CN101460610A - 修复和/或再生受损心肌的方法和组合物 - Google Patents

修复和/或再生受损心肌的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明修复和/或再生受损心肌的方法和组合物公开并权利要求了包括投用细胞因子在内的，用于修复受损伤心肌和/或心肌细胞的方法、组合物和试剂盒。公开并权利要求了用于发展大动脉和血管的方法和组合物。本申请还公开和权利要求了用于培养、扩增和活化人类心肌干细胞的方法和培养基。

Description

修复和/或再生受损心肌的方法和组合物
本发明是2001年6月5日提交的美国专利申请系列号10/162796的部分后继申请，前者是2001年7月31日提交的美国专利申请系列号09/9197732的部分后继申请，而该申请要求保护2001年6月6日提交的序列号60/295807、60/295806、60/295805、60/295804和60/295803的临时美国申请的权利要求。也提到2005年3月16日提交的美国专利申请序列号11/08184。
本文所列举的每个申请和专利，包括前面列举的每个申请，以及每个申请(包括审查期间的每个已公开专利；″申请列举的文件″)和专利，以及每个PCT和相当于或这些申请或专利的优先权文本，以及所列的每个文件或每个申请文件中所列举的每个文件或参考文献均列为本文参考文献。更一般地说，本文所列的各种文件和参考文件(包括本文所列产品的制造厂商的说明书，指南等)均为本发明的现有技术。本文所列的具有作者或一个或多个发明人署名的任何文件都不是以他人作为发明实体。另外，本文所列文件的技术都被列为参考文献，并可被利用于本发明的实践和实用中。
本工作由国家卫生院批准，部分受政府资助，批准号为：HL-38132、AG-15756、HL-65577、HL-55757、HL-68088、IIL-70897、H76794、HL-66923、HL-65573、HL-075480、AG-17042HEAG-023071。政府可能对本发明具有某些权利。
技术领域
本发明总地涉及心脏学领域，特别是涉及用于处理患有心血管疾病，包括但不只限于动脉硬化、心肌缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏病、先天性心血管缺陷和动脉炎症以及其他动脉、小动脉和毛细血管疾病的病人的方法和细胞组合物。本发明包括处理、治疗及可用于取代传统的、侵入性治疗方法，如旁路外科或与这些方法联合使用的方法学。
再者，本发明涉及下列任何一个或多个方面：包括治疗有效量的单独体干细胞或与选自干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)、体细胞衍生因子、青灰因子、血管内皮生长因子、巨嗜细胞集落刺激因子、粒细胞-巨嗜细胞刺激因子或白介素-3或任何能够刺激和/或迁移干细胞的细胞因子结合的方法和/或药物组合物。细胞因子可以单独投用或者与能够：刺激或迁移干细胞；维持前期或后期血细胞生成(见下述)；活化单核细胞(见下述)；巨嗜细胞/单核细胞增殖；分化、生存和存活(见下述)的任何其他细胞因子联合投用，以及与医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂结合使用。干细胞优先是成年干细胞，例如造血细胞或心肌干细胞或其组合或心肌干细胞与任何其他类型干细胞的组合。
在循环组织或肌肉组织或循环肌肉组织，例如心肌组织，如心脏或血管，如进或出心脏的静脉、动脉，如直接与心脏连接的或随后进入心脏的静脉和动脉，例如主动脉中，植入、沉积、投用或引起植入、沉积或投用干细胞，例如单独的造血或心肌干细胞以及其他类型的干细胞(如另一类型的成年干细胞)，或与选自干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)、体细胞衍生因子、青灰因子、血管内皮生长因子、巨嗜细胞集落刺激因子、粒细胞-巨嗜细胞刺激因子、白介素-3或任何能够刺激和/或迁移干细胞的细胞因子结合(其中″与细胞因子---″可包括依次植入、沉积、投用或引起植入或沉积或投用干细胞和细胞因子，或共植入或共沉积或共投用或引起移植、沉积或投用干细胞和细胞因子)。可以结合移植物进行这种移植、沉积或投用或引起植入、沉积或投用。最好应用这种迁移或增殖处理或治疗或预防心肌条件，例如处理心脏无力或斑痕形成或预防这些区域的进一步出现，或处理刺激这些区域的条件，例如心肌梗塞或缺血或其他，如遗传、导致心脏无力或瘢痕形成的条件(也见下面提到的心脏条件)。
这些处理、治疗或预防中使用的介质包括两种或多种细胞因子。
包括用于这些处理、治疗或预防的配方的细胞因子的试剂盒。
包括细胞因子的组合物和制备这种组合物的试剂盒。
本文描述了制备试剂盒和组合物的方法。
包含这些干细胞和至少一种细胞因子的组合物，以及制备这种组合物的试剂盒。
本文公开了制造试剂盒和组合物的方法。
植入或沉积干细胞或引起植入或沉积干细胞的方法。
包含引起心干细胞或心原始细胞迁移和/或增殖成循环组织或肌肉组织或循环肌肉组织，例如心肌组织，如心脏或血管，例如进或出心脏的静脉、动脉，如直接相接或随后进入心脏的动脉，例如主动脉的治疗有效量的一种或多种细胞因子的方法和/或药物组合物。这种迁移和/增殖优先被应用与处理或治疗或预防心肌状态，例如处理心脏中无力或瘢痕形成的区域，或防止这样的区域的出现或进一步出现，或处理引起或刺激这些区域，例如心肌梗塞或心肌缺血或其他心脏状态，如无力或瘢痕形成(也参见下面提到的心肌状态)。
包含两种或多种细胞因子的用于上述处理、治疗或预防的药物。
包含用于这些处理、治疗或预防的配方的细胞因子的试剂盒。
包括细胞因子的组合物和制备这种组合物的试剂盒。
本文描述了制备试剂盒和组合物的方法。
包含用于引起心干细胞或心原始细胞迁移和/或增殖成循环组织或肌肉组织或循环肌肉组织，例如心肌组织，如心脏或血管，例如进或出心脏的静脉、动脉，如直接相接或随后进入心脏的动脉，例如主动脉的治疗有效量的一种或多种细胞因子，结合治疗有效量的用于处理高血压、心肌梗塞、缺血、心绞痛，或其他冠脉或血管疾病的药剂(例如AT1受体阻断剂如losartan、链激酶、PeoPro(abciximab)、enalapril、Rapilysin(reteplase)、Dilatrend(carvedilol)、Activase(alteplase)，以及其他有本领域已知具有相似的用途的药剂)的方法和/或药物组合物。
利用上述药物组合物治疗患有高血压、心肌梗塞、缺血、心绞痛或其他冠脉或血管疾病的方法。
含有一种或多种细胞因子，结合用于治疗高血压、心肌梗塞、缺血、心绞痛，或其他冠脉或血管疾病的药剂的试剂盒。
制造和使用上述试剂盒和组合物的方法。
分离、扩展和活化干细胞，特别是心肌干细胞的方法。
用于培养、扩展和/或活化干细胞，特别是心肌干细胞的培养基。
治疗动脉和/或血管阻塞或阻断的方法，包括可在一种或多种细胞因子存在下，投用干细胞，特别是心肌干细胞，尤其是活化的心肌干细胞。
背景技术
心血管疾病是整个工业化世界的主要健康危害。与心血管疾病最相关的动脉硬化是心脏病发作和肢端坏疽的基本原因，因此是美国人死亡的主要原因。动脉硬化是一种涉及许多细胞类型和分子因素的复杂疾病(详细评述参见Ross，1993，Nature362：801-809)。
缺血是以一种以由于灌注不足而使器官组织内缺乏氧供应为特征的病理状态。这种灌注不足可以由许多自然原因引起，包括动脉硬化或再灌注损伤、贫血或卒中等。许多医学干预，例如旁路外科期间的血流干预，也可导致缺血。除了有时因患病的心血管组织引起外，缺血有时也可影响心血管组织，如缺血性心脏病。然而，缺血可以发生在氧供应缺乏的任何器官。
心脏缺血的最常见原因是心肌梗塞(MI)，通常所谓的心脏发作是最熟知类型的心血管疾病。1998年的估计显示，美国有730万人患有MI，这一年有超过1百万的人经历了MI(美国心脏协会，2000)。这些病人中，25％是男性，38％是女性，病人在被首次认定为MI后的一年内死亡(美国心脏协会，2000)。MI由突然和持续性心脏区域缺血引起，大多由冠状动脉狭窄引起。没有足够的血液供应，组织逐渐缺血，导致心肌细胞和血管结构的死亡。存活率决定于梗塞的部位，随着梗塞面积的增大，恢复的可能渐小。例如，在人类，左心室有46％梗塞即可造成不可逆的心源性休克和死亡(99)。
目前，MI的治疗集中于再灌注疗法，其试图启动通向受影响区域的血流，阻止组织的进一步丢失。再灌注疗法的主要选择是使用抗血栓剂，或进行气球血管成形术，或冠状动脉旁路移植术。抗凝血剂溶解可能阻塞动脉的血凝块，而气球血管成形术可使导管通入阻塞部位的动脉，通入的导管的尖端被充气，推开动脉。更具侵入性的方法包括分流手术，外科医生除去病人的部分静脉，用它在心脏中造成新的动脉，从旁路通过被阻断的部分，继续向病变区域供应血液。1998年，估计有553,000个人接受过冠状动脉分流移植手术，有539,000个病人作过皮下冠血管成形手术。这些手术平均每个病人分别花费27,091和8,982美圆(美国心脏协会，2000)。
这些治疗可能在从新建立血液供应中获得成功，但在再灌注处理开始之前会发生不可逆的组织损伤。为此，对合适的MI病人要尽可能快地开始再灌注治疗，以限制梗塞的面积。
大多数研究集中在减少梗塞的大小上。有少数人试图移植心肌细胞或成肌细胞再生坏死组织(Leor et al.，1996；Murry，et al.，1996；Taylor，et al.，1998；Tomita，etal.，1999；Menasche，et al.，2000)。虽然细胞在移植后可以存活，但他们不能重新建立功能和结构上的健康心肌和冠状血管。
正常成年人的所有细胞都来源于身体各个部分之内。这些细胞本身均衍生于称为祖细胞的未成熟细胞，可在半固体培养基例如甲基纤维素或琼脂中，于1-3周内观察是否发育成连续克隆来检测这些祖细胞。***后，干细胞能够自身更新并分化成祖细胞。因此，***的干细胞产生附加的原始干细胞和分化的祖细胞。干细胞除了具有发育成血细胞的已知作用外，干细胞也能产生见于肝、脑和心脏等其他组织的细胞。
干细胞有能力无限分化，并专门化变成特殊类型的细胞。在受孕后即存在并开始***的全潜能干细胞具有全部潜能，并且能够变成任何类型的细胞。细胞一旦达到母细胞阶段，细胞的潜能便受到损伤，虽然细胞仍能发育成体内的任何细胞，但并不能发育成胚胎发育所需的支持组织。细胞被认为是多潜能的，因为他们仍能发育成许多类型的细胞。在发育期间，这些细胞更加专门化，成为具有特殊功能的细胞。见与成年人的这些多潜能的细胞被称为成年干细胞。已知干细胞定位于骨髓中，并且有小量外周血干细胞能通过血流循环(国家卫生院，2000)。
由于干细胞的再生特性，所以认为它们是完成组织和器官潜在工程的顶端来源。这就为针对心肌状态使用干细胞提供了优点。
可提到的文献有：
美国专利6,117,675号涉及视网膜干细胞于体内或体外分化成视网膜细胞，可用于恢复视力的治疗。
美国专利6,001,934号涉及由朗汉氏干细胞发育成功能性小岛。
美国专利5,906,934和6,174,333号涉及使用间充质干细胞修复软骨，并使用间充质干细胞再生韧带；例如，其中将干细胞包埋在凝胶基质中，然后植入以取代所需要的软组织。
美国专利6,099,832和6,110,459号涉及移植物和细胞移植。
PCT申请PCT/US00/08353(WO00/57922)和PCT/US99/17326(WO00/06701)号涉及心肌内注射自体骨髓，但该发明中没有教导或提示投用、植入、沉积或使用造血干细胞，特别是本发明中的造血干细胞是分离和纯化的成年造血干细胞。
此外，由于其他原因，这些专利文献中至少有些没有教导或提示本发明。有用干细胞的来源限于再生所需组织类型的已知来源。因为给定组织中常常只有很少干细胞，所以得到和纯化这些特殊细胞可能是极其困难的。相反，本发明的优点在于干细胞能够与心肌损伤的根源建立各种谱系级连，并可分化成适当的细胞类型，而不需要从心肌直接回收干细胞，并且各种类型的干细胞均可使用，并没有危及再生组织的功能性。并且，其他一些专利文献则利用干细胞作为各种化学组合物的来源，而没有利用它们的增殖能力，因而没有教导或提示本发明。
目前文献中公开的已开始的干细胞潜能研究，仅仅有助于修复已知的专门化组织。干细胞能够穿过胚芽层边界的这种可塑性，仅仅是一个早期概念(Kempermann et al.，2000；Temple，2001)。Kocher等人(2001)讨论了梗塞后使用成年骨髓诱导神经血管化，以作为用于左心室重建的可代用疗法(参见Rosenthl和Tsao，2001)。其他研究集中在使特殊类型的干细胞(即如Malour等人显示的肝干细胞)分化成心肌细胞。另外再有的工作则集中于骨髓衍生干细胞的可能性(Krause，et al.，2001)。
干细胞在医学上较早应用是用于***。这些治疗中，将骨髓移植到本身骨髓已受到放射破坏的病人体内，然后被移植骨髓中的干细胞即产生新的、健康的白血细胞。
这些治疗中，干细胞被移植到其正常环境，在这里发挥其正常功能。到目前为止，认为特定的干细胞只是能够产生3至4个类型的细胞，这样，它们只能在证明它们能够变成的细胞类型的治疗中得到应用。已开始揭示治疗心肌疾病的其他选择，但上未限定干细胞在其中的作用。这类工作的例子将呈现于本发明的证据中。
器官移植已被广泛用于非功能组织的取代治疗。最近，作为一种潜在的治疗手段，已出现放大宿主组织功能缺陷的细胞移植。该方法的一个例子是在患有帕金森氏病的个体中公开使用胎儿组织(参见Tompson，1992)，其中由移植的细胞分泌多巴胺，使病人的缺陷得到缓解。在其他研究中，将移植的成肌细胞与杜兴氏病病人的内源性肌管融合；重要的是，移植的肌管表达多种类型的肌营养不良蛋白(Gussoi et al.，1992)。
尽管它们也关系到其他领域，但这些研究并没有描述可成功用于心脏的细胞移植技术，其中取代受损心肌的能力具有明显的临床相关性。另外，使用针对长期表达血管生成因子和离子移变肽的心肌内移植物，将对心肌缺血或先天性心脏病的个体具有治疗价值。
从该发明背景看，有必要改善心脏中的心肌再生技术。这样的技术不仅导致心脏的组织再生，也能够直接向心脏释放有用的组合物。本发明就是针对这些需要提出的。
因此，相信现有技术没有教导或提示如本公开和本文所述方法提到的，单独或与至少与一种细胞因子联合投用、沉积，或引起沉积、移植或投用干细胞，以及这些干细胞在用于治疗、处理或预防的药物配方中的应用，并且本文所述方法、组合物、试剂盒和应用是新的、非显而易见和具有发明性的，也就是说，现有技术中没有教导或提示本发明，所以本发明是新的、非显而易见和具有发明性的。
发明内容
令人惊奇发现，心肌梗塞后，向梗塞周围的心肌移植体干细胞，这些体干细胞即可迁移到受损区域并分化成心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，然后增殖并形成包括心肌、冠状动脉、小动脉、毛细血管等的结构，恢复梗塞心肌的结构和功能完整性。
同样令人惊奇地发现，心肌梗塞后，给病人投用细胞因子，即可刺激病人体内定居和/或循环的干细胞，使它们进入血流并定居到梗塞的区域。还发现，一旦细胞定居于梗塞区，它们便迁移到受损组织，在那里分化成心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，然后增殖并形成包括心肌细胞、冠状血管和动脉、小动脉和毛细血管等，使梗塞区域的结构和功能完整性得以恢复。
目前，已在人(82)和大鼠(83、84)心脏中鉴定了定居的心肌干细胞(CSC)。虽然这些原始细胞大多积聚在动脉中，但它们也存在于整个心肌内(82、83、84)。CSC表达常见于造血和骨骼肌干细胞的表面抗原(85、86)。对于所有心肌谱系，CSC是克隆发生、自身更新和多潜能的。因为CSC的生长特性，受损伤的心脏具有自身修复的潜力。然而，这种可能性却受到我们对CSC在新组成并发挥功能的心肌内克隆化、增殖和分化的了解的限制(61、87)。同样的障碍也适用于机体内任何其他来源的干细胞(88)。
对造血细胞和肝干细胞(89、90、91)，特别是随体骨骼肌细胞(92)上c-Met的识别，已促成了检测其配体(肝细胞生长因子(HSF))是否对CSC具有生物学作用。梗塞后，立即估计HSF迁移并促进CSC从解剖储存区向损伤部位转位。通过表达和活化基质金属蛋白酶2(94、95)，可见HGF对细胞迁移的积极影响(93)。金属蛋白酶家族可破坏细胞外基质构成的屏障，从而有利于CSC移动、定居和组织储存。
同样，***-1(IGF-1)是促有丝***和抗凋亡的，并且是神经干细胞繁殖和分化所必须的(96、97、98)。以相似方式，IGF-1通过增加它们的数目和它们的存活性影响CSC。成年小鼠心脏中的，IGF-1的过表达特征在于心肌细胞增殖(65)，并且这种细胞的生长可能取决于CSC活化、分化和存活。
