CN101711890A - 一种用于研究胚胎干细胞发育分化的细胞外基质凝胶模型 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于研究胚胎干细胞发育分化的细胞外基质凝胶模型。本发明属组织工程与再生医学研究领域，主要用来解决体外进行胚胎干细胞分化发育研究没有理想模型这一问题。我们采用细胞外基质凝胶作为胚胎干细胞分化发育的体外三维模型，将胚胎干细胞以不同细胞密度接种到三维模型中，观察胚胎干细胞自发分化形成拟胚体的现象，以及拟胚体分化为不同谱系细胞的规律。并通过调控胚胎干细胞生长的微环境，以细胞外基质凝胶为主体进行胚胎干细胞的定向分化与发育研究，进而揭示胚胎干细胞体外分化发育的内在规律与机制，并寻求胚胎干细胞向重要生命器官处于终末分化阶段的功能细胞定向分化新方法。这一发明将为探索胚胎干细胞发育机制提供了新的技术方法。

Description

一种用于研究胚胎干细胞发育分化的细胞外基质凝胶模型

技术领域

本发明属组织工程与再生医学研究领域，涉及到体外制备胚胎干细胞三维分化发育模型，胚胎干细胞培养与胚胎干细胞体外分化发育等一系列关键技术。这种方法能在体外构建细胞外基质凝胶三维支架，将胚胎干细胞与此支架复合使之作为细胞分化发育的研究模型，并通过调控胚胎干细胞生长发育的微环境，在细胞外基质凝胶三维模型中进行胚胎干细胞分化与发育研究，进而揭示胚胎干细胞体外分化发育的内在规律与机制，并寻求胚胎干细胞向重要生命器官处于终末分化阶段的功能细胞定向分化新方法。

发明背景

胚胎干细胞是近年来科学界研究的热点，其多向发育的潜能在组织工程研究领域具有重大的价值和应用前景。但是，目前对胚胎干细胞的研究尚属初步，尽管已经积累了大量的胚胎干细胞体外研究方法和技术，但仍缺乏诱导形成组织器官目的细胞的分化发育模型和有效手段，现有的体外研究体系与在体发育环境存在很大差异，无法准确可靠的再现胚胎干细胞早期分化发育情况，从而限制了胚胎干细胞的应用。考虑到上述困难，发明一种有效的胚胎干细胞体外分化发育模型显得至关重要。

总结现有研究，胚胎干细胞的分化发育模型主要包括传统的二维悬浮、悬滴、半固体甲基纤维素培养，以及三维多孔聚合物支架及凝胶类支架等分化发育模型。相较于传统的二维分化发育体系，三维模型为进一步研究胚胎干细胞分化发育提供了有效发育空间，为胚胎干细胞体外分化发育研究扩展了空间，受到研究者的广泛关注，并取得了一系列进展。但是现有三维模型研究多开始于胚胎干细胞已经分化形成的拟胚体，主要手段是将已经分化发育成熟的拟胚体接种在三维支架材料中，研究其分化发育现象，而忽视了从胚胎干细胞到形成拟胚体这个重要发育过程的研究，将胚胎干细胞分化发育的过程人为的割裂开来。然而，诸多的研究表明，胚胎干细胞形成含有囊胚腔样结构的成熟拟胚体与后期分化发育效率密切相关，是一系列连续次第发生的早期发育事件，此过程中不断形成的高质高量的拟胚体是后期高效分化发育的保障。由此，发明者提出了发明一种新型的三维分化发育模型，用于体外研究胚胎干细胞形成拟胚体的情况并进行后期分化发育研究。

发明者提出的细胞外基质凝胶三维分化发育模型是以天然的I型胶原凝胶和Matrigel胶为主要构成，具有与在体生长发育环境相似的特点，为胚胎干细胞生长发育提控良好的三维空间，其良好的流动性和通透性保证了胚胎干细胞从单细胞黏附聚集到形成拟胚体，在一定可调的空间位移中，能够始终为细胞的黏附聚集以及进一步发育提供支架支持，并且具有携带生长因子或诱导因子的能力，为用于进一步定向研究胚胎干细胞分化发育。

