衰竭或其他原因造成的心肌重构的组织工程移植物。

6.权利要求1或2所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质作为细胞体外培养介质提供促进细胞黏附、存活、增殖和心脏方向分化的微环境及细胞外基质架构中的应用。

7.一种心脏补片，其特征在于，包含种子细胞以及权利要求1或2所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质。

8.如权利要求7所述的心脏补片，其特征在于，所述的种子细胞为骨髓来源的c-kit阳性细胞、骨髓单个核细胞、间充质干细胞、心肌去分化细胞、心肌干细胞及胚胎干细胞来源的细胞中的至少一种。

9.权利要求7或8所述的心脏补片的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：将种子细胞种于上述人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法所制备的人心脏瓣膜组织脱细胞基质上，培养得到心肌补片。

10.如权利要求9所述的心脏补片的制备方法，其特征在于，所述的c-kit阳性细胞为小鼠骨髓来源的c-kit阳性的细胞，其制备方法包括：取心梗3天后的小鼠的胫骨和肱骨，用Hanks平衡盐溶液冲出骨髓，分离出骨髓单个核细胞，磁珠分选得到c-kit阳性细胞。