因此，本发明提供了修复和/或再生最近损伤的心肌和/或心肌细胞的方法和组合物，包括投用有效量的一种或多种细胞因子，例如HGF和IGF-1，以引起心肌干细胞或心肌原始细胞的迁移和/或增殖成循环组织或肌肉组织或循环肌肉组织。这种迁移和/或增殖优先应用于处理或治疗或预防心肌状态，如治疗心脏无力或瘢痕形成，或防止受损区域的出现或进一步出现，或治疗导致或刺激这些区域的病理状况，例如心肌梗塞或缺血或影响心脏无力或瘢痕形成的遗传因素和状态。
有必要提示，本发明使用的方法优于通过移植心肌细胞(42、79)、成骨骼肌细胞，或利用胚胎细胞(100、101)来置换坏死或瘢痕形成心肌的方法。虽然这些尝试在维持被移植细胞的存活性上是成功的，但它们没有重建结构和功能上与心室壁的完好部分相整合的健康心肌和冠状血管。在应激条件下，CSC调节心脏的正常细胞更新，参与受损心室结构和功能的恢复(82、102)。
本发明还提供了包括治疗有效量的一种或多种引起心肌干细胞或心肌原始细胞向循环组织或肌肉组织或循环肌肉组织迁移和/或增殖的细胞因子。这种迁移和/或增殖优先应用于处理或治疗或预防心肌状态，例如治疗心脏无力或瘢痕形成或防止这样的区域的出现或治疗引起或刺激这些区域的状态，例如心肌梗塞或缺血或其他情况，例如影响心脏无力或瘢痕形成的状态。
本发明也提供用于这些处理、治疗或预防的药物。
本发明进一步提供包括用于这些处理、治疗或预防的一种或多种细胞因子的试剂盒。
本发明还提供制备本文所述试剂盒和组合物的方法。
本发明进一步提供用于修复和/或再生最近受损的心肌和/或心肌细胞的方法和/或组合物，其包括投用体干细胞，如成年干细胞或心肌干细胞或造血干细胞或其组合，如成年心肌干细胞或造血干细胞或它们的组合，或心肌干细胞与另一类型干细胞的组合，例如成年心肌干细胞与另一类型成年干细胞的组合。
一个方面，本发明提供投用干细胞之前用于体外培养和/或扩展干细胞的培养基。
本发明进一步提供用于修复和/或再生最近受损的心肌和/或心肌细胞的方法和/或组合物，其包括投用至少一种细胞因子。
本发明进一步提供用于修复和/或再生最近受损的心肌和/或心肌细胞的方法和/或组合物，其包括与用于处理心肌或血管状态的药剂一起联合投用至少一种细胞因子。本发明进一步涉及用于修复和/或再生最近受损的心肌的方法和/或组合物，其包括投用体干细胞，如成年干细胞或心肌干细胞或造血干细胞或其组合，如成年心肌或成年造血干细胞或它们的组合，或心肌干细胞与另一类型干细胞的组合，例如成年心肌干细胞与另一类型成年干细胞和/或细胞因子的组合。
本发明进一步提供制备前述组合物的方法，其包括将医药上可接受的载体与体干细胞和/或细胞因子混合。
本发明还提供包括了修复和/或再生最近受损的心肌和/或心肌细胞的药物组合物的试剂盒。
本发明提供涉及在循环组织或肌肉组织或循环肌肉组织，例如心肌组织，如心脏或血管如进或出心脏的静脉、动脉，例如直接连接或随后进入心脏的静脉和动脉如主动脉中，单独或与选自干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)、体细胞衍生因子-1、青灰因子、血管内皮生长因子、巨嗜细胞集落刺激因子、粒细胞-巨嗜细胞刺激因子或白介素-3或任何能够刺激和/或迁移干细胞的细胞因子结合(其中“与细胞因子---”可包括依次植入、沉积、投用或引起植入或沉积或投用干细胞和细胞因子，或共植入或共沉积或共投用或引起共植入或共沉积或共投用，或同时植入、沉积或投用干细胞和细胞因子)，植入、沉积、投用或引起植入或沉积或投用干细胞，如成年干细胞、例如心肌干细胞或造血干细胞或其组合，或心肌干细胞(如成年心肌干细胞)与另一类型的干细胞(例如另一类型的成年干细胞)联合的方法。这种植入、沉积或投用，或引起植入、沉积、投用可与移植结合。
这样的植入、沉积或投用或引起植入、沉积或投用优先被应用于处理或治疗或预防心肌状态，例如处理心脏衰弱或瘢痕形成的区域，或防止这样的区域出现或进一步出现，或处理引起或刺激这样的区域，例如心肌梗塞或缺血或其他，例如遗传和影响心脏衰弱或瘢痕形成的其他病理状态(也参见上文提到的心肌状态)。
本发明还提供在用于这些处理、治疗或预防的药物配方中，单独使用或与所说的细胞因子联合使用干细胞。
因此，本发明还提供用于这样的处理、治疗或预防的药物，其包括干细胞和细胞因子。
本发明提供包括用于处理、治疗或预防的配方中的干细胞和因子的试剂盒。干细胞和细胞因子可以包装在分立的容器或同一个容器中；并且试剂盒可以包括给药装置(如注射器)和/或给药和/或混合指南。
本发明也提供包括这些干细胞和细胞因子的组合物，以及制备这种组合物的试剂盒(如包括干细胞和细胞因子的试剂盒；干细胞和细胞因子可以在分立的容器或同一个容器中包装；并且试剂盒可包括给药装置(如注射器)和/或给药和/或混合指南)，以及制造上述组合物的方法。
本发明还提供来自体外的生成和/或再生心肌的方法，其中包括可在细胞因子存在下，体外培养体干细胞和心脏组织。体干细胞分化成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞，并且体外增殖形成心肌组织和/或细胞。这些组织和细胞可以集合成动脉、小动脉、毛细血管和心肌组织等心肌结构。然后可以将体外形成的组织和/或细胞移植到病人体内，以恢复结构和功能完整性。
本发明另外提供产生用于治疗动脉或血管阻塞的大血管的方法。这样的方法可以用于取代传统的心脏旁路外科方法，或与之结合使用。本发明的方法涉及分离、扩增和活化心肌干细胞，其中心肌干细胞是通过与一种或多种细胞因子接触活化的。然后在阻断或闭塞部位释放或植入活化的心肌干细胞。
再者，本发明提供可用于培养和扩增干细胞，特别是心干细胞的生长培养基。还提供可用于活化干细胞，特别是心肌干细胞的生长培养基。也可以投用生长于所说的培养基中的未活化的干细胞，以再生心肌或血管。可投用生长于该培养基中的活化的干细胞以再生心肌或血管，其中血管包括如生物学旁路手术中使用的大动脉和静脉。
本公开中，术语“由---组成”、“含有”、“具有”等可以有美国专利法中描述的含义，并且可以有“包括”、“包含”等的意思；术语“基本上由---组成”具有美国专利法中描述的含义，并且是开放性的术语，只要所列举的内容没有改变基本的或新的特征，并且不包括现有技术的实施方案，其允许罗列更多。
按照美国法典第287卷第(c)(2)(A)(iii)条的规定，本发明的方法被认为是生物技术方法，其提供医疗活动的侵权除外，但并不适用于生物技术专利的实践。
公开了这些和其他实施方案，或者下列详细描述使这些实施方案更为明显。
附图说明
下列详细描述部分借助实施例描述本发明，但不构成对所述具体实施方案的限制，结合下列附图可更容易理解本发明。
图1显示log-log作图。其中显示FACS分类(基于c-kit表达)的EGFP转基因小鼠的Lin-骨髓细胞(c-kitPOS细胞(上框)为6.4％。下框显示为c-kitNEG细胞。c-kitPOS细胞比c-kitNEG细胞亮1-2log)；
图2A显示MI诱导小鼠的组织切片的照片(该照片显示注射了骨髓Lin-c-kitPOS细胞(箭头)、仍存活的心肌(VM)、和再生的心肌(箭头)的心肌梗塞(MI)区域。放大12倍)；
图2B显示放大较高倍数的图2A的某些组织切片图，其中给出放大50倍的MI中心区；
图2C、D显示低倍和高倍放大的、注射了Lin-c-kitPOS细胞的MI区域组织切片的照片，其中2C放大25倍，2D放大50倍；
图2E显示注射了Lin-c-kitNEG细胞的MI区域的组织切片的照片，其中只有脊部明显且放大为50倍(*坏死心肌细胞。红色为心肌肌球蛋白，绿色为核的PI标记)；
图3A-C显示MI诱导的小鼠的组织切片的照片，其中显示注射Lin-c-kitPOS细胞的MI区域(可可见心内膜(EN)向心外膜(EP)再生的心肌部分。所有照片图均被标记，以显示心内膜下(IT)和心内膜下多余心肌细胞(SM)梗塞组织的存在。图3A被染色以显示EGFP(绿色)的存在。放大250倍。图3B染色显示心肌肌球蛋白(红色)的存在。放大250倍。图3C染色显示EGFP和肌球蛋白(红-绿色)，以及PI染色的核(兰色)的存在。放大250倍)；
图4A显示移植物对心肌梗塞左心室终末舒张压(LVEDP)、左心室舒张压(LVDP)、LV+压力升高速率(dP/dt)和LV-压力衰变速率(dP/dt)的影响(从左到右框表示：假手术的小鼠(SO，n＝11)；未注射Lin-c-kitPOS细胞的小鼠(MI，注射Lin-c-kitNEG细胞的n＝5；未注射的n＝6)；注射Lin-c-kitPOS细胞的小鼠。误差栏是标准差。
Figure A200780013458D00151
相对于SO和MI，p<0.05)；
图4B为显示心肌和和功能性相关组织中Lin-c-kitPOS细胞分化的草图；
图5A-1显示MI诱导的小鼠组织切片的照片，其中显示注射Lin-c-kitPOS细胞的MI区域中的再生心肌(图5A染色以显示EGFP的存在(绿色)。放大300倍。图5B染色以显示小动脉中α平滑肌肌动蛋白(红色)的存在。放大300倍。图5C染色以显示EGFP和α平滑肌肌动蛋白(黄-红色)，以及PI染色的核的存在(兰色)。放大300倍。图5D-F和G-I显示心肌肌球蛋白阳性细胞中MEF2和Csx/Nkx2.5的存在。图5D显示PI染色的核(兰色)。放大300倍。图5E染色显示MEF2和Csx/Nkx2.5标记(绿色)。放大300倍。图5F染色显示心肌肌球蛋白(红色)，以及PI着染的MEF2或Csx/Nkx2.5(核为浅荧光)。放大300倍。图5G显示PI染色的核(兰色)。放大300倍。图5H染色显示MEF2和Csx/Nkx2.5标记(绿色)。放大300倍。图5I染色显示心肌肌球蛋白(红色)，及PI着染的MEF2和Csx/Nkx2.5标记(核显示浅荧光)。放大300倍)；
图6(图6A-F)显示MI诱导的小鼠组织切片的照片，其中显示注射Lin-c-kitPOS细胞的MI区域中的再生心肌(图6A-C显示已在抗UrdU抗体存在下保温的组织，图6A染色显示PI标记的核(兰色)。放大900倍。图6B染色显示BrdU和Ki67标记的核(绿色)。放大900倍。图6C染色显示α-肌节肌动蛋白(红色)的存在。放大900倍。图6D-F显示在抗Ki67抗体存在下保温的组织。图6D着染显示PI标记的核(兰色)的存在。放大500倍。图6E显示BrdU和Ki67标记的核(绿色)。放大500倍。图6F染色显示α-平滑肌肌动蛋白(红色)的存在(红色)。放大500倍。亮荧光：PI与BrdU(C)或Ki67(F)的组合)；
图7(图7A-C)显示MI诱导的小鼠组织切片的照片，其中显示注射Lin-c-kitPOS细胞的MI区域(尽管是边界带，但可见与梗塞的未修复组织区域(箭头)分隔的心肌(VM)和心肌带(NB)。图7A染色显示EGFP的存在(绿色)。放大280倍。图7B染色显示心肌肌球蛋白的存在(红色)，放大280倍。图7C染色显示EGFP和肌球蛋白的存在(红-绿色)，以及PI染色的核(兰色)。放大280倍)。
图8(图8A-F)显示MI诱导的小鼠组织切片的照片，其中显示注射Lin-c-kitPOS细胞的MI区域中的再生心肌(图8A染色显示EGFP的存在(绿色)。放大650倍。图8B是染色显示心肌肌球蛋白(红色)的存在。图8C是染色显示EGFP肌动蛋白(黄色)，以及PI染色的核(兰色)的存在。放大650倍。图8D染色显示EGFP(绿色)的存在。放大650倍。图8E染色显示小动脉中平滑肌肌动蛋白(红色)的存在。放大650倍。图8F染色显示EGFP和α-平滑肌肌动蛋白(黄-红色)及PI染色的核的存在(兰色)。放大650倍)；
图9(图9A-C)显示MI诱导的小鼠组织切片的照片，其中显示注射Lin-c-kitPOS细胞的MI区域中的再生心肌(箭头)(其中图9A染色显示心肌肌球蛋白(红色)。放大400倍。图9B是染色显示Y线粒体(绿色)。图9C染色显示Y线粒体和(浅兰色)PI标记的核(深兰)的存在。注意：心内膜下和心内膜下其余心肌细胞(SM)梗塞组织(IT)中缺乏Y线粒体。放大400倍)；
图10(图10A-C)显示MI诱导的小鼠组织切片的照片，其中显示心肌肌球蛋白阳性细胞中的GATA-4(图10A显示PI染色的核(兰色)。放大650倍。图10B显示GATA-4标记(绿色)的存在。放大650倍。图10C是染色显示与GATA-4和PI(核中的亮荧光)结合的心肌球蛋白(红色)。放大650倍)；
图11(图11A-D)显示MI诱导的小鼠组织切片的照片(图11A显示梗塞和存活组织之间的边界带。放大500倍。图11B显示再生的心肌。放大800倍。图11C染色显示连接蛋白43(黄-绿色)，箭头显示心肌细胞之间的接触。放大800倍。图11D染色显示α-肌节肌动蛋白(红色)和PI染色的核(绿色)。放大800倍)；
图12(图12A-B)显示MI诱导的小鼠组织切片的照片，其中显示注射Lin-c-kitPOS细胞的MI区域并显示再生的心肌(图8A染色显示心肌肌球蛋白(红色)和PI染色的核(黄-绿色)的。放大1,000倍。图12B如图12A一样，但放大700倍)；
图13A-B显示MI诱导的小鼠组织切片的照片，其中较高倍数放大(80倍-相邻框)显示有心肌形成的细胞因子处理的小鼠的大梗塞区(MI)(箭头)(放大50倍)。图13B显示未处理小鼠的MI。医治包括整个梗塞区(箭头)(放大50倍)。较大放大倍数下，可见瘢痕形成(80倍-相邻框)。红色＝心肌肌球蛋白；黄-绿色＝核的碘化丙锭标记；兰色-品红＝I和III型胶原蛋白)；
图13C处理和未处理的MI诱导小鼠的死亡率和心肌再生(细胞因子处理的梗塞小鼠，n＝15；未处理的小鼠，n＝52。Log-排列实验：p<0.0001)；
图14为显示定量测定梗塞面积大小的图(梗塞或假手术后27天死亡的假手术的(SO，n＝9)、梗塞后未治疗的(MI，n＝11)和细胞因子处理的小鼠的左心室游离壁(LVFW)中的心肌细胞总数。心肌细胞丢失的百分比与梗塞面积大小一致。X±SD，*与SO相比p<0.05)；
图15A-C为显示心肌梗塞、心脏解剖和功能的图(图15A-C显示手术后27天死亡的小鼠的LV直径；假手术的(SO，n＝9)、梗塞后未处理的(MI，n＝9)和细胞因子处理的梗塞小鼠(MI-C，n＝10)；
图15D显示以超声波心动描记法(心回波描记术)检测的EF；(SO，n＝9；MI-C，n＝9)；
图15E-M显示SO(e-g)、MI(h-j)和MI-C(k-m)的M型超声波心动图(新形成的收缩心肌(箭头))；
图15N是显示心室壁应力，SO(n＝9)、MI(n＝8)和MI-C(n＝9)(结果以均数±标准差表示)。***与SO和MI比较p<0.05)；
图16A-G在心肌梗塞、心脏解剖和心室功能方面显示移植物(图16A-D显示SO(n＝9)、MI(n＝9)和MI-C(n＝9)中的超声波心动描记的LVSD(a)、LVEDD(b)、PWST(c)和PWDT(d)。图16E-G分别显示SO(n＝9)、MI(n＝9)和MI-C(n＝10)死亡时解剖测量的腔壁厚度(e)、小室直径(f)和纵轴(g))。***与SO和MI相比p<0.05；
图16H-P显示SO(h-j)、MI(k-m)和MI-C(n-p)的两经向(2D)影象和M模式示踪；
图17(图17A-D)图解显示心室功能(图17A-D显示心肌梗塞或假手术后27天，测得麻醉死亡小鼠的血液动力学；SO(n＝9)、MI(n＝9)和MI-C(n＝10)。符号和统计参见图13)；
图18A-E图解显示心肌再生的有关方面(图18A是MI和MI-C第27天，LVFW组织中仍存活(Re)、丢失(Lo)和新形成(Fo)的心肌组织；SO为没有梗塞的心肌。图18B显示其余心肌中细胞肥厚量。图18C显示再生心肌中的细胞增殖。BrdU和Ki67标记的心肌细胞(M)、EC和SMC；n＝11。***相对于M和EC，p<0.05。图18D-E图解显示所形成的心肌内心肌细胞的数目(n＝11)和类别分布(桶形大小，100μm3；n＝4,400)；
图18F-H显示MI诱导的小鼠的组织切片照片，可见TER-119标记的红细胞膜(绿色荧光)；兰荧光＝PI染色的核；红荧光＝MSC中的α-平滑肌肌动蛋白(图18F放大800倍。图18G-H放大1,200倍)；
图19(图19A-D)与抗Ki67(A，B)和BrdU(C，D)一起保温的MI诱导的小鼠组织切片的照片(图19A心脏肌球蛋白标记的心肌细胞。核的亮荧光反映PI和Kid67的组合。放大800倍。图19B显示α-平滑肌肌动蛋白标记SMC。核的亮荧光反映PI与Ki67的组合。放大1,200倍；
图19C显示α-平滑肌肌动蛋白标记SMC。亮荧光反映PI与BrdU的组合。放大1,200倍。图19D显示因子VIII标记的新形成的心肌中EC。核的亮荧光反映PI和BrdU的组合。放大1,600倍；