从以上的研究出发，我们将细胞外基质凝胶作为研究胚胎干细胞分化发育的研究模型，研究胚胎干细胞形成拟胚体，调控拟胚体分化，将有望解决胚胎干细胞分化中的关键技术问题，从而在胚胎干细胞分化发育上取得中大突破。这一研究成果对基于胚胎干细胞的治疗具有重大的理论意义和应用价值。

发明内容

为研究胚胎干细胞在体外仿生环境中的分化与发育，本发明提供一种用于研究胚胎干细胞发育分化的细胞外基质凝胶模型及其制备方法。

因此，本发明的第一个发明目的是提供一种用于研究胚胎干细胞发育分化的细胞外基质凝胶模型的制备方法，步骤包括：

(1)将I型液态胶原与Matrigel胶(SIGMA，E1270)按4∶1混合均匀，然后将其与H-DMEM浓缩培养液等体积混合，用0.1M的NaOH适量，将混合物pH值调为7.2～7.4，加入至已制备好的12孔板模具中，每孔各注入1ml。将其置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育5mim至30mim，待液态复合物凝固制成无ESC的三维立体细胞外基质凝胶模型(此部分操作在冰盒上进行)；

(2)将ESC直接加在已制备好的固态三维立体细胞外基质凝胶模型表面，添加1ml不含LIF的ESC全培养液(每天换液观察)，从而得到含有胚胎肝细胞的细胞外基质凝胶模型。

在一个具体实施方案中，如下制备I型液态胶原：

i.颈椎脱位法处死SD大鼠，从大鼠尾根部剪断鼠尾，置于75％酒精中浸泡30min；

ii.无菌条件下剥离尾部的皮肤，并将鼠尾剪成若干小节；用眼科镊从截断面抽取尾腱，并用PBS漂洗3次；将清洗后的尾腱放入无菌的0.1％冰醋酸溶液中，置于4℃冰箱，间或震荡以促进尾腱溶解；

iii.48小时后4000rpm离心30min，收集上清即得I型液态胶原溶液；

iv.牛皮纸法测量胶原浓度。

在另一个实施方案中，如下制备H-DMEM浓缩培养液：H-DMEM一袋，2.2gNaHCO₃，2.383g HEPES，10万单位青霉素，10万单位链霉素，溶解于500ml超纯水中，调节pH值为7.2～7.4，0.45μm和0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

还在另一个实施方案中，如下制备12孔板模具：将2％的琼脂高压灭菌后注入12孔板中，每孔各1ml，待琼脂凝固后，均匀***4根长度约为1cm的无菌玻璃毛细管(直径2mm±0.15mm)。在超净台中将孔板盖子打开，紫外照射模具30min，之后将其放入37℃、5％CO₂培养箱中待用。

在另一个具体实施方案中，其中将胚胎干细胞以不同的密度范围接种在细胞外基质凝胶内部，观察不同接种密度所形成拟胚体的大小、数量。其中，所述的密度范围为10⁵至10⁶。

在另一个具体实施方案中，可在所制备三维立体细胞外基质凝胶模型中添加不同诱导剂，进行ESC定向诱导分化研究。其中所述的诱导剂可包括：Vc、RA、activin-A、TGF和VEGF等。

本发明的第二发明目的是提供根据上述方法所制备的用于研究胚胎干细胞发育分化的细胞外基质凝胶模型。

本发明的第三个发明目的是提供一种细胞外基质凝胶模型用于研究胚胎干细胞发育分化的方法，其主要内容包括：

1)通过改变胶原凝胶制备过程中的冰醋酸单位体积内含鼠尾胶原纤维的数量，控制所制备的I型液态胶原浓度，制备不同浓度的I型液态胶原，优选1.5mg/ml和3mg/ml，用于研究ESC在不同浓度I型液态胶原为主的细胞外基质凝胶中分化发育的区别。结果表明在此两个浓度下，胚胎干细胞均可以生长、黏附聚集、形成拟胚体。但仅在1.5mg/ml浓度胶原中见到大量发育成熟的含囊胚腔样结构的拟胚体；在3mg/ml浓度胶原中仅见少量发育成熟的拟胚体。