图20(图20A-F)是MI诱导的小鼠组织切片的照片，显示分化的心肌细胞的标记(图20A以巢蛋白染色显示心肌细胞的标记(黄色))。红色荧光指示心肌肌球蛋白。放大1,200倍。图20B染色显示桥粒蛋白的标记(红色)。放大800倍。图20C染色显示连接蛋白的标记(绿色)。红色荧光指示心肌肌球蛋白。放大1,400倍。图20D显示VE-钙粘着蛋白，并且黄-绿色荧光反映flk-1标记的EC(箭头)。放大1,800倍。图20E显示EC中因子VIII的红色荧光，黄-绿色荧光反映flk-1标记的EC(箭头)。放大1,200倍。图20F显示flk-1标记的SMC胞浆(绿色荧光)，和flk-1标记的内皮衬层。红色荧光指示α-平滑肌肌动蛋白。兰色荧光指示核的PI标记。放大800倍；
图21A-C显示MI诱导的小鼠组织切片(图21A使用亮荧光显示核的PI标记与Csx/Nkx2.5的结合。放大1,400倍。图20B使用亮荧光显示核的PI标记与GATA-4的结合。放大1,200倍。图20B使用亮荧光显示核的PI标记与GATA-4的结合。放大1,400倍。图20C使用亮荧光显示核的PI标记与MEF2的结合。放大1,200倍(红色荧光显示心肌肌球蛋白抗体染色，兰色荧光显示核的PI标记。用Csx/Nkx2.5、GATA-4和MEF2标记的心肌细胞核部分分别为63±5％(取样的核＝2,790；N＝11)、94±5％(取样的核＝2,810；N＝11)和85±14％(取样的核＝3,090；N＝11)；
图22A-L为显示正常的、生长因子处理的和未处理梗塞心脏中心肌原始细胞的聚焦显微镜检查。图22A-F显示假手术小鼠心房心肌的切片。图22A和B、22C和D、22E和F是显示不同染色的同一心房心肌区域的成对的聚焦显微镜检查照片。c-kitPOS(22B，绿色)细胞(22B，黄-绿色)中表达了c-Met(22A，黄色)。同样，MDR1POS(22D，绿色)细胞(22D，黄-绿色)中检测到IGF-1R(22C，黄色)。MDR1POS(22F，绿色)细胞(22F，红-黄-绿色)中发现共同本地化的c-Met(22E，红色)和IGF-1R(22E，黄色)。箭头指出c-kitPOS和MDR1POS细胞中的c-Met和IGF-1R。心肌细胞胞浆染成***，并含有心肌肌球蛋白。22G：黄色线分隔生长因子处理小鼠的梗塞心肌(MI)与来自活心肌细胞(兰色核，只显示PI)边界区(BZ)的凋亡心肌细胞(亮核，PI和发夹1)。MI和BZ中存在活的c-kitPOS细胞(兰色核，PI；c-kit，绿色)(箭头)。心肌细胞胞浆染成红色并含有心肌肌球蛋白。22H：黄色线分隔生长因子处理的小鼠MI与来自活心肌细胞(兰色核，只显示PI)BZ的坏死心肌细胞(亮核，PI和发夹结构2)。MI和BZ中存在活的MDR1POS细胞(兰色核，PI；MDR1，绿色)(箭头)。心肌细胞胞浆染成红色并含有心肌肌球蛋白。22I和22J：两支未处理的小鼠梗塞区域中的凋亡心肌细胞(22I和22J，浅核，PI和发夹1)和c-kitPOS(22I，绿环)及MDR1POS(22J，绿环)细胞经受凋亡(22I和22J，亮核，PI和发夹1；箭头)。可见的细胞有兰色核(仅PI)。活c-kitPOS细胞存在于梗塞的心肌内(22I，绿环，兰核，只有PI，箭头)。心肌细胞胞浆染成红色并显示有心肌肌球蛋白。22K和22L：生长因子处理小鼠的梗塞心肌(黄色斑点为凋亡的核)存在c-kitPOS(22K，绿环；箭头)和MDR1POS(22L，绿环；箭头)。c-kitPOS(22K)和MDR1POS(22L)细胞中的亮荧光相当于它们的核的Ki67标记。22A-L，栏＝10μm。22M和22N图解显示手术后7-8小时和投用生长因子(处理的)或盐水(SO，未处理的)后2-3小时处死的，假手术(SO)、梗塞后处理的(治疗的)和梗塞后未处理的(未治疗的)小鼠心脏各区域中的存活和死亡的c-kitPOS(22K)和MDR1PO S(22L)细胞。缩写词如下：A，心房；LV，左心室；R，远离梗塞的活心肌细胞；B，梗塞周边的活心肌细胞；I，非存活的梗塞心肌。22M和22N中的结果以均数±标准差表示。***表示与SO和处理的相比p<0.05。
图23A-B图解显示梗塞的大小并估计左心室血液动力学。结果以均数±标准差表示。***表示对假手术小鼠和(SO)为未处理梗塞小鼠(MI)的显著性分别p<0.05。缩写词如下：MI-T，处理的梗塞小鼠；LV，左心室和隔。23A：根据左心室和隔膜中心肌细胞的丢失检测梗塞面积以尽可能地减小存活心肌和治愈坏死区心肌肥大对梗塞大小的影响。这种检测不取决于活组织和坏死心肌皱缩(因瘢痕形成引起)的反应性肥大(87)。23B：根据LV末端舒张压、左心室舒张压、LV舒张压、LV+dP/dt和LV-dP/dt的数据估计VL血液动力学。23C至23H显示未处理的(23C和23D)和处理的(23E和23H)小鼠左心室大梗塞区的聚焦显微照片。图23D、23F和23H(栏＝0.mm)以较高放大倍数显示由23C、23E和23(栏＝1mm)中的框限定的区域。图23C和23D显示因壁的梗塞区中有I和II型胶原蛋白(兰色)聚集而缺少心肌再生(箭头)。多余心肌细胞和炎性细胞的核很明显(绿色，PI)。心内膜下存在小的活心肌细胞层(红色，心肌肌球蛋白)。23E-H中，心肌肌球蛋白抗体的红色荧光显示心肌细胞再生。在梗塞区中检测到小的I型和III型胶原蛋白积聚灶(兰色，箭头)。核为黄-绿色(PI)。缩写词如下：IS，心室内隔膜；MI，心肌梗塞；RV，右心室。
图24显示冠状动脉结扎前和结扎后15天，单个小鼠心脏的超声心动描记结果。聚焦显微镜术显示同一心脏的切片。24A显示心脏结扎前的基线超声心动描记结果。24B和24C显示24A和24D中评估的心脏切片的低倍(24B，栏＝1mm)和高倍(24C，栏＝0.1mm)放大的聚焦显微照片。所使用的缩写词是：RV，由心室；IS，心室内隔；MI，心肌梗塞。24D显示梗塞后15天同一心脏收缩功能的超声波心动描记(箭头)。24E图解显示射血分数，结果以均数±标准差表示。***表示分别与假手术小鼠(SO)和未处理的梗塞小鼠(MI)相比p<0.05。MI-T是指处理的梗塞小鼠。
图25A-F是揭示再生心肌的性质的聚焦显微镜照片。图24G-J中，这些性质是定量的。25A和25B显示酶裂解的再生部分的心肌细胞，和细胞因子处理的梗塞心室的存活心肌。25A染色显示小心肌细胞(红色，心肌肌球蛋白)、亮核(PI和BrdU)和兰核(只PI)。25B显示大的、肥厚的心肌细胞(红色，心肌肌球蛋白)、亮核(PI和BrdU)和兰色核(只PI)。25A和25B中，栏距等于50μm。显示生长因子处理的小鼠梗塞后，新的(25C和25)和其余(25E和25F)心肌细胞的机械性质。R是指这些心肌细胞的舒张状态，C是收缩状态。给出N(新的小心肌细胞)和S(其余的肥厚心肌细胞)的结果，显示对细胞缩短(G)、缩减速度(H)、峰值缩短时间(I)和50％再延长时间(J)的刺激作用。结果以均数±标准差表示。*表示与S相比p<0.05。
图26显示成对的聚焦显微镜检照片，其中显示成熟心肌细胞的各种标志(26A-N，栏距＝10mm)。在图26A-F，图26A、26C和26E中的BrdU标记显示为绿色，并且显示再生心肌切片的心肌细胞中的巢蛋白(26B，红色)、桥粒蛋白(26D，红色)和心肌肌球蛋白(26F，红色)的定位。26B、26D和26F中的核仅被PI标记(兰色)，并且26G、26D和26F中则被BrdU和PI一起标记(亮的)。26G-N显示发育的心肌(26G-26J)和分离的心肌细胞(26K-N)的切片中鉴定的肌联蛋白43(26G、2626K和26H，黄色)和N-钙粘着蛋白(26I、26J，26M和26N，黄色)。心肌细胞被心肌肌球蛋白着染(26H、26J、26M和26N，黄色)，并且核只被BrdU着染(26G、26I、26K和26M，绿色)、只被PI(26H和26J，兰色)着染和被BrdU与PI一起着染(26H、26J、26L和26N，亮的)。
图27是显示新形成的冠状血管的一系列聚焦显微照片。图27A-27D中，显示带有TER-119标记的红细胞膜(绿色)，PI染色的核(兰色)，和平滑肌细胞着染的α-平滑肌肌动蛋白(红色)。所有显微照片中，栏距等于10μm。
图28：免疫磁珠(a)和FACS(b)得到的心肌Lin-c-kitPOS细胞的鉴定和生长。A，b，Lin-c-kitPOS细胞在NSCM中被评定为心肌细胞谱系的胞浆蛋白阴性；显示PI染色的核(兰色)和c-kit抗体标记的c-kit(绿色)。c-f，在DM和PI中，由紫色μm荧光显示培养的细胞，它们的核显示Nkx2.5(c)、MEF2(d)、GATA-4(e)和GATA-5标记。G、h、NSCM选择干细胞并以低密度(g)发育成小的单个克隆(h)。栏距＝10μm。
图29：克隆细胞的自身更新和多潜能。a，克隆中的c-kitPOS细胞：核＝兰色，c-kit＝绿色(箭头)。B，3个中的两个c-kitPOS细胞(绿色，箭头)在核(兰色)中表达Ki67(紫色，箭头)。c，d，Ki67阳性(c)中期染色体(红色)。d，c-kitPOS细胞细胞中，由Ki67和PI(紫色)标记的中期染色体。e-h，克隆中，M(e)、EC(f)、SMC(g)和F(h)分别被心肌肌球蛋白、因子VIII、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白着染。核＝兰色。存在Lin-c-kitPOS细胞(绿色，箭头)。栏距＝10μm。
图30：克隆发生细胞和球形克隆。a，NSCM悬液中的球形克隆(箭头)。b，克隆内的c-kitPOS和阴性细胞簇。核＝兰色。c，有包装的细胞核(兰色)和大量巢蛋白(红色)的球形体。d，球形体内聚集未降解的巢蛋白(红色)。核＝兰色。e，将球形体铺敷MD中，其中有移出圆的细胞。f-h，迁移出球形体并分化的M(f)、SMC(g)和EC(h)具有分别被心肌肌球蛋白、因子VIII、α-平滑肌肌动蛋白着染的胞浆(红色)。核＝兰色。栏＝10μm。
图31：心肌修复。a-c，梗塞后治疗的大鼠(MI)的心肌生成(a，b，箭头)。新的M＝肌球蛋白(红色)；核＝黄-绿色。注射位点(箭头)。c，梗塞未治疗大鼠的心肌瘢痕形成(兰色)。*多余的心肌细胞。d-l，M(f，肌球蛋白)和冠状血管(i，EC＝因子VIII；1，SMC＝α-平滑肌肌动蛋白)被BrdU(绿色)阳性细胞(e，h，k)识别。兰色核＝PI(d，g，j)。m-t，心肌细胞在第20天(o，p，s，t)比第10天(m，n，q，r)分化得更好。m-p：肌联蛋白43＝黄色(箭头)，q-t：N-钙粘着蛋白＝黄色(箭头)；肌球蛋白＝红色。核＝兰色。BrdU＝绿色(箭头)。栏距＝1mm，100μm，10μm(d-t)。
图32：新产生的心肌细胞。a，酶裂解的来自再修复心肌带的细胞。心肌细胞＝红色；核＝兰色。b-e，新心肌细胞的分化。肌联蛋白43＝黄色(b，c)；N－钙粘着蛋白＝黄色(d，c)；心肌肌球蛋白＝红色。BrdU＝绿色；核＝兰色(箭头)。栏距＝10μm。
图33：心肌细胞的机械性质。a-d，分别由梗塞后治疗的大鼠的再生的，和余留心肌得到的新的(N)和多余(S)的心肌细胞；R＝舒张的，C＝收缩的。e-h，对N(e，h)和S(f，h)心肌细胞的细胞缩短和缩短速度的刺激作用。i-l，结果以均数±标准差表示。*表示与S相比p<0.05。
图34：大鼠心脏中的原始细胞。月龄为22个月的Fisher大鼠的左心室心肌切片，A，碘化丙锭(PI)兰色荧光显现的核。B，绿色荧光记录c-kit阳性细胞，C，绿色和兰色荧光显示PI和c-kit的组合。α-平滑肌肌动蛋白抗体着染的红色荧光识别心肌细胞胞浆。聚焦显微镜术；栏距＝10μm。
图35：c-kitPOS细胞的FACS分析。得自雌性Fisher344大鼠左心室心肌细胞的二元分配，显示与细胞DNA相比c-kit的表达水平。细胞以106/ml悬浮在PBS中。用ELITE ESP流式细胞仪/细胞分选仪(Coulter Inc.)检测细胞荧光，其中使用与氦-镉激光结合的氩离子激光(488nm发射)，发射紫外光。箭头指示c-kit的最小域值再生水平。为了进行FACS分析，将细胞与藻红素(R-PE)结合的大鼠单克隆c-kit抗体(Pharmingen)一起保温。使用R-PE异型标准品作为阴性对照。
图36：NSCM(B)中，心肌c-kitPOS细胞(A)和心肌c-kitPOS细胞培养物的收集方法。A，使表达c-kit表面受体的未增殖细胞与c-kit抗体接触，然后再与包被了IgG抗体的免疫磁珠接触。用磁力收集细胞并在NSCM中培养。B，免疫磁珠连接到c-kitPOS细胞的表面(箭头)。显现不存在c-kitPOS细胞。相差显微镜；栏距＝10μm。
图37：用免疫磁珠收集的新分离的细胞中的c-kit蛋白质。c-kit抗体的绿色荧光显示c-kit蛋白质。红色荧光显示附着于细胞上的小珠。兰色荧光反映核的PI标记。因此，发现用磁珠分离的细胞是c-kitPOS细胞。聚焦显微镜术；栏距＝10μm。
图38：心肌细胞分化的转录因子。除去磁珠后，或FACS分离后立即进行涂片和细胞染色，以检测Nkx2.5、MEF2和GATA-4。面板A-C中的兰色荧光相当于核的PI标记。核中的紫色荧光反映Nkx2.5(A)、MEF2(B)和GATA-4(C)的表达。聚焦显微镜术；栏＝10μm。
图39：骨骼肌分化的c-kitPOS细胞和转录因子。面板D-F用核内(红色荧光，PI标记)的绿色荧光显示MyoD(D)、肌细胞生成素(E)和Myf5(5)的阳性对照(C2C12成肌细胞系)。c-kitPOS细胞的这些骨骼肌转录因子为阴性。聚焦显微镜术；栏距＝10μm。
图40：c-kitPOS细胞在分化培养基(DM)中的生长。会合细胞单层得自铺板的c-kitPOS细胞。用DNA酶I轻轻消化以除去免疫磁珠。该步骤降解磁珠和抗IgG抗体间的短DNA接头。相差显微镜术；栏距＝20μm。
图41：DM中的成环细胞核。该视野中的大部分核中表达了Ki67(紫色荧光)。兰色荧光反映核的PI标记。聚焦显微镜术；栏距＝10μm。
图42：c-kitPOS衍生的细胞的生长速率。细胞在P2和P4时的指数生长曲线；tD，细胞数目倍增所需要的时间。每个点相当于5或6次对检测。垂直栏，SD。
图43：心肌Lin-c-kitPOS细胞的鉴定和生长。在P3期的DM中，M(A)、SMC(C)和EC(D)分别被心肌肌球蛋白、因子VIII、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白(因子VIII阴性)着染。核＝红色。栏距＝10μm。
图44：神经细胞的胞浆标志。面板A-C显示P1期DM中的细胞(红色荧光，α-平滑肌肌动蛋白；红色荧光，PI标记)。面板D-F以胞浆(兰色荧光，PI标记)中的绿色荧光显示MAP1b(D，神经原2A细胞系)、神经微丝200(E，神经原细胞系)和GFAP(F，III型星形胶质细胞，克隆C8-D30)的阳性对照。对于这些神经蛋白质，c-kitPOS衍生的细胞为阴性。聚焦显微镜术；栏距＝10μm。
图45：成纤维细胞的胞浆标志。面板A-C显示NSCM中未分化的细胞(绿色荧光，c-kit；兰色荧光，PI标记)。面板D-F以胞浆(兰色荧光，PI标记)中的红色荧光显示纤连蛋白(D)、I型原胶原蛋白(E)和波形蛋白(F)的阳性对照。聚焦显微镜术；栏距＝10μm。
图46：FACS分离的c-kit细胞：克隆发生细胞的多潜能性。克隆中，M(A)、EC(B)、SMC(C)和F(D)分别被心肌肌球蛋白、因子VIII、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白着染。兰色荧光为核的PI标记。呈现Lin-c-kitPOS细胞(绿色荧光，箭头)。聚焦显微镜术；栏距＝10μm。
图47：早期分化阶段的心肌细胞谱系。A，B，早期分化的细胞胞浆中巢蛋白(nestin)克隆(绿色荧光)的表达。C，D，发育的细胞(箭头)中巢蛋白(绿色，C)和心肌肌球蛋白(红色，D)的表达。E，F，发育的内皮细胞(箭头)中巢蛋白(绿色，E)和因子VIII(红色，F)的表达。G，H，发育的平滑肌细胞(箭头)中巢蛋白(绿色，G)和α-平滑肌肌动蛋白(红色，H)的表达。聚焦显微镜术；栏距＝10μm。
图48：梗塞大小和心肌修复。A，第10天，冠状动脉阻塞导致未处理和处理的大鼠左心室心肌细胞数分别丢失49％和53％。第20天，冠状动脉阻塞导致未处理(MI)和处理的(MI-T)大鼠左心室心肌细胞数分别丢失55％和70％。SO，假手术的动物。*与SO相比p<0.05。B，经细胞移植(MI-T)处理的动物，冠状动脉阻塞后第10和20天(d)，心室壁梗塞区域内新形成的心肌的百分比。*对10天p<0.05。C，D，形态学检测细胞移植后第10和20天新形成的心肌的量(实线栏)。阴影栏和交叉阴影栏分别显示梗塞后保留的(R)和丢失的(L)心肌层。生成的组织(F)以同样量增加了保留心肌(R+F)，并减少了丢失心肌(L-F)。因此，心肌修复减小了各组经细胞移植处理的大鼠的梗塞面积。*与MI相比p<0.05。
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与MI-T中Lo和Fo相比p<0.05。
图49：心肌修复。A，B，两只处理的梗塞心脏中的再生心肌带。红色荧光相当与心肌肌球蛋白着染的新形成的心肌细胞。黄绿色荧光反映核的PI标记。兰色荧光(箭头)显示心室壁梗塞区域内胶原蛋白的积聚灶。聚焦显微镜术；栏距＝100μm。
图50：毛细血管的新生物。根据内皮细胞的BrdU标记识别移植细胞在毛细血管中的分化。A，核的PI标记(兰色)；核的BrdU标记(绿色)。C，BrdU标记的BrdU标记的毛细血管内皮(红色)和内皮细胞核(兰色和绿色)。聚焦显微镜术；栏距＝10μm。
图51：再生心肌的体积组成。间隔10和20天期间，心肌细胞(M)、毛细血管(Cap)(和小动脉(Art)的体积分别增加25％、62％和140％。相反，I型(C-I)和III型胶原蛋白(C-III)的百分体积分别减少73％和71％。结果以均数±标准差表示。*表示相对与第10天p<0.05。
图52：再生心肌的细胞增殖。间隔10和20天期间，心肌细胞(M)、内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)的部分分别增加25％、62％和140％。相反，I型和III型胶原蛋白的百分体积分别减少73％和71％。结果以均数±标准差表示。*表示相对于第10天p<0.05。
图53：BrdU标记对再生心肌细胞的识别。A，D，PI的兰色荧光显示核。B，E，绿色荧光显示核的BrdU标记。C，F，用α-心脏辅肌动蛋白(C)或α-肌节肌动蛋白(F)的红色荧光识别心肌细胞胞浆。在新的心肌细胞中，暗和亮兰色荧光反映心肌细胞核的PI和BrdU标记的组合(C，F)。聚焦显微镜，栏距＝10μm。
图54：时间对新形成的心肌细胞数目和体积的影响。在10至20天的间隔期间，发育的心肌细胞显著增加了大小。但细胞数目基本上保持恒定。第20天比10天大小分布宽。
图55：时间对新形成的冠状血管发育的影响。10至20天期间，新形成的小动脉(Art)和毛细血管的数目密度显著增加。结果以均数±标准差表示。*表示与第10天相比p<0.05。
图56：梗塞心室中多余的心肌细胞。A，B，从左心室和心室内间隔保留的活组织中分离的肥大心肌细胞。红色荧光相当于心肌肌球蛋白抗体染色，兰色荧光相当于PI染色。细胞边缘的黄色荧光反映连接蛋白(A)和钙粘着蛋白(B)。聚焦显微镜术；栏距＝10μm。
图57：细胞移植和超声波心动描记。心肌再生减小了心肌扩张(A)，对壁的厚度和存活蛋白质没有影响，增加了心室梗塞区域的厚度(C)并改善射血分数(D)。SO＝假手术；MI＝未处理的梗塞；MI-T＝处理的梗塞。结果为均数±标准差。*与SO相比p<0.05，**与MI相比p<0.05。
图58：超声波心动描记示踪。未处理的(A-C)和处理的梗塞大鼠(D-F)的二维影象和M型示踪。面板A和D相当于冠状动脉阻塞前的基线条件。面板B和D相当于手术后9天，没有(B)或存在(D)CPC注射。面板C和F相当于手术后19天，没有(C)或存在(F)CPC注射。面板F显示收缩的再现(箭头)。在本说明书实施例9的B部分(心肌梗塞和细胞移植)中，可以找到对该附图说明的支持。
图59：心室功能和壁压。细胞移植改善了心室功能，并减小了梗塞后心室壁的舒张压。SO＝假手术；MI＝未处理的梗塞；MI-T处理的梗塞；LVEDP左心室终末舒张压；LVDP＝左心室舒张压，+dP/dt压力升高速率；-dP/dt＝压力衰减速率。结果为均数±标准差。*与SO相比p<0.05，**与MI相比p<0.05。
图60：正常心肌的细胞移植。在P2期给假手术大鼠注射BrdU标记的细胞。20天后，只鉴定出很少未分化的细胞。A，C，绿色荧光显示核的BrdU标记。B，D，α-心肌肌动蛋白的红色荧光识别心肌胞浆。PI的兰色荧光显示核。注射的细胞中(箭头)，亮兰色荧光反映PI与BrdU标记的结合(B，D)。聚焦显微镜术；栏距＝10μm。
图61和62。迁移和侵入检测。结果表示为均数±标准差。*是指统计学显著性差异，即没有接触生长因子的细胞p<0.05。
图63：基质金属蛋白酶活性检测。由明胶受体所得到的凝胶的数码照片。
图64：显示表达生长因子受体的原始细胞。显示在手术后7-8小时和投用生长因子(处理的)或盐水(SO，未处理的)后2-3小时处死的假手术(SO)、梗塞处理(处理的)和梗塞后未处理(未处理的)的小鼠，心脏各个区域中c-kitPOS和MDR1POS细胞上c-met的分布。这些检测包括将要坏死的c-kitPOS和MDR1POS细胞。所使用的缩写词如下：A，心房；LV，左心室；R，远离梗塞的活的心肌；B，邻近梗塞的活的心肌；I，未存活的梗塞心肌。结果均表示为均数±标准差。
图65：显示循环原始细胞的定位。显示在手术后7-8小时和投用生长因子(处理的)或盐水(SO，未处理的)后2-3小时处死的假手术(SO)、梗塞后处理(处理的)和梗塞后未处理(未处理的)的小鼠，心脏各个区域中活的Ki67标记的c-kitPOS和MDR1POS细胞的百分数。所使用的缩写词如下：A，心房；LV，左心室；R，远离梗塞区的活的心肌；B，邻近梗塞区的活的心肌；I，未存活的梗塞心肌。结果均表示为均数±标准差。
图66：显示非循环(实线)和循环的(虚线；Ki67Y阳性核)心肌细胞的DNA含量分布频率。新的和老的心肌细胞均显示相当于2n个染色体的染色质。大于2n的DNA含量限于循环核。所检测的非循环核展现与二倍体心肌细胞差不多的荧光强度。取样包括600个新的心肌细胞，1000个老的心肌细胞和1000个淋巴细胞。
图67：显示心肌梗塞对心脏解剖和舒张负载的影响。结果以均数±标准差给出。***表示与假手术小鼠(SO)和未处理的梗塞小鼠(MI)相比p<0.05。MI-T是指处理的梗塞小鼠。
图68：显示心肌细胞大小的频率分布。在桥粒蛋白和层粘连蛋白抗体及PI染色的切片中，检测新产生的心肌细胞的体积。只包括有中心核的纵向排列的细胞。收集每个心肌细胞(假设为圆桶形状)中核的长度和直径以计算细胞体积。每个心脏检测400个细胞。
图69：显示心肌修复。基于假手术(SO)小鼠LV的体积和梗塞大小，未处理的小鼠为42％，处理的小鼠(MI-T)为67％，计算两组梗塞的小鼠(图9)将保留(R)和注定要丢失(L)的心肌体积。定量检测处理的小鼠新形成心肌的体积。心肌再生增加了保留的心肌的体积，并以同样量减少了心肌丢失的体积。因此，处理的小鼠的梗塞面积减小了15％。
图70A-J：分离和培养人心肌祖细胞的显微照片。接种人心肌样品以长出心肌(A和B)；大约第2周，移出环绕中心定位的细胞簇。呈现c-kit阳性(C；波形蛋白，绿色)、MDR1(E，品红，箭头)和Sca-1样蛋白(F，黄色，箭头)。有些核表达GATA4(H，，品红)，MEF2C(F，品红)。在过度生长的细胞和小的c-kitPOS细胞(绿色，箭头)中，检测出心肌细胞(G，α-肌动蛋白，红色)、SMC(H，α-SM肌动蛋白，品红)、EC(I；威勒布拉特因子，黄色)以及神经微丝200(J，白色)阳性细胞。
图72：人c-kitPOS细胞再生梗塞的心肌。72A-C是显微照片。72A显示注射人c-kitPO S细胞并于21天后处死的免疫缺陷小鼠的梗塞心脏。大的横切片显示梗塞内有一个再生的心肌带(箭头)。BZ，边缘区。下板中以高倍放大显示包括在矩形中的两个区域。核中的绿色荧光斑点显示新形成的心肌细胞中Alu探针的定位。肌节肌动蛋白识别新形成的心肌细胞(红色，箭头)。碘化丙锭标记心肌细胞核(兰色)。星点指示多余的心肌细胞。B和C：在免疫缺陷小鼠(B)和免疫抑制大鼠(C)中，梗塞并注射人细胞后21和14天再生心肌细胞的实例。α-肌节肌动蛋白鉴定新形成的心肌细胞。Alu(绿色)和BrdU(白色)标记心肌细胞核。星点指示多余的小鼠和大鼠心肌细胞。72D包括显示加样流程的苏木精和伊红(H-E)染色的切片；也提供用于检测再生的梗塞心肌中的人DNA的凝胶照片；人血液(人)和完整的大鼠心肌(大鼠)作为阳性和阴性对照。梗塞心肌中的大鼠MLC2v DNA的信号反映壁的心内膜下和/或心外膜下区域多余心肌细胞的存在(参见图72A-C)。72E和F，以及G和H显示同一视野的显微照片。新形成的心肌细胞(E-H；肌钙蛋白I，qdot 655，红色)表达GATA4(E；qdot 605，黄色。层粘连蛋白：qdot 525，白色)。用Alu标记心肌细胞核(F和和；绿色)。用心肌肌球蛋白重链检测发育的心肌细胞之间的连接蛋白43(I，qdot605，黄色，箭头)和N-钙粘着蛋白(J，qdot 605，黄色，箭头)。这些结构是Alu阳性的。某些新形成的心肌细胞显现肌节纹路(E-J)。A，B，E，F，I，J：梗塞的免疫缺陷小鼠，细胞移植后21天。C，D，G，H：梗塞的免疫抑制大鼠，细胞移植后14天。
图73：73A-F和H是显示冠状微血管和细胞融合的显微照片。人冠状小动脉具有SMC层(A-C，α-SM肌动蛋白，qdot 655，红色)。在D中，威勒布拉特因子显示C中小动脉的内皮衬层(qdot 605，黄色)。E和F：人毛细血管(威勒布拉特因子，qdot 605，黄色)。用Alu标记核(A-F，绿色)。73G显示人心肌血管发生的程度。结果为均数±标准差。H：可见再生心肌中的人X染色体(白色斑点，箭头)和梗塞中部区域的血管。在接近再生的人心肌细胞的边缘区，心肌细胞中存在小鼠X染色体(品红斑点；箭头)。除细胞融合外，核有不超过2个人X染色体。
图74：心肌再生和心脏功能。74A-C显示透壁梗塞的显微照片。74A中显示未处理大鼠的透壁梗塞(箭头)；下面板中以较高放大倍数显示矩形区域。死亡的心肌细胞没有核(死的，α-肌节肌动蛋白，红色)。结蹄组织细胞核(兰色)。超声心动图显示壁的梗塞区缺乏收缩(箭头)。B：处理的大鼠的透壁梗塞(箭头)；下面板中以较高放大倍数显示矩形区域。人心肌细胞(α-肌节肌动蛋白，红色)由ALu标记(绿色)。超声心动图显示壁的梗塞区域中存在收缩(箭头)。面板C以较高放大倍数显示处理的大鼠另一个梗塞透壁区域(箭头)，其中以Alu(绿色)标记梗塞中部区域再生的人心肌细胞(α-肌节肌动蛋白，红色)。超声心动图显示壁的梗塞区域中存在收缩(箭头)。74D是图解显示增加了突出部分的处理的大鼠心脏的心肌再生。如前面指出的，只使用超声心动术检测处理小鼠的收缩。1374E和F显示心肌再生对梗塞心脏解剖和功能的影响。数据以均数±标准差给出。*
Figure A200780013458D0027093938QIETU
分别与SO和MI比较p<0.05。
图75：显示c-kitPOS细胞的多潜能性。c-kitPOS细胞在各个不同的代(P)均能够获得心肌定型(GATA4阳性)并产生心肌细胞(α-肌节肌动蛋白阳性)、SMC(α-MS肌动蛋白阳性)和EC(威勒布拉特因子阳性)。结果以均数±标准差给出。
图76：超声心动图显示再生人心肌细胞的特征。梗塞和移植人心肌细胞后再生的心肌细胞和冠状小动脉；存在新形成的心肌细胞(A；心肌肌球蛋白重链，红色)、SMC(B，D，E；
α-MS肌动蛋白，品红)和EC(C，F，G；威勒布拉特因子，黄色)。白色荧光显示心肌细胞之间层粘连蛋白的分布(A)。面板D和E以及面板F和G显示同一视野。存在分散的SMC(D和E；箭头)和EC(F和G箭头)。分别在SMC和EC中检测到GATA6(D；核中的红色点)和Etsl(F；核中的品红点)。这些结构是Alu探针阳性的(绿色)。A-G：梗塞的免疫缺陷小鼠，细胞移植后21天。
图77：显示人心肌细胞的体积。梗塞小鼠和大鼠新形成的人心肌细胞的大小分布。
图78：为显示功能性感受态人心肌的显微照片。处理的小鼠的透壁梗塞(箭头)，其中梗塞中部区域的再生人心肌细胞是α-肌节肌动蛋白阳性(红色)。以Alu探针标记(绿色)人细胞核。超声心动图显示壁的梗塞区域存在收缩(箭头)。
图79：活化的CSC的返巢和移入。a，梗塞后24小时，表达EGFP的、GM活化的移生CSC的注射位点。12小时，有些活化的CSC是TdT标记的(b；品红，箭头)，24小时，有几个细胞为周期蛋白Ki67阳性(c；白色，箭头)。d，注射后12、24和48小时活化的CSC细胞的凋亡和增殖速率。数据以均数±标准差表示。**与24小时相比p<0.05。e，梗塞并注射细胞后48小时，在EGFP阳性心肌祖细胞(箭头)之间，和EGFP阴性受体细胞(箭头)之间表达连接蛋白43、N-钙粘着蛋白、E-钙粘着蛋白和 L-选择蛋白(白色)；心肌细胞被α-肌节肌动蛋白(红色)着染，成纤维细胞被前胶原着染(黄色)。f，凋亡的EGFP阳性细胞(TdT，品红，箭头)没有表达 L-选择蛋白(白色)。g，在完整的非梗塞心脏中，移植后一个月GM活化的移生CSC的注射位点，EGFP阳性(绿色)。核被PI着染(兰色)。
图80：血管再生。a，2周时梗塞后处理的心脏显示定位于多余心肌(箭头)和边缘带(BZ，箭头)内的新形成的冠状血管(上面板，EGFP，绿色)。也可见分支血管(开口箭头)。下面板(橘黄色)显示EGFP和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的定居。指出了血管的小直径。直径为180μm的血管有内部弹性层状体(***；IEL，品红)。在先存在的冠状血管是EGFP阴性(上面板)和α-SMA阳性的(下面板，红色，星号)。注射位点(SI)存在EGFP阳性细胞簇。α-肌节肌动蛋白(α-SA)标记心肌细胞。b，2周时，心外层多余的心肌含有几个大的再生冠状动脉(上面板，EGFP，绿色)，其表达EGFP和α-SMA(下面板，EGFP-α-SMA，橘黄色)。c，壁的中央区域梗塞的心肌显示再生的中间体和小冠状动脉(上面板，EGFP，绿色)，其表达EGFP和α-SMA(下面板，EGFP-α-SMA，橘黄色)。d，心脏中血管形成的量度，数值为均数±标准差。e，再生的冠状动脉中SMC和EC显示最多有两个X-染色体。EGFP-α-SMA，橘黄色。X-染色体，白色斑点。
图81：新形成的冠状血管是有功能活性的。a-f，2周(a-c)和一个月(d-f)时，位于处理的大鼠心外膜层的活的(a，f)和梗塞的(b-e)心肌中，大冠状动脉和其分支含有若丹明标记的葡聚糖(红色)，并具有EGFP阳性壁(绿色)。在活的心肌的梗塞区(b-e)和大多数血管周围(a，f)富含胶原蛋白(兰色)。指出了血管直径。面板e中血管和其分支被EGFP阳性细胞环绕，其位于梗塞的心肌内。面板f证明新形成的血管(EGFP阳性壁，绿色)与定居血管(EGFP阴性壁)的功能性整和。白色环界定吻合位点。g，心室解剖和梗塞大小。h，心室功能。左心室终末舒张压、LVEDP、LV舒张压和LVDP。数据以均数±标准差表示。未治疗的心肌梗塞，MI。治疗的心肌梗塞，MI-T。
图82：实验程序。结扎左前降支冠状动脉(LAD)，诱导持久性冠血管阻塞。利用两种形式的处理：1，注射总共80,000-100,000个克隆发生的EGFPPOSc-kitPOSCSC(未活化的CSC)；注射体内移植前每2小时体外用GF预处理的EGFPPOSc-kitPOSCSC。在结扎线的上方、外侧和下面，以及远离边缘带(BZ)的多个位点(黑色点)注射。MI，心肌梗塞。
图83：心肌干细胞死亡。a，注射后24小时，许多克隆发生的EGFP阳性(绿色)CSC被TdT标记(品红，箭头)。核被碘化丙锭标记(PI，兰色)。b，注射后12、24和48小时凋亡和增殖的速率。数值为均数±标准差。
图84：血管再生。a，一个月时，心外膜层的多余心肌细胞含有几个大的再生冠状动脉(上面板，EGFP，绿色)，其表达EGFP和α-SMA(下面板，EGFP-α-SMA，橘黄色)。b，心室壁中间区域的梗塞心肌显示有再生的大的中间体和小的冠状动脉(上面板，EGFP，绿色)，其表达EGFP和α-SMA(下面板，EGFP-α-SMA，橘黄色)。c，梗塞心肌中的表达EGFP(绿色)和威勒布拉特因子的再生毛细血管被EC特异性植物凝集素标记(白色)。
详细描述
本发明提供包括治疗有效量的体干细胞，或与选自干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)、体细胞衍生因子-1、青灰因子、血管内皮生长因子、巨嗜细胞集落刺激因子、粒细胞-巨嗜细胞刺激因子、肝细胞生长因子(HGF)、***或白介素-3或任何能够刺激和/或迁移干细胞的细胞因子结合的方法和/或药物组合物。细胞因子可以单独或与任何能够：刺激和/或迁移干细胞；维持早期和晚期红细胞生成(见下述)；活化单核细胞(见下述)、巨嗜细胞/单核细胞增殖；维持细胞增殖、游动性和存活(见下述)；处理心肌或血管状态的其他细胞因子或药剂，以及医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)联合投用。