2)将ESC以不同的密度(密度范围为10⁴至10⁷cell/ml)接种在细胞外基质凝胶表面和内部，观察不同接种密度下ESC分化发育的情况，以及拟胚体的形成及其大小、数量。结果表明10⁴细胞接种密度过低，细胞不能存活；10⁷细胞接种密度过高，细胞大量细胞；而在10⁵-10⁶接种密度下，细胞生长发育良好，形成拟胚体数量多质量高。是研究胚胎干细胞分化发育的良好密度范围。

本发明的第四个发明目的是通过在制备的细胞外基质凝胶模型，定向研究胚胎干细胞诱导分化与发育。

在一个具体实施方案中，所述的用途是通过调控胚胎干细胞生长发育的微环境，进行胚胎干细胞诱导分化与发育研究，进而揭示胚胎干细胞体外分化发育的内在规律与机制，并寻求胚胎干细胞向重要生命器官处于终末分化阶段的功能细胞定向分化(如心肌，神经，血管)的新方法。在所制备三维立体细胞外基质凝胶模型中添加不同诱导剂，进行ESC定向诱导分化研究。其中所述的诱导剂可包括：Vc、RA、activin-A、TGF和VEGF等。

在另一个具体实施方案中，ESC可以是小鼠胚胎干细胞也可以是人或其他种属的胚胎干细胞。

应当指出的是，本发明旨在提供一种细胞外基质凝胶模型的制备，并不旨在该产品中所涉及的各种细胞。对于其中所述的胚胎干细胞，可以使用现有技术进行制备，或者使用普通实验室根据常规方法分离培养后进行保藏的细胞系，或者使用商品化的细胞系。例如，本发明使用已建系的胚胎干细胞，由军事医学科学院生物工程研究所提供的TC-1细胞。

附图说明

图1：体外构建细胞外基质凝胶三维模型大体观察

图2：不同密度胚胎干细胞接种在细胞外基质凝胶三维模型内部形成拟胚体的情况

A：10⁴胚胎干细胞接种密度，7天形成的拟胚体×10；B：10⁵胚胎干细胞接种密度，7天形成的拟胚体×10；C：10⁶胚胎干细胞接种密度，7天形成的拟胚体×10；D：10⁷胚胎干细胞接种密度，7天形成的拟胚体×10；

图3：不同大小拟胚体自发分化的规律

A：胚胎干细胞接种形成的拟胚体向周围分化爬出细胞×20；B：胚胎干细形成的拟胚体相互融合×20；C：胚胎干细胞形成的拟胚体分化形成复层的含管腔的结构×20；D：胚胎干细形成的拟胚体分化形成致密的复层球状结构，含细小管腔或不含管腔×20；

图4：V-C定向诱导ESC在细胞外基质凝胶中分化为跳动的心肌合胞体样结构×20

具体实施方式

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的传统分子生物学、细胞生物学、组织工程学等等。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，Fabrication of viable tissue-engineeredconstructs with3D cell-assembly technique″(2005)；Extracellular matrix-enriched polymericscaffolds as a substrate for hepatocyte cultures：in vitro and in vivo studies″(2005)。

实施例1.体外构建细胞外基质凝胶三维支架

将I型液态胶原与Matrigel胶按4∶1混合均匀，然后将其与H-DMEM浓缩培养液等体积混合，用0.1M的NaOH适量，将混合物pH值调为7.2～7.4，加入至已制备好的12孔板模具中，每孔各注入1ml。将其置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育5mim至30mim，待液态复合物凝固制成三维立体细胞外基质凝胶模型。此部分操作在冰盒上进行。在图1中可见形成的片层样三维分化发育模型。