本发明也提供包含引起心干细胞或心原始细胞迁移和/或增殖成循环组织或肌肉组织或循环肌肉组织，例如心肌组织，如心脏或血管，例如进或出心脏的静脉、动脉，如直接相接或随后进入心脏的动脉，例如主动脉的治疗有效量的一种或多种细胞因子的方法和/或药物组合物。
在一个优选方面，包括药物组合物在内的方法和/或组合物含有治疗有效量的两种或多种细胞因子。更具体地说，该方法和/或组合物较好含有有效量的肝细胞生长因子和***。
本发明药物组合物中的细胞因子，也可以包括已知参与维持早期和晚期红细胞生成的介体，例如α-lL-1和β-Ll-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL11和IL-13；集落刺激因子、血小板生成素、红细胞生成素、干细胞因子、jit3配体、肝细胞生长因子、α肿瘤坏死因子、白血病抑制因子、转化生长因子β1和β-3；以及α-巨嗜细胞炎性因子1、血管生成因子(成纤维细胞生长因子1和2、血管内皮生长因子)，以及以***形成细胞(血小板衍生的生长因子A、表皮生长因子、α和β-2转化生长因子、制癌蛋白M和***-1)，或神经元细胞(神经生长因子)(Sensebe，L.，et al.，Stem cell1997；15：133-43)为常用靶的介体、存在于血小板和巨核细胞中的VEGF多肽(Wartiovaara，U.，etal.，Thrmb.Haemost.，1998；80：171-5；Mohle，R.，Proc.Natl Acad Sci.，USA1997；94：663-8)、HIF-1(一种结合并刺激参予低氧反应的基因启动子的强力转录因子、内皮PAS区域蛋白1(EPAS1)、增强侧支功能的单核细胞衍生的细胞因子，例如单核细胞趋化性蛋白-1(MCP-1)。
在另一个优选方面，本发明的方法和/或组合物(包括药物组合物)包括与适当的用于治疗心和/或血管状态的药剂联合的、有效量的两种或多种细胞因子。
在一个优选方面，本发明的药物组合物是通过注射递送的。这些投用(递送)途径包括但不只限于皮下或包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹腔内、心肌内、透心内膜、透心外膜、鼻内途径，以及鞘内和灌注技术在内的胃肠道外途径。因此，优选的药物组合物是适于注射的剂型的。
当投用本发明的治疗组合物时，最好将其配制成可注射的单位剂量形式(溶液、悬液、乳液)。适于注射的药物配方包括无菌水溶液或分散液，以及用于重新构成可注射的无菌溶液或分散液的无菌粉末。载体可以是含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)，其适当的混合物和植物油的溶剂或分散液。
可以使用植物凝集素包被，以在分散剂的情况下维持所需要的粒度，并使用表面活性剂来保持流动性。也可使用非水载体如棉籽油、芝麻油、橄榄油、大豆油、玉米油、葵花子油，或者花生油和酯，例如十四酸异丙酯作为化合物组合的溶剂***。
另外，可以加入提高组合物的稳定性、无菌程度和等张性的各种添加剂，包括抗微生物的防腐剂、抗氧化剂、獒合剂和缓冲剂。可以使用各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等来预防微生物的作用。在许多情况下，可望包括糖、氯化钠等等渗剂。使用延迟吸收的制剂例如一硬脂酸铝和明胶延长可注射药剂的吸收。然而，根据本发明，可以使用任何与化合物相容的载体、稀释剂或添加剂。
必要时，可以在用于实践本发明的化合物中，掺入所需量的适当溶剂或各种不同量的其他成分，以制备无菌的可注射溶液。
为了使用包括治疗化合物的本发明的药物组合物，可给病人投用含有相容载体例如各种载体、佐剂、添加剂或稀释剂的可注射配方；或者可以以皮下慢释放的植入物或靶向传送***例如单克隆抗体、离子载体、聚合物基质、脂质体和微球的形式给病人投用用于本发明的化合物。
可以口服给病人投用本发明的药物组合物。常规方法包括以片剂、悬浮剂、溶液剂、乳剂、胶囊剂、粉末剂、糖浆剂等剂型投用化合物。优选口服或静脉内途径，并优选能够保留生物学活性的已知技术递送化合物。
在一个实施方案中，可以首先投用本发明的组合物，然后再进一步给药维持。例如，可以投用一种类型的本发明的组合物，然后进一步投用不同或相同类型的组合物。例如，可以静脉内注射本发明的组合物，使血液水平达到适当的水平。可以根据病人的条件，使用口服或其他给药形式维持病人的药物水平。
应注意的是，治疗病人一般要比小鼠或其他实验动物时间长，治疗的时间长度与疾病过程的时间长度和药物效力成正比。剂量可以是单一剂量或几天的多剂量，但最好是单一剂量。因此，可以不必做过多的实验，用本公开和本文所列文献及本领域已知的技术，由动物实验如大鼠、小鼠等按比例放大到人。
治疗的时间长短与病程长短和药物效力及被治疗的病人状况成正比。
药物组合物的量一般随被治疗的病人不同而变化。在一个优选实施方案中，每天给病人投用2 x 104-1 x 105个干细胞和50-500μg/kg细胞因子。虽然小鼠和人的心脏大小相差很大，但也给人2 x 104-1 x 105个干细胞应是足够的。然而，应该基于每个病人个体的因素精确确定有效剂量，这些因素包括体重、年龄、梗塞面积的大小和损伤的时间。因此，技术人员可以很容易地掌握给药剂量。确定组合物中化合物和所选择的添加剂、载体的量并按照本发明的方法给药。典型地，任何添加剂(除活性干细胞(S)和/或细胞因子(S)以外)都以0.001-50％(重量)的量存在(磷酸缓冲盐水溶液)，并且活性成分都以微克至毫克的等级存在，例如大约0.0001至5％(重量)，较好大约0.0001至1％(重量)，最好大约0.0001至0.05％(重量)，或者大约0.001至20％(重量)，较好大约0.01至10％(重量)，最好大约0.05至5％(重量)。当然，为了给动物或人投用组合物并选择特定的给药方法，最好在适当的动物模型如小鼠中测定致死剂量和LD50以确定毒性；确定组合物的剂量、其各成分的浓度和引发适当反应的给药时间。本领域技术人员根据本文公开和所引文献的知识，进行这样的确定并不需要作过多实验。另外，可以不需要过多实验确定连续给药的时间。
再者，本领域技术人员应该能够不经过多实验，确定用于与一种或多种细胞因子联合使用的适当药物制剂；本领域技术人员应该能够基于每个病人个体的因素精确确定有效剂量，这些因素包括体重、年龄、梗塞面积的大小和损伤的时间。因此，技术人员可以很容易地根据本公开和现有知识确定给药剂量。
本发明组合物的例子包括适于经口、鼻、肛管、子宫、胃内、黏膜(例如舌下、肺泡、牙龈、嗅觉和呼吸黏膜)等途径给药的液体制剂，例如投用悬浮液、糖浆或弛剂；以及适于胃肠道外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内给药(例如注射给药)的制剂，如无菌悬浮液和乳液。这样的组合物可以是与适当的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合的。这样的组合物也可以是冻干的。根据给药途径和所需制剂的不同，组合物可以含有辅助物质，例如润湿或乳化剂，pH缓冲剂、胶凝和黏度增强添加剂、防腐剂、香味剂和染料等。不经过多实验制备适当的制剂可以参见标准文献，例如列为本文参考文献的“REMINGTON＇S PHARMACEUTICAL SCIENCE”；第17版，1985。
本发明的组合物是作为液体制剂常规提供的，如可以是缓冲至适当pH的等渗水溶液、悬浮乳液或粘稠组合物。如果优选消化道吸收，本发明的组合物可以是丸剂、、片剂、胶囊等，“固体”形式，包括可按时释放并有液体填料的“固体”制剂，例如明胶包被的液体，明胶在胃内被消化后即可将药物送到肠。如果希望经鼻或呼吸(黏膜)给药，组合物可以是用挤压喷雾器、泵或气溶胶分配器给药。气雾剂通常是在压力下借助烃形成的。泵分液器较好是分配有刻度的剂量，特别是有颗粒大小的剂量。
本发明的组合物可以含有医药上可接受的香料和/或染料，以使它们更具吸引力，特别是在口服给药的情况下。粘稠组合物可以是凝胶、洗液、软膏、霜剂等剂型的(用于透皮给药)，一般都含有足够量的增稠剂，以使黏度从大约2500至6500cps，但更粘的组合物，甚至高达10,000cps的组合物也可以使用。粘稠组合物的黏度最好为2500-5000cps，超过这个范围将难以投用。然而，如果超过这个黏度范围，组合物可接近固体或明胶剂型，这样其可以作为吞服的药丸，很容易经口服消化。
一般液体制剂要比凝胶、其他粘稠组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体制剂有时更便于投用，特别是注射或口服。另一方面，可以在适当的黏度范围内配制粘稠组合物，以使药物与黏膜(例如胃和鼻黏膜的衬层)有较长的接触时间。
很明显，适当载体和其他添加剂的选择取决于给药途径和剂型的性质，例如液体剂型(无论被配制成溶液、悬浮液、凝胶还是另一种其他剂型)，或固体剂型(无论组合物被配制成丸剂、片剂、胶囊，还是按时释放或有液体填料的其他剂型)。
溶液、悬浮液和胶囊除含有活性化合物外，一般都含有大量的水(纯化水)。可以有小量的其他成分，例如pH调节剂(如NaOH碱)、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、润湿剂、胶凝剂(如甲基纤维素)香味剂和染料。组合物可以是等渗的，例如它们可以与血液和泪水有同样的渗透压。
可以使用氯化钠或其他医药上可接受的试剂，例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、聚乙二醇或其他有机或无机溶质矫正本发明组合物的等渗性。对于含有钠离子的缓冲液，最好使用氯化钠。
可以使用医药上可接受的试剂，使本发明的组合物的黏度保持在一定水平。优选甲基纤维素，因为该化合物很容易得到并易于使用。其他适当的增稠剂包括黄元胶、羧甲基纤维素、羟丙剂纤维素、卡波母等。关键的是所使用的量要能够达到选择的黏度。一般加入这样的增稠剂，即可以由溶液制成粘稠组合物。
可以利用药学上可接受的防腐剂增加组合物的货架寿命。可以使用苯甲醇，也可以使用对羟基苯甲酸酯、乙基汞硫代水杨酸钠、氯丁醇或氯化卞烷铵。基于总重量，防腐剂的适当浓度为0.02％至2％，但根据所选用的试剂不同，浓度范围可以有所变化。
本领域技术人员将会理解到，所选择的组合物成分应是比活性化合物更具化学惰性的。对于熟悉化学和医药原理的人来说，这将不成问题，或者这是根据本公开及所引用的文献，参照标准教科书或经简单实验可以避免的问题。
按照一般可接受的方法混合各成分制备本发明的组合物。例如可以在弯管或其他标准装置中简单地混合各成分，以产生浓缩的混合物，然后加入水或增稠剂调整终浓度和黏度，也可以加入缓冲液控制pH，或加入其他溶质控制组合物的张力。一般pH可以是3-7.5。组合物的投用剂量可以由医学和兽医领域的技术人员按照常规技术，根据年龄、性别、体重、特定病人的条件及所投用的组合物剂型(例如固体或液体)等影响因素全面考虑。可以根据本公开和所引述的文献以及现有技术，不经过多的实验确定人或其他哺乳动物的用药剂量。
初始给药和继后连续给药的摄生方法也可以不同，一般可包括初始给药，然后接着后续给药。尽管如此，但本领域技术人员可以根据本公开和所引述的文献以及现有技术来确定。
使用本发明的医药组合物治疗的心血管疾病包括但不只限于动脉硬化、缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏病、冠心病、动脉炎症和动脉、小动脉和毛细血管的其他疾病或相关病痛。因此，本发明涉及单独或与一种或多种细胞因子联合投用如本文公开的干细胞，以治疗或预防包括心脏无力在内的任何一种或多种上述病理状况、用于这些治疗和预防的组合物、单独或与一种或多种如本文公开的细胞因子联合使用本文公开的干细胞、配制这样的组合物，以及包括单独的或与一种或多种如本文公开的细胞因子联合的，如本文公开的干细胞的试剂盒，以制备这些用于治疗或预防的组合物。最适于治疗这些病理状况的优选途径包括皮下或胃肠道外途径，包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹腔内、透心外膜、透心外膜、鼻内等注射途径，和/或鞘内给药或灌注技术。
在本发明的一个实施方案中，提供了治疗血管病变和疾病，包括冠状动脉或血管闭塞或阻断的方法和组合物。本发明提供可用于治疗或与心脏旁路外科联合用于治疗的方法和组合物。本发明涉及向有需要的心肌区域提供分离、扩增、活化和移植或递送活化的干细胞，较好是活化的心肌干细胞。这样的递送或移植可使用本文描述的或本领域已知的方法完成，包括但不只限于使用NOGA导管***使被治疗的区域可能显现，并且通过与导管***联系的可回缩的针递送治疗剂。本领域技术人员将会理解到，其他有用的递送或移植方法也可用于本发明，包括Dawn，2005(其全文列为本文参考文献)中描述的方法。
在本发明的另一个实施方案中，由需要治疗的病人体内收获心肌组织。本发明提供分离干细胞，较好是心肌干细胞，最好是c-kitPOS心肌干细胞，然后体外培养和增殖这些细胞的方法。
在本发明的另一个实施方案中，提供用于培养和扩增的干细胞，较好是心肌干细胞，最好是c-kitPOS心肌干细胞的培养基。这样的培养基可以包括DMEM/F12、病人血清、胰岛素和***钠。在一个实施方案中，培养基可进一步包括一种或多种人重组bFGF、人重组EGF、尿苷和肌苷。
在一个实施方案中，培养基的成分可以以下列范围存在：
成分                   终浓度
病人血清              5-20％重量
人重组bFGF            10-100ng/ml
人重组EGF             10-100ng/ml
胰岛素                220μg/ml
转铁蛋白              2-20μg/ml
***钠              2-10ng/ml
尿苷                  2.24-2.44mg/ml
肌苷                  0.27-2.68mg/ml
在另一个实施方案中，可以如本领域已知的取代培养基的成分。例如，可以用***取代胰岛素。可以用其他核苷酸，例如腺苷、鸟苷、胸苷和胞苷的混合物取代尿苷和肌苷。
在本发明的另一个实施方案中，培养和扩增心肌干细胞期间，可以利用上述培养基在心脏损伤或梗塞的区域产生或造成新的心肌。
在本发明的另一个实施方案中，在移植或传送之前活化、培养和扩增的干细胞，较好是心干细胞，最好是c-kitPOS心干细胞。在一个实施方案中，干细胞与一种或多种细胞因子接触。适用的生长因子可以是上述的任何生长因子，包括但不只限于激活素A、血管紧张素II、骨形成蛋白2、骨形成蛋白4、骨形成蛋白6、心肌营养素-1、成纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子4、Flt3配体、神经胶质衍生的神经营养因子、肝素、肝细胞生长因子、***-1、***-II、***结合蛋白-3、***结合蛋白-5、白介素-3、白介素-6、白介素-8、白血病抑制因子、midkine、血小板衍生的生长因子AA、血小板衍生的生长因子BB、***、腐胺、干细胞因子、基质衍生的因子-1、血小板生成素、转化生长因子-α、转化生长因子-β1、转化生长因子-β2、转化生长因子-β3、血管内皮细胞生长因子、Wnt1、Wnt3a和Wnt5a(参见Ko，2006；Kanemura，2005；Kaplan，2005；Xu，2005；Quinn，2005；Aimeida，2005；Barnabe-Heider，2005；Madlambayan，2005；Kamanga-Sollo，2005；Heese，2005；He，2005；Beattie。2005；Sekiya，2005；Weidt，2004；Encabo，2004和Buytaeri-Hoefen，2004，这些文献的全文列为本文参考文献)。本领域技术人员可以选择一种或多种适当的生长因子。在一个优选实施方案中，干细胞与肝细胞生长因子(HGF)和/或***(IGF-1)接触。在一个实施方案中，HGF以大约0-400ng/ml的量存在。在另一个实施方案中，HGF以大约25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或大约400ng/ml的量存在。在另一个实施方案中，IGF-1以大约0-500ng/ml的良存在。在另一个实施方案中，IGF-1以大约25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或大约500ng/ml的量存在。
在另一个实施方案中，培养基中可以存在本文提供的一种或多种适当的生长因子，DMEM/F12、病人血清、胰岛素、转铁蛋白和***钠，以及一种或多种人重组bFGF、人重组EGF、尿苷和肌苷。期望培养基的成分可以以本文所述的量存在，但本领域技术人员将能够确定一种或多种生长因子的足够量，以使与之接触的任何干细胞得以活化。
在本发明的一个实施方案中，活化的干细胞，较好是心干细胞，最好是c-kitPOS心干细胞被传送或移植到需要治疗或修复的血管区域。例如，在一个实施方案中活化的干细胞被传送或移植到阻断或闭塞的心血管或动脉部位。在本发明的一个实施方案中，含有jlik-1表位的心肌干细胞被递送或移植到需要治疗或修复的区域。在另一个实施方案中，活化的干细胞在它所递送或移植到的部位形成动脉或血管。在另一个实施方案中，所形成的动脉或血管至少125、150、175、200、225、250或275μm。在本发明的另一个实施方案中，所形成的动脉或血管在需要治疗或修复的区域周围(包括环绕闭塞或阻断)提供“生物学旁路”，从而使血流、血压和循环得以恢复或改善。在本发明的另一个实施方案中，投用活化的干细胞可与其他治疗手段联合进行，其他治疗包括但不只限于投用一种或多种细胞因子。可使用本发明的组合物作为治疗剂应用。本文使用的术语“处理”和“治疗”包括治愈作用、缓解作用和预防作用。
本文使用的术语“病人”可以是任何脊椎动物，包括但不只限于人、哺乳动物、爬行动物和鱼。病人优先是哺乳动物如人，或者是驯养的哺乳动物，如狗、猫、马等，或者可生产的哺乳动物，如牛、羊、猪等。
本文所说的“体干细胞”或“干细胞”或“造血细胞”是指自体或同种异体干细胞，其可以从骨髓、外周血或其他来源得到。
本文所说的“成年”干细胞是指非胚胎来源的，不是从胚胎或胎儿衍生的干细胞。
本文所说的“最近损伤的心肌”是指开始治疗的一周内损伤的心肌。在一个优选实施方案中，心肌是在治疗开始的三天内损伤的。在另一个实施方案中，心肌是在开始治疗的12小时内损伤的。可以优先将干细胞单独或与本文公开的细胞因子联合应用于最近损伤的心肌。
本文所说的“损伤的心肌”是指心肌细胞已暴露于缺血状态。这些缺血状态可以由心肌梗塞或其他心血管疾病或相关病痛引起。缺乏氧的供应引起周围区域细胞的死亡，留下梗塞，最终形成瘢痕。
本文所说的“回归”是指向损伤的心肌和/或心肌细胞吸引和迁移体干细胞。
本文所说的“集合”是指将分化的体干细胞集合成功能性结构，即心肌和/或心肌干细胞、冠状动脉、小动脉和毛细血管。
因此，本发明涉及体干细胞的应用。这些干细胞小量存在于动物体内，但收集干细胞的方法是已知的。
在本发明的一个方面，所选择的细胞是谱系阴性的。术语“谱系阴性”的意思是本领域技术人员已知的，是指细胞没有表达具有特异性细胞谱系的抗原。
有利的是，所选择的谱系阴性干细胞是c-kit阴性细胞。本领域技术人员知道，术语c-kit是指干细胞表面上的受体，其常规被用于从周围其他细胞中鉴定和分离干细胞。
本发明进一步涉及应用于心脏的干细胞的治疗有效量或量。有效量是足以获得有益的效果或临床结果所需的量。可以分一次或多次投药，投用所说的剂量。例如给小鼠模型投用2 x 104-1 x 105个干细胞。虽然小鼠和人的心脏大小不同，但人使用这个数量范围的干细胞同样是足够的。可以根据每个病人个体的年龄、体重、梗塞面积大小和损伤的程度等因素，精确确定有效剂量。本领域技术人员特别是内科医生或心脏病学家，应该能够不经过多实验确定构成有效剂量的干细胞数目。
在本发明的另一个方面，干细胞被传递到心脏，特别是传递到梗塞的边缘区。本领域技术人员应该知道，梗塞区域是大体上可见的，将干细胞放在这个特定部位是可能的。
注射，特别是心肌内注射可有利地投用干细胞。本领域技术人员应该了解，因为心脏是一种功能性肌肉器官，所以这是传送干细胞的优选方法。向心脏注射干细胞不会由于心脏的收缩运动而造成干细胞的丢失。
在本发明的另一个方面，通过透心内膜和透心外膜途径投用干细胞。这个优选的实施方案是使干细胞穿过保护性外周膜，这对于保证细胞的心肌内注射是必要的。
本发明的优选实施方案包括使用基于导管的方法进行透心内膜注射。使用导管不需要使用打开胸腔的更具侵入性的方法。如本领域技术人员所知道的，使用有最小侵入性的方法(包括导管方法)将允许获得最佳恢复时间。
导管进入包括使用如NOGA导管或相似***这样的技术。NOGV导管***提供有用区域的电机图，以及可用于转送靶向注射的，或浸浴待治疗的靶向区域的可回缩针，从而使给药更为方便。根据本发明的任何一个实施方案，可使用这样一个***给药，以递送注射药物或提供治疗药物。本领域技术人员将会理解到，能够通过整合成象和导管递送***，提供靶向治疗的其他代用***也可用于本发明。可以参见Sherman，2003；Patel，2005；Perrin2003(均全文掺入本文作为参考文献)，找到关于如何使用NOGV和相似***的信息。
根据本发明的一个实施方案，要求干细胞迁移到梗塞区域并分化成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。本领域已知，为恢复结构和功能完整性，必须存在有这些类型细胞。修复梗塞或缺血组织的其他方法包括直接向心脏内植入这些细胞或将其作为培养的移植物使用，例如参见美国专利6,110,459和6,099,832号。
本发明的另一个实施方案包括增殖分化的细胞，并使细胞形成包括冠状动脉、小动脉、毛细血管和心肌在内的心脏结构。本领域技术人员知道，所有这些结构都是心脏的适当功能所必要的。文献中已显示，包括内皮细胞和平滑肌细胞在内的的细胞的移植，将允许植入的细胞在梗塞区域存活，但它们并不一定形成能够使心脏恢复全部功能的必要结构。恢复功能和结构完整性也是本发明的另一个方面。
发明的另一个方面涉及投用细胞因子。该细胞因子可选自一组细胞因子，或者可包括细胞因子的组合。干细胞因子(SCF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是本领域技术人员已知的，它们是引起干细胞向血流内迁移的刺激因子(Bianco et al，2001；Clutterbuck，1977；Kronenwett et al，2000；Laluppa et al，1997；Patchen et al，1998)。已显示体细胞衍生的因子-1能刺激干细胞呈趋化性转移，而青灰因子具有趋化性和化学激活性质(Caceres-Cortes et al，2001；Jo et al，2000；Kim and Broxmeyer，1998；Ikuta etal，1991)。估计血管内皮生长因子连接一个有利于转移期间迁移的旁分泌环(Bautz et al，2000；Janowska-Wieczorek et al，2001)。巨噬细胞集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞刺激因子以与SCF和G-CSF相同的方式发挥它们的功能，刺激干细胞的转移。已显示白介素-3刺激干细胞的转移，特别是与其他细胞因子联合使用时能力更强。
可通过能在体内表达细胞因子的载体投用细胞因子。适于体内表达的载体可以是本文参考文献中列出的，或现有技术中使用的载体或细胞或表达***，例如病毒载体，如腺病毒、痘病毒(例如痘苗、黄雀痘病毒、MVA、NNYVAC等)、慢病毒或DNA质粒载体；细胞因子也可以是通过这样一个载体或细胞或表达***或其他，如杆状病毒表达***、细菌载体如大肠杆菌和哺乳动物细胞如CSO细胞从体外表达的(例如参见美国专利6,265,189、6,130,066、6,004,777、5,942,235和5,833,975号)。对于干细胞制剂，细胞因子组合物可以通过所宣称的途径以外的途径给药；但对干细胞制剂，细胞因子组合物也可以通过所宣称的途径给药。
本发明的再一个方面涉及投用细胞因子的有效剂量或量。有效剂量是足以获得有益效果和预期结果的用量。所说的剂量可以一次或多次投用。在一个优选实施方案中，这个剂量应在治疗开始后的大约2-3天给予。但可以基于每个病人的体重、年龄和梗塞的大小、单一细胞因子或联合使用细胞因子以及梗塞的时间等因素精确确定。本领域技术人员，特别是内科医生或心脏病学家应该能够不经过多实验即可确定有效剂量。
本发明还涉及经注射，特别是皮下或静脉内注射递送治疗效剂量的细胞因子。本领域技术人员知道，皮下注射或静脉内递送是极其常见的，并且是递送特定剂量的有效方法，其允许药物的定时摄入和在血流中循环。
本发明的再一个方面包括所投用的细胞因子刺激病人的干细胞，并使干细胞转移到血流中。如前面提到的，所给予的干细胞能够促进所说的转移是本领域技术人员熟知的。如通过下面的实施例可以很清楚的，干细胞一旦转移到血流中，它们就可定居在心脏的受损区域。
本发明的再一个实施方案涉及迁移到受损区域并在心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞中分化的干细胞。本领域已知，为恢复结构和功能完整性，这些类型的细胞都必须存在。
本发明的再一个实施方案包括向梗塞区域投用有效量的一种或多种细胞因子。有效剂量是足以获得有益效果和期望的结果的量。所说的剂量可以一次或多次投用。但可以基于每个病人的具体影响因素，例如体重、年龄和梗塞的大小、单一细胞因子或联合使用细胞因子以及梗塞的时间等因素来精确确定。本领域技术人员，特别是内科医生或心脏病学家应该能够不经过多实验即可确定有效剂量。
本发明的再一个实施方案包括注射向心脏投用有效量的一种或多种细胞因子。细胞因子最好被递送到梗塞区域或接近梗塞区域。本领域技术人员应该知道，因为梗塞区域是大体上可见的，所以将干细胞放在这个特定部位是可能的。
细胞因子有利于注射，特别是通过心肌内注射给药。如本领域技术人员应该知道的，因为心脏是功能性肌肉，所以这种给药方法是递送细胞因子的优选方法。向心脏注射细胞因子确保它们不会因心脏收缩性运动而漏失。
根据本发明的另一个方面，透心内膜和透心外膜投用细胞因子。该优选的实施方案允许细胞因子透过保护性周围膜，所以心肌内注射的实施方案是必要的。
本发明的优选实施方案包括使用基于导管的方法进行透心内膜注射。使用导管可避免使用需要打开胸腔的、更具侵入性的方法。如本领域技术人员所知道的，使用有最小侵入性的方法(包括导管方法)将允许获得最佳恢复时间。
本发明的优选实施方案包括单次给药递送细胞因子。本发明的再一个实施方案包括多次向心脏投用同样剂量的细胞因子。本发明的再一个实施方案包括向心脏投用多剂量的细胞因子，以便形成一个梯度。
本发明的再一个实施方案包括增殖分化的细胞，并使细胞形成包括冠状动脉、小动脉、毛细血管和心肌在内的心脏结构。如本领域技术人员所知道的，所有这些结构对于心脏的适当功能都是很重要的。文献中已显示，移植包括内皮细胞和平滑肌细胞在内的细胞，将允许植入的细胞在梗塞区域存活，但它们并不一定形成能够使心脏恢复全部功能的必要结构。恢复功能和结构完整性也是本发明的另一个方面。
在本发明的实践中，投用干细胞和细胞因子是修复受损心肌的最有效方法。优先选择的用于本发明的干细胞是谱系阴性的。本领域技术人员知道，术语“谱系阴性”是指细胞没有表达具有特异性细胞谱系的抗原。有利的是，所选择的谱系阴性干细胞为c-kit阴性。本领域技术人员知道，术语c-kit是指干细胞表面上的受体，其常规被用于从周围其他细胞中鉴定和分离干细胞。
在某些实施方案中，给心脏应用、递送或投放有效剂量的细胞因子，或者将这些因子移植到心脏中。有效剂量是足以产生有益效果或预期的临床作用的量。所说的剂量可以一次或分多次投用。下述实施例中，在小鼠模型中投用2 x 104-1 x 105个干细胞。虽然小鼠和人的心脏大小不同，但人使用这个数量范围的干细胞同样是足够的。然而，可以根据每个个体的年龄、体重和梗塞面积大小和损伤的量等因素，精确确定有效剂量。本领域技术人员特别是内科医生或心脏病学家，应该能够根据本公开和现有技术知识，在不经过多实验的情况下，确定构成干细胞有效剂量的细胞数目和类型；再者，在关于制备配方和投用配方或其成分方面，可以提到实施例中的技术，并且本领域技术人员可以基于被治疗病人的体重，与实施例中应用于任何动物的剂量相比较，按比例放大成用于人的剂量。干细胞是骨髓或心肌干细胞；更好是成年骨髓(造血干细胞)或成年心肌干细胞或其组合，或心肌干细胞如成年心肌干细胞与另一类型的干细胞如另一类型的成年干细胞的组合。
在本发明的另一个方面，干细胞被递送到心脏，特别是到梗塞的边缘区域。本领域技术人员应该知道，因为梗塞区域是大体上可见的，所以将干细胞放在这个特定部位是可能的。
细胞因子有利于注射，特别是通过心肌内注射给药。如本领域技术人员应该知道的，因为心脏是功能性肌肉，所以这种方法是递送细胞因子的优选方法。向心脏注射细胞因子确保它们不会因心脏收缩性运动而漏失。
在本发明的另一个方面，透心内膜和透心外膜投用细胞因子。该优选的实施方案允许细胞因子透过保护性周围膜，所以心肌内注射的实施方案是必要的。
本发明的优选实施方案包括使用基于导管的方法进行透心内膜注射。使用导管可避免使用需要打开胸腔的、更具侵入性的方法。如本领域技术人员所知道的，使用有最小侵入性的方法(包括导管方法)将允许获得最佳恢复时间。
本发明的实施方案包括投用细胞因子。细胞因子可选自一组细胞因子，或者可包括细胞因子的组合。
本发明的另一个方面包括投用治疗有效剂量的细胞因子。有效剂量是足以产生有益效果或预期的临床作用所需的量。所说的剂量可以一次或分多次投用。在一个优选实施方案中，剂量应在治疗开始后的大约2-3天给予。但可以基于每个病人的具体因素例如体重、年龄和梗塞的大小、单一细胞因子或联合使用细胞因子以及梗塞的时间等因素作出精确确定。本领域技术人员，特别是内科医生或心脏病学家，参照本公开和现有技术的知识，应该能够不经过多实验即可确定细胞因子的足够量。
注射，特别是皮下或静脉内注射递送治疗效剂量的细胞因子。本领域技术人员知道，皮下注射或静脉内递送是极其常见的，并且常常是递送特定剂量药物的有效方法，这种给药方式允许药物的定时摄入和在血流中循环。
本发明的再一个方面包括所投用的细胞因子刺激病人的干细胞，并引起干细胞转移到血流中。如前面提到的，所给予的干细胞能够促进所说的转移是本领域技术人员熟知的。再者，干细胞一旦转移到血流中，它们就定居在心脏的受损区域。因此，某些实施例中，移植的干细胞和迁移的干细胞迁移到梗塞区域并分化成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。本领域已知，存在这些类型的细胞有利于恢复结构和功能完整性。
本发明的再一个实施方案包括增殖分化的细胞，并使细胞形成包括冠状动脉、小动脉、毛细血管和心肌在内的心脏结构。如本领域技术人员知道的，所有这些结构都是心脏发挥适当的功能所必要的。文献中已显示，包括内皮细胞和平滑肌细胞在内的的细胞的移植，将允许植入的细胞在梗塞区域内存活，但它们并不一定形成能够使心脏恢复全部功能性的必要结构。可以于体内产生心脏结构，然后以移植物的形式移植；移植物可以是单独的干细胞，或这是干细胞与本公开所说的至少一种细胞因子的联合，例如成年心脏干细胞或造血干细胞如成年心脏和/或成年造血干细胞，或成年心脏干细胞与另一类型的干细胞例如另一类型的成年干细胞的联合。体内产生和/或再生心肌的方法是可以在细胞因子的存在下，掺入体外培养的体干细胞和心脏组织。体干细胞分化成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞，并且体外增殖形成心肌组织和/或细胞。这些组织和细胞可以集合成包括动脉、小动脉、毛细血管和心肌的心脏结构。然后可以将体外形成的组织和/或细胞通过移植物移植到病人体内，以恢复结构和功能完整性。
另外，被移植的组织来源可以形成用于心脏移植物的组织的其他来源。以前也出现过的，恢复或部分恢复心脏组织的功能和结构完整性是本发明的另一个方面。
因此，在其他方面，本发明包括制备组合物例如医药组合物的方法，该组合物包括体干细胞和/或至少一种细胞因子，其被用于治疗心血管疾病或状态或心脏状态。
还借助下列非限制性的实施例描述了本发明，以便更好地了解本发明及其许多优点。
下列实施例中的所有材料、试剂、化学物质、检测方法、细胞因子、细胞因子、抗体和各种物品都是通过供应商容易得到的，供应商包括但不只限于Genzyme、Invitrogen、Gibco BRL、Clonetics、Fisher Scientific、R & D Systems、MBL Intenational Corporation、CN Biosciences Corporate、Sigma Aldrich和CedarLane Laboratories，Limited。