实施例2.将胚胎干细胞以不同密度均匀复合进入细胞外基质凝胶三维模型中：

将I型液态胶原与Matrigel胶按4∶1混合均匀，然后将其与含有不同浓度的ESC的H-DMEM浓缩培养液等体积混合，用0.1M的NaOH适量，将混合物pH值调为7.2～7.4，加入至已制备好的12孔板模具中，每孔各注入1ml。(此部分操作在冰盒上进行)。将其置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育5mim至30mim时，待液态复合物凝固后，每孔添加1ml不含LIF的ESC全培养液。每天换液观察。从图2中我们可以看出，10⁴细胞接种密度过低，细胞不能存活；10⁷细胞接种密度过高，细胞大量细胞；而在10⁵-10⁶接种密度下，细胞生长发育良好，形成拟胚体数量多质量高。是研究胚胎干细胞分化发育的良好密度范围。图3显示所形成的拟胚体进一步分化发育，形成三维组织结构。

实施例3.胚胎干细胞诱导分化与发育研究：

在已构建的胚胎干细胞子体外三维分化发育模型中，加入不同的诱导剂，观察胚胎干细胞向不同成体细胞定向分化发育的能力。以加入V-C诱导剂为例，在已复合了胚胎干细胞的三维模型中加入(0.1mg/ml)的V-C，观察其对胚胎干细胞形成拟坯体及其后期分化发育的影响。图4显示胚胎干细胞形成拟胚体并分化形成跳动的心肌合胞体样结构，心肌特异性染色cTnT染色显示未分化的心肌细胞。

Claims (10)

1.一种用于研究胚胎干细胞发育分化的细胞外基质凝胶模型的制备方法，步骤包括：

(1)将I型液态胶原与Matrigel胶按4∶1混合均匀，然后将其与H-DMEM浓缩培养液等体积混合，用0.1M的NaOH适量，将混合物pH值调为7.2～7.4，加入至已制备好的12孔板模具中，每孔各注入1ml；将其置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育5mim至30mim，待液态复合物凝固制成无ESC的三维立体细胞外基质凝胶模型；

(2)将ESC直接加在已制备好的固态三维立体细胞外基质凝胶模型表面，添加1ml不含LIF的ESC全培养液，从而得到含有胚胎肝细胞的细胞外基质凝胶模型。

2.权利要求1所述的制备方法，其中在所制备三维立体细胞外基质凝胶模型中添加不同诱导剂，以制备用于ESC定向诱导分化研究的凝胶模型，所述的诱导剂可包括：Vc、RA、activin-A、TGF和VEGF。

3.权利要求1或2的方法所制备的三维立体细胞外基质凝胶模型。

4.一种利用权利要求3的三维立体细胞外基质凝胶模型来用于研究胚胎干细胞发育分化的用途。

5.权利要求4的用途，其中使用不同浓度的I型液态胶原，用于研究ESC在不同浓度I型液态胶原为主的细胞外基质凝胶中分化发育的区别。

6.权利要求4的用途，其中将胚胎干细胞以10⁴至10⁷的密度范围接种在细胞外基质凝胶内部，观察不同接种密度所形成拟胚体的大小、数量。

7.一种利用权利要求3的三维立体细胞外基质凝胶模型来用于定向研究胚胎干细胞诱导分化与发育的用途。

8.权利要求7的用途，其中在所制备三维立体细胞外基质凝胶模型中添加不同诱导剂，进行ESC定向诱导分化研究，所述的诱导剂包括：Vc、RA、activin-A、TGF和VEGF。

9.权利要求4-8所述的用途，其中ESC可以是小鼠胚胎干细胞也可以是人或其他种属的胚胎干细胞。

10.权利要求4-8所述的用途，其中所述的用途是通过调控胚胎干细胞生长发育的微环境，进行胚胎干细胞自发分化发育与诱导分化发育研究，进而揭示胚胎干细胞分化发育的内在规律与机制，并寻求胚胎干细胞向重要生命器官处于终末分化阶段的功能细胞定向分化(如心肌，神经，血管)的新方法。

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