例如，干细胞因子以SCF(多种剂型的重组人、重组小鼠SCF，和各自的抗体)的名字得自R & D Systems(614McKinley Place N。E；Minneapolis，MN 55413)；粒细胞集落刺激因子以G-CSF(多种剂型的重组人、重组小鼠SCF，和各自的抗体)的名字得自R & D Systems；
干细胞抗体以SCFA-1的名字得自MBL Intenational Corporation(200 Dexter Avenue，Suite D，Watertown，MA02472)；
多抗性抗体以Anti-MDR的名字得自CNBiosciences Corporate；c-kit抗体以c-kit(Ah-1)多克隆抗体的名字得自CN Biosciences Corporate(Merck KgaA的分支机构，德国Darmstadt，公司总部位于10394Pacific Center Court，San Diego，CA92121)。
具体实施方式
实施例1：造血干细胞修复梗塞的心肌
A.收获造血干细胞
从表达增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的雄性转基因小鼠的股骨和胫骨收获骨髓。外科手术除去股骨和胫骨后，离移肌肉并在表面上切掉骨的上和下表面，收集侵润骨髓的缓冲液。在管中例如1.5mlEpindorf管中收集含有缓冲液的液体和细胞。将骨髓细胞悬浮在含有5％胎牛血清(FCS)PBS中，并在冰上与对下列造血谱系特异的大鼠抗小鼠单克隆抗体保温：CD4和CD8(T淋巴细胞)、B-220(B淋巴细胞)、Mac-1(巨嗜细胞)、GR-1(粒细胞)(Caltag Laboratories)和TER-119(红细胞)(Parmaingen)。在PBS中淋洗细胞，并与羊抗大鼠免疫球蛋白(Polysciences Inc.)包被的磁性小珠一起保温30分钟。用生物磁除去谱系阳性细胞(Lin+)并用ACK-4-生物素(抗c-kit单克隆抗体)着染谱系阴性细胞(Lin-)。在PBS中淋洗细胞，用链酶抗生物素连接的藻红蛋白(SA-PE)(Caltag Lab.)着染，并使用FACS装置(Becton Dickinson)以荧光激光细胞分类术进行分选。EGFP和ACK-4-生物素-SA-EP的刺激出现在488nm波长。Lin-细胞被分为c-kit阳性(c-kitPOS)和c-kit阴性(c-kitNEG)，两者的染色强度有1-2log的差异(图1)。将c-kitPOS细胞以1 x104至1 x 105的浓度悬浮在5μm PBS中，并将c-kitNEG细胞以1 x 105的浓度悬浮在5μm PBS中。
B.诱导小鼠的心肌梗塞
按照Li等人所述方法诱导两个月龄雌性C57BL/6小鼠的心肌梗塞。梗塞后的3至5小时，重新打开小鼠的胸腔，将含有2.5μl Lin-c-kitPOS细胞的PBS溶液注射到梗塞边缘活心肌的前、后面(图2)。使用左侧未注射或者注射了c-kitNEG细胞的心肌梗塞小鼠，以及假手术小鼠，也就是打开胸腔但是并没有诱导心肌梗塞的小鼠作为对照组。手术后9±2天后处死所有小鼠。实验原始记录已被学院评论委员会认可。实验结果以平均值±SD给出。通过Student＇s t检验和bonferroni方法(Scholzen and Gerdes，2000)确定两组检测之间的差异显著性和进行多重比较。当P<0.05，差异性显著。
在雄性小鼠梗塞的左心室***注射Lin-c-kitPOS骨髓细胞，导致心肌再生。围梗塞区域是梗塞边缘的活心肌区域。30只小鼠中有12只心肌梗塞得到了修复。梗塞区域再生失败归因于向每分钟跳动600次(bpm)的组织中移植细胞的难度很大。然而，对供体骨髓细胞Y染色体上组织相容性抗原的免疫反应，说明某些雌性受体修复不够。紧密包裹的心肌细胞占梗塞区域的68±11％，从心室的前面延伸到后面(图2A-2D)。在注射Lin-c-kitNEG细胞的小鼠中没有发现新生的心肌细胞(图2E)。
C.心室功能的检测
用水合氯醛(400mg/kg体重，，腹腔注射)麻醉小鼠，从右颈动脉***压力换能器的一个微型头，在封闭的胸腔中测量左心室(LV)压和LV+与-dp/dt，以确定是否来自HSC移植的心肌细胞对于心室功能有影响。统计中，将未经注射或者注射了Lin-c-kitNEG细胞的心肌梗塞小鼠结合。与假实验组相比较，梗塞组的小鼠表现出心力衰竭指征(图3)。用Lin-c-kitPOS细胞处理的小鼠，左心室终末舒张压降低36％，左心室舒张压和LV+和-dp/dt分别升高32％，40％和41％。
D.细胞增值和EGFP检测
腹腔动脉内插管，在舒张期，心脏注射氯化镉(CdCl2)，对心肌逆行灌注10％缓冲的***。用苏木精和伊红着染，从左心室底端到顶端得到的三个组织切片。冠脉闭塞后9±2天，从大体和组织学上看，心室的梗塞部分是很容易识别的(图2A)。检测了各切片中界定梗塞区的心内膜和心外膜表面，以及整个左心室心内膜与心外膜的长度。随后，计算出商数，得到每种情况下梗塞程度。这是使用与显微镜连接的图像分析仪在4倍放大情况下完成的。在未处理的小鼠，限定梗塞区的心内膜和心外膜周围部分没有差异，为78±18％(n＝8)、用Lin-c-kitPOS细胞处理的小鼠为75±14％(n＝12)，或者经过Lin-c-kitNEG细胞处理的为75±15％(n＝11)。
为了说明是否Lin-c-kitPOS细胞引起了心肌细胞再生，连续4至5天给小鼠服用BrdU(按每公斤体重50mg，腹腔注射)，然后处死，检测在积极生长时期累积的细胞***。将切片与抗BrdU的抗体一起保温，然后检测S期心肌细胞核的BrdU标记。此外，用兔多克隆抗小鼠Ki67抗体(Dako公司)处理样品后，测定细胞核中Ki67的表达(Ki67可以在G1，S，G2期和早期有丝***期的细胞中表达)。用FITC-结合的羊抗兔IgG作为第二抗体(图5和图6)。用兔的多克隆抗GFP抗体(Molecular Probe)检测EGFP。用小鼠的多克隆抗心肌球蛋白重链(MAB1584，Chemicon)，或小鼠的抗α-肌节肌动蛋白抗体(clone5C5；Sigma)识别心肌细胞，用小鼠抗人因子VIII多克隆抗体(Sigma)识别内皮细胞，用小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白多克隆抗体(clonelA4；Sigma)识别平滑肌细胞。细胞核用10μg/ml碘化丙啶(PI)染色。以聚焦显微镜观察得到BrdU与Ki67标记的心肌细胞(M)、内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)核的百分数。这可以将标记的细胞核数除以检查到的细胞核总数来完成。每个细胞群中，加样的细胞核数如下：BrdU标记：M＝2903，EC＝2153，SMC＝4877；Ki67标记：M＝3771，EC＝4051，SMC＝4752。计数EGFP标记的细胞数：M＝3278，EC＝2056，SMC＝1274。在每种情况下，再生心肌组织中心肌细胞的比例，以心肌肌球蛋白染色细胞所占据的区域除以梗塞区域代表的总区域来确定。分别根据BrdU和Ki67标记检测发现，心肌细胞增殖比内皮细胞高93％(p<0.001)和60％(p<0.001)，比平滑肌细胞高225％(p<0.001)和176％(p<0.001)。
根据EGFP的表达确定所形成的心肌细胞的来源(图7和8)。EGFP表达受到细胞浆和新生成的心肌细胞细胞核中Y染色体的限制。EGFP与标记特异性蛋白质的心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞相结合。这就可以识别每种心脏细胞的种类，辨别出冠状血管中的内皮细胞和平滑肌细胞(图5、7、8)。新生成的心肌细胞，内皮细胞和平滑肌细胞的EGFP表达分别是53±9％(n＝7)，44±6％(n＝7)，49±7％(n＝7)。这些数据与移植了表达EGFP的Lin-c-kitPOS骨髓细胞的部分符合，44±6％(n＝6)。供体转基因小鼠的心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的EGFP表达平均值为54±8％(n＝6)。
E.Y染色体的检测
为了进行原位杂交荧光(FISH)分析，使切片与含有70％二甲基甲酰胺的变性溶液相接触。乙醇脱水后，使切片与CEP Y(随体III)光谱绿色(Vysis)DNA探针杂交3小时。细胞核被PI染色。
在存活的心室部位没有检测到Y染色体。但在新生成的心肌细胞中可以检测到Y染色体，说明Y染色体来源于注射的骨髓细胞(图9)。
F.转录因子和连接蛋白43的检测
将组织切片与兔多克隆抗MEF2(C-21，Santa Cruz)、兔多克隆抗GATA-4(H-112，SantaCruz)、兔多克隆抗Csx/Nkx2.5(得自Izumo博士)和兔多克隆抗连接蛋白43(Sigma)保温。使用FITC连接的羊抗兔IgG(Sigma)作为第二抗体。
为了为了确证新形成的心肌细胞代表的是具有完整功能的成熟细胞，检测心肌细胞增强因子(MEF2)的表达、心肌特异性转录因子GATA-4和心肌细胞早期发育的标志蛋白Csx/Nkx2.5的表达。在心脏中，MEF2蛋白通过GATA-4协同活化几种心肌基因例如肌球蛋白轻链、肌钙蛋白T、肌钙蛋白l、α-肌球蛋白重链、桥粒蛋白、心房利钠尿因子和α-肌动蛋白基因的启动子而被募集(Durocher et al，1997；Morin et al，2000)。Csx/Nkx2.5是一个受限于心肌细胞分化的初始期的转录因子(Durocher et al，1997)。在心脏修复过程中，所有的肌球蛋白标记的细胞核都表达MEF2(图7D-7F)和GATA-4(图10)，但仅有40±9％表达了Csx/Nkx2.5(图7G-7I)。为了进一步描述这些心肌细胞的特性，还检测了连接蛋白43的表达。这种蛋白质的功能是负责细胞间连接并通过在心肌细胞间产生浆膜通道进行电偶联(Beardsle et al，1998，Musil et al.，2000)。连接蛋白43在胞浆中和紧密排列的分化细胞表面明显(图11A-1D)。这些结果与心肌表型的预期功能相一致。另外，在同一和不同的带内检测到不同成熟阶段的心肌细胞(图12)。
实施例2：动员骨髓细胞修复梗塞的心肌
A.心肌梗塞和细胞因子
切除15只两个月龄C57BL/6雄性小鼠的脾脏，两周后皮下注射重组的大鼠干细胞因子(SCF)(200μg/kg/天)，和重组的人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(Amegen)(50μg/kg/天)，每天一次，连续注射5天(Bodine et al，1994；Orlic et al，1993)。麻醉下，手术暴露左心室(LV)，并结扎冠状动脉(Orlic et al，2001；Liet al，1999)。投用SCF和G-CSF3天以上。对照组包括切除脾脏的梗塞小鼠和注射生理盐水的假手术小鼠。处死前，每天一次给予BrdU(50mg/kg体重)，连续13天；第27天处死小鼠。方案经过纽约医学院证明是可行的。实验结果为均数±标准差。以Student＇s检验和Bonferroni方法比较两组间的差异显著性。用时序检验法(log-rank)计算致死率。P<0.05为差异性显著。
当骨髓Lin-c-kitPOS细胞具有了转分化为心原性的细胞系的能力，便使用原始方案使它们在外周血中的循环数量最大化，以增加它们定居于死亡心肌区域的可能性。对于一般动物，血液中Lin-c-kitPOS细胞的出现频率，要远低于骨髓中相似细胞出现频率(Bodine etal，1994；Orlic et al，1993)。如以前文献中记载的，细胞因子处理能促进骨髓中Lin-c-kitPOS细胞数目的显著增长，还能改变这些细胞从骨髓向外周血的再分布。该实验方案可以使循环的Lin-c-kitPOS细胞增加250倍。
在目前的研究中，BMC被SCF和G-CSF动员，使梗塞小鼠的存活率大大提高；用细胞因子治疗，使73％的小鼠(11 of 15)存活达到27天，而未经进行治疗的心肌梗塞小鼠死亡率则很高(图13A)。该组中的大量动物梗塞后3至6天死亡，只有27％的小鼠(52支中9支)存活达到27天(p<0.001)。MI后，48小时内死亡的小鼠并未包括在死亡率曲线中，以尽可能地减小手术创伤的影响。第27天，根据左心室游离壁(LVFW)心肌细胞的缺失数目测知，注射细胞因子(64±11％(n＝11))和生理盐水(62±9％(n＝9))动物的梗塞面积相似(图14)。
更重要的是，手术后27天处死的所有11只细胞因子处理的梗塞小鼠，动员骨髓细胞可以促进心肌的再生(图13B)。在第6天(n＝2)和第9天(n＝2)死亡的4支早产小鼠也可见梗塞区内心肌细胞的生长。心肌修复的特征在于大部分梗塞损伤区域被新生成的心肌细胞所占据。形成中的组织从左心室游离壁(LVFW)边缘区域向损伤区域扩展，并从LVFW的心内膜向心外膜扩展。在缺乏细胞因子的情况下，未观察到心肌的替代和治愈，而且瘢痕形成明显(图13C)。相反，在处理的小鼠只能检测到一小部分区域有胶原蛋白的聚积。
B.以超声心动描记术和血液动力学方法检测BMC的转移
超声波心动描记术是在清醒的大鼠身上使用装配有13MHz线性换能器(15L8)的Sequoia 256c(Acuson)上完成的。前胸区域剔毛，记录乳突状肌水平看到的自胸骨旁短轴的二维(2D)图像和M-模式示踪。根据M-模式示踪，获得心脏舒张期和收缩期的解剖学参数(Pollick et al.，1995)。射血分数(EF)得自2D短轴侧观察到的左心室横断剖面(Pollick et al.，1995)：EF＝[(LVDA-LVSA)/LVDA]*100，其中LVDA和LVSA相当与舒张期和收缩期的LV面积。用水合氯醛(400mg/kg体重，腹腔注射)麻醉小鼠，将连接图表记录仪的微型头压力换能器(SPR-671，Millar)穿进左心室，以测量关闭的胸腔中的压力以及+和-dp/dt(Orlic et al，2001；Li et al.，1997；Li et al.，1999)。
在冠脉闭塞后的第9天、16天和26天测量，经过处理的小鼠比未经处理的小鼠EF分别高48％，62％和114％(图15D)。经过细胞因子处理的小鼠，其收缩功能在梗塞区域随着时间逐渐形成(图15E-M，图16H-P，www.Pnas.org.)。相反，在未经处理的小鼠的左心室终末舒张压(LVEDP)增高了76％。在没有经细胞因子治疗的小鼠，左心室收缩期压(未展示)、左心室舒张压((LVEDP))，及+和-dp/dt也都发生了更严重的改变(图17A-D)。另外，在边缘和远离梗塞部位的区域舒张压增加，而经过细胞因子处理的小鼠，相比较舒张压要低69-73％(图15N)。因此，细胞因子介导的梗塞修复，可以明显恢复再生心肌的收缩性，降低舒张壁应力，增强心室工作。在体内心肌梗塞进展期间，心肌再生可以减轻体内心腔的扩张和腔壁变薄。
心肌梗塞后9天、16天和26天，超声心动描记显示，相对于经过细胞因子处理的的小鼠，在未经处理的小鼠LV收缩终末直径(LVESD)和舒张终末直径(LVEDD)明显增加(图16A-B)。梗塞防碍了对收缩期(AWST)和舒张期(AWDT)前壁厚度的测量。如果可以测量时，收缩期(PWST)和舒张期(PWDT)的后壁厚度均比经过处理的小鼠厚(图16C-D)。解剖学方面，与细胞因子处理的小鼠相比，未经处理小鼠的心室壁边缘和和远离梗塞的区域厚度增加了26％和24％。BMC诱导的修复，使壁厚度/室腔半径的比例增加42％(图15A)。另外，组织再生使心腔直径的扩张降低14％，纵向轴降低5％(图16C-D)，而且心室体积降低26％(图15B)。更重要的是，心室质量对室腔体积的比例要比经过处理的动物高36％(图15C)。因此，骨髓细胞的动员会导致新生心肌细胞群体的增殖和分化，并且血管结构削弱限定心肌代偿失调的解剖学变化。
C.心脏解剖和梗塞大小的检测
经过血液动力学检测后，腹大动脉插管，用CdCl2使心脏在舒张期停止心搏动，并向心肌灌注10％的***。在压力与体内测得的舒张终末压相等时，对左心室腔填充固定物(Li et al，1997；Li et al，1999)。测量LV腔内轴，从底部、中间区域和顶部分别取三个横向组织切片用石蜡包埋。使用中段组织测量LV厚度、室腔直径和体积(Li et al，1997；Li et al，1999)。根据LVFW心肌细胞丢失的数目确定梗塞大小(Olivetti et al，1991；Beltrami et al，1994)。
为了确定生长带对心室质量的定量贡献，首先测定每组小鼠的LVFW体积(体重除以1.06g/ml)。数据分别是，假实验组(SO)小鼠为56±2mm3，梗塞后未处理的小鼠为62±4mm3(活的FW＝41±3；梗塞的FW＝21±4)，梗塞后细胞因子处理的小鼠为56±9mm3(活的FW＝37±8；梗塞的FW＝19±5)。这些数值与第27天心肌剩余和丢失的预期数值差不多，所以给出了未经处理和经细胞因子处理小鼠的梗塞大小。根据SO组小鼠LVFW体积(56mm3)和未经处理小鼠的梗塞区面积占62％，处理小鼠的梗塞区面积占64％，可以计算出冠状血管阻塞后29天，未梗塞区域预定保留(未处理21mm3，处理20mm3)和预定丢失的的心肌体积(未处理35mm3，处理36mm3)(图18A)。只有在细胞因子处理的实验小鼠中，发现新生成的心肌组织体积是14mm3(图18A)。因此，修复带减小了梗塞面积，从64％降到39％。由于第27天，LVFW的剩余部分在未处理和处理的小鼠为41mm3和37mm3，所以余留的心肌分别经受了95％(p<0.001)和85％(p<0.001)的肥厚(图18a)。因此，与心肌细胞体积增加了94％和77％相一致(图18B)。
D.测定所形成的心肌总体积
测量三个切片中被恢复的组织所占有的面积和切片厚度，以确定再生心肌的体积。这两个变量的乘积可以得出每个切片中组织修复的体积。将三个切片的数值相加，就可以得出形成的心肌组织的总体积。另外，测定每只小鼠心脏中400个心肌细胞的体积。用桥粒蛋白、层粘连蛋白抗体和碘化丙锭(PI)着染组织切片。只包括具有中心定位核的纵向细胞。假定细胞是圆柱形的，测定每个心肌细胞越过核的长度和直径即可以计算出细胞体积(Olivetti et al，1991；Beltrami et al，1994)。对心肌细胞进行分类并根据各类细胞总体积与每个细胞的平均体积的商，计算出各类心肌细胞的数目(Kajstura et al，1995；Reiss et al，1996)。也可以按照前面所述方法计算心肌细胞每个单位面积的小动脉和毛细血管数目。
切片与BrdU或者Ki67抗体保温。心肌细胞(M)用小鼠单克隆抗肌球蛋白抗体识别，内皮细胞(EC)用兔抗因子VIII抗体识别，平滑肌细胞(SMC)用小鼠单克隆抗α-平滑肌肌节肌动蛋白抗体识别。聚焦显微镜观察得知核被BrdU或者Ki67标记的M、EC和SMC。随机选定11只细胞因子处理的小鼠的核；BrdU：M＝3541，EC＝2604，SMC＝1824。Ki67：M＝3096，EC＝2465，SMC＝1404。
第14天到26天，每天注射BrdU，以测定积累的增殖程度，同时用Ki67检测，以确定处死小鼠时循环细胞的数目。Ki67识别处于G1，S，G2(前期和中期)的细胞，减少处于细胞***后期和末期的细胞(Orlic et al，2001)。BrdU或者Ki67阳性细胞百分比例分别是内皮细胞的1.6倍和1.4倍，是平滑肌细胞的2.8倍和2.2倍(图18C，19)。新形成的心肌占梗塞区域的76±11％，其构成分别是心肌细胞占61±12％，新血管占12±5％，其他成分占3±2％。含有15 x 106个再生心肌细胞的带处于活性增长阶段，并且有范围较宽的分布(图18D-E)。内皮细胞和平滑肌细胞的生长导致新生心肌组织中每平方毫米有15±5个小动脉和348±82个毛细血管的形成。有多层平滑肌细胞和10-30μm管腔直径的厚壁小动脉代表了早期分化中血管。同时，在固定过程中，冠状动脉分支和修复的心肌组织的不完全灌注，导致小动脉和毛细血管中含有红细胞(图18F-H)。这些结果为新生成的血管具有完整功能并且与冠脉循环相连接提供了证据。因此，组织修复减少了梗塞面积，并且心肌细胞生长胜过血管生成；肌肉物质替代是梗塞心脏的主要特征。
E.细胞分化的检测
利用胞浆和核标记物。心肌细胞核：兔多克隆Csx/Nkx2.5、MEF2和GATA抗体。胞浆：小鼠单克隆巢蛋白(Kachinsky et al，1995；)、兔多克隆肌桥粒蛋白(Hemann and Aebi，1998)、肌球蛋白，小鼠单克隆α-肌节肌动蛋白和兔多克隆连接蛋白43抗体(Orlic et al，2001)。EC胞浆：小鼠单克隆flk-1、VE-钙粘着蛋白和因子VIII抗体。
鉴定五种胞浆蛋白质，以确证心肌细胞的分化状态(Orlic et al，2001；Kachinsky etal，1995；Hermann and Aebi，1998)：巢蛋白、桥粒蛋白、α-肌节肌动蛋白、肌球蛋白和连接蛋白43。巢蛋白在分散穿过形成带的单个细胞中被识别(图20A)。此外，所有其他心肌细胞都表达桥粒蛋白(图20B)、α-肌节肌动蛋白、肌球蛋白和连接蛋白43(图20C)。检测到了参与活化某些心肌结构基因启动子的三个转录因子(Orlic et al，2001；Lin etal，1997；Kasahara et al，1998)：Csx/Nkx2.5、GATA-4和MEF2(图21A-C)。修复的组织中存在两个标志，即flk-1和VE-钙粘着蛋白(Yamaguchi et al，1993；Breir et al，1996)阳性单细胞(图20D，E)；检测分离的SMC中或小动脉壁内的flk-1(图20F)。在血管形成过程中，酪氨酸激酶受体促进SMC的迁移。因此，梗塞心脏的修复涉及到心肌细胞群的生长和分化，导致心肌更新。
实施例3：成年小鼠心脏中原始细胞的迁移
为了确定是否原始细胞存在于成年心室的心肌中，而且这些细胞是否具有迁移能力，利用肝细胞生长因子(HGF)、干细胞生长因子(SCF)、粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)等三种主要生长因子作为化学吸引剂进行检测。选择SCF和GM-CSF是由于它们可以促进造血干细胞的移位。尽管HGF可以诱导造血干细胞的迁移，但这种生长因子主要还是参予早期心脏发生过程中心肌细胞前体的有丝***、分化和迁移。基于此，按照它们的大小，从小鼠心脏中分离酶裂解的细胞。从心脏组织中解离的心肌细胞的方法是本领域技术人员熟知的，所以无须作过多的实验(参见美国专利6255292号，其全文列为本文参考文献)。在有5μm微孔、明胶包被的滤膜的Boyden微室(Boyden et al，J.Exprtl.Med.115：453-456)中，对包括小的未分化细胞、直径5-7μm、具有高细胞核/胞浆比例的解离的心肌细胞群体进行迁移试验。
在三种生长因子存在下，检测到迁移细胞的剂量反应曲线没有很大差异。然而，在浓度为100ng/ml时，HGF看来可迁移大量的细胞。另外，细胞显示出对由15％Lin-c-kitPOS细胞、50％多药抗性-1标记的细胞和30％干细胞抗原-1(Sca-1)表达细胞组成的HGF的趋化性反应。当在15％的胎牛血清中培养迁移的细胞时，这些细胞就分化成为心肌细胞，内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。心脏球蛋白阳性心肌细胞占制剂的50％，而因子VIII标记的细胞占15％，α-平滑肌肌动蛋白染色的细胞占4％，波形蛋白阳性因子VIII阴性的成纤维细胞占20％。剩余细胞是一些小的未分化细胞和不能被这四种抗体染色的细胞。综上所述，小鼠心脏具有可以被生长因子动员的原始细胞。HGF可以促使细胞移位，并在体外分化为四种心肌细胞谱系。
实施例4：体外心肌C-Kit阳性细胞的增殖和体内产生心肌细胞
为了确定原始c-kitPOS细胞是否出现在衰老的Fischer 344大鼠中，将分离的心肌细胞暴露于包被了c-kit受体抗体(ACK-4-生物素，抗-c-kit mAb)的磁性小珠。分离后，在10％的胎牛血清中培养这些小的未分化的细胞。几天后，细胞贴壁，并在一周后开始增殖。第7-10天开始汇合。第P2和P4代，细胞倍增时间分别需要30和40小时。细胞衰老前，可以生长***到P18代(第90代)。通过Ki67标记确定复制能力：，在P2代，88±14％细胞的细胞核中含有Ki67蛋白。另外，对P1代与P4代细胞附加检测，40％的细胞表达α-肌节肌动蛋白或者心肌肌球蛋白、13％表达桥粒蛋白、3％表达α-平滑肌肌动蛋白，15％表达因子VIII或CD31，和18％表达巢蛋白。在体外条件下，没有观察到明显的肌纤维组织和排列整齐的肌纤维节，也没有观察到自发性收缩。同样，血管紧张素II(Ang II)，去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、机械性伸展和电场刺激都不能启动收缩功能。基于此，决定估计这些附属于生肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞系的细胞是否丧失了其生物学特性，或者体内重新建立它们的作用。随后用BrdU标定第P2代的细胞。在冠状动脉梗塞3-5小时后，向梗塞的Ficher 344大鼠的受损区域注射BrdU标定的阳性细胞。两周后，处死大鼠，对心肌梗塞区域的情况进行测定。可以检测到心肌组织中生成沿着纵轴平行分布的肌纤维，以及BrdU标定的细胞核。而且，出现了包括细动脉和毛细血管的血管结构，并且对BrdU显阳性。综上所述，当被植入功能降低的受损心肌组织后，原始c-kitPOS阳性细胞在衰老的心脏中增加，并维持细胞增殖和分化成实质细胞和冠状血管的能力。
实施例5：心脏干细胞介导年轻和衰老大鼠心脏中的心肌细胞复制
心脏不是一个有丝***后的器官，但含有生理学上进行细胞***以取代死亡的细胞的心肌细胞亚群。在病理负担过重时，心肌细胞的加强了增殖，以扩大肌肉质量并维持心脏功能。然而，这些增殖中的心肌细胞的来源仍然有待鉴定。因此，要研究Fischer 344大鼠心肌中具有干/祖细胞特征的原始细胞。研究年轻和年老动物，确定是否老化会对干细胞群和***细胞的数量造成影响。4个月时，大鼠的c-kit和MDR1阳性细胞的数量分别为11±3/100mm2，18±6/100mm2。27个月的大鼠的c-kit和MDR1阳性细胞的数量分别是35±10/100mm2和42±13/100mm2。检测到的一些新生成的小心肌细胞仍然是c-kit和MDR1阳性。在循环细胞的核中表达的Ki67蛋白，在4个月和27个月实验大鼠的心肌细胞中，检测率分别为为1.3±0.3％和4.1±1.5％.在6次或者56次注射后，BrdU定位方法发现，4个月和27个月实验小鼠的心肌细胞中，检测率分别是4个月为1.0±0.4％和4.4±1.2％，27个月为4.0±1.5％和16±4％。在组织切片中对细胞***指数进行测定，发现心肌细胞的细胞核在有丝***时，4个月的是82±28/106，27个月的是485±98/106。这些检测结果证实了***细胞的有丝***指数。用这种方法，有可能确认多核心肌细胞的细胞核是同时进行有丝***的.而这个信息在组织切片中是无法获取的。收集的数据显示，4个月时有95±31/106个心肌细胞***，而27个月的老年大鼠有620±98/106个心肌细胞***。在两个年龄间期，都有有丝***纺锤体和收缩环形成，有核膜分解，以及核***和胞浆***。这种关系说明心脏干细胞可以调控老化心肌细胞增殖水平与命运。
实施例6：人心脏的嵌合性与干细胞的作用
在受损心脏的重建中，居留的原始细胞发挥的重要作用是有目共睹的。当移植雌性心脏与雄性受体进行器官嵌合时，居留的原始细胞也扮演着重要角色。为了这个目的，将8只雌性大鼠的心脏植入到雄性受体中并进行分析。通过FISH法检测Y染色体，测知雄性细胞向移植的雌性心脏的移位。通过这个方法，Y染色体标记的细胞在心肌组织、冠状细动脉和毛细血管中的百分比分别是9％，14％和7％。同时，在植入的雌性心脏中检测未分化的c-kit和多抗性1(MDR-1)阳性细胞的数目。另外，也检测这些细胞含有Y染色体的可能性。心脏移植涉及保存受体心脏心房部分，因为供体心脏要与受体自身的部分心房相接处。这个手术方法对于了解是否来源于受体和供体的心房都含有未分化的细胞是很重要的，而这些未分化的细胞有助于移植的心脏的复杂重建过程。在未移植心脏的对照组中，c-kit和多抗性1标记的细胞(MDR-1)数量是很低的：左心室的心肌中，c-kit和MDR-1标记的细胞分别有3个/100mm2和5个/100mm2。而在受体心脏心房中，c-kit和MDR-1标记的细胞数分别是15个/100mm2和42个/100mm2。供体心脏心房的相应值分别是15个/100mm2和52个/100mm2，心室中分别是11个/100mm2和21个/100mm2。移植的特征在于心脏中原始未分化细胞显著增加。宿主心房中干细胞有Y染色体，而在供体心房和心室中c-kit和MDR-1标记的细胞平均数分别是55％和63％。所有c-kit和MDR-1阳性细胞都是CD45阴性的。这些观察说明，将雄性细胞易位在被移植的心脏，对供体心肌的重建有很大影响。总之，干细胞广泛的分布在成年心脏中，由于它们的可塑性和迁移能力，可以产生高度分化的心肌细胞、冠状小动脉和毛细血管结构。
实施例7：成年大鼠心脏中干细胞的识别和定位
心肌细胞的更新发生在正常心脏中，心肌受损导致心肌细胞的增殖和血管的生长。这些适应性增加了多潜能原始细胞出现在心脏中的可能性，涉及到对死亡的心肌细胞的生物学替代，也涉及心肌受损后的细胞生长反应。在这个基础上，利用干细胞因子受体c-kit、能够将细胞染料、毒性物质和药物从细胞中挤出的P-糖蛋白，即多抗药性-1(MDR-1)、参予细胞信号传递和细胞粘附的干细胞抗体-1(Sca-1)等表面标记物，检测正常小鼠心脏中未分化细胞的存在。对左右心房、心室的底部、中部和顶端四个分立的区域进行分析。按照数据由高到低的次序排列，c-kit阳性细胞在心房、心室顶端、底部和中部的数目分别是26±11个，15±5个，10±7个和6±3个/100mm2。与心室的底部和中部切片相比，在心房和心室顶端大部分的c-kit阳性细胞差异显著。MDR1阳性细胞的数目多于表达c-kit的细胞，但它们具有相似的定位特征。在心房、心室的顶端、底部和中部的数目分别是43±14个，29±16个，14±7个和12±10个/100mm2。在心房和心室顶端，MDR1阳性细胞的数要高于其他两个区域。Sca-1标记的细胞则显示有最高的数值；发现心房部位的阳性细胞数目高达150±36个/100mm2。C-kit、MDR-1和Sca-1阳性细胞均为CD45阴性，并且对于心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和纤维细胞胞浆蛋白质也表现为CD45阴性。另外，检测同时对c-kit和MDR-1表现为阳性的细胞的数目，以识别具有两个干细胞标志的细胞。在整个心脏中，有36％c-kit标记的细胞表达了MDR-1，而且有19％MDR-1标记的细胞也表达c-kit。总之，干细胞分布在小鼠整个心脏的各个部位，但是倾向于积聚在受到较低压力的区域，如心房和心室顶端。。
实施例8：居留的心脏干细胞的迁移、侵入和表达以修复梗塞的心肌
鉴定造血干细胞和肝细胞(126，90)，特别是卫星骨骼肌细胞(92)和胚胎心肌细胞(127)上的HGF受体，cMet。这些发现促使我们确定是否c-Met存在于心脏干细胞中，而且它的配体HGF对这些未分化的细胞是否具有生物学效应。假设HGF促进体外心脏干细胞的迁移和侵入，并且在体内有助于从储藏区域向心肌梗塞部位的移位。HGF通过表达和激活基质金属蛋白酶-2(94，95)影响细胞迁移(128)。这个酶家族可以破坏细胞外基质，促进心脏干细胞的移动、回归和组织修复。
IGF-1是促有丝***的和抗细胞凋亡的，而且对于神经干细胞的增殖和分化是必要的(96，97，98)。如果心脏干细胞表达IGF-1R，IGF-1便可以以差不多的方式影响CSC，在迁移到受损的心肌组织过程中保护它们的存活性。IGF-1过表达的特征在于使成年小鼠心脏中的心肌细胞增殖(65)，并且这种细胞增长形式取决于心脏干细胞的活化、分化和存活。
本项研究的开始部分是，进行细胞迁移和侵入试验，以确定在趋化性肝细胞生长因子存在的情况下，c-kitPOS和MDR1POS细胞的移动性特征。
酶促解离心脏细胞并弃去心肌细胞(124)。将小细胞悬浮在无血清培养基(SFM)中。使用改良的有上下两层小孔的Boyden小室(Neuro Probe，Gaithersburg，DM)检测细胞迁移。48孔平板的滤膜由孔径为5μm的明胶包被的聚碳酸酯膜构成。底孔用含有0.1％BAS和递增浓度的HGF的SFM填充，将50μl小细胞悬浊液放入上面的小孔。5小时后，用4％仲甲醛固定滤膜40分钟，并且用PI、c-kit和MDR1抗体染色。用FITC联接的抗IgG作为第二抗体。在不同浓度的HGF中进行6个独立分开的实验。每次实验在各个小孔随机挑选40个视野进行细胞计数，以划出剂量-反应曲线(图61)。使用IGF-1或者联合使用IGF-1与HGF进行的迁移试验，排除了IGF-1对小细胞的运动发生效应。使用有24孔的小室和12个细胞培养***物(Chemicon，Temecula，CA)进行侵入分析。在***物的表面散布一薄层无生长因子的细胞外基质。相反，将100ng/ml的HGF滴加在下面的小室内。侵入的细胞消化外膜后，粘附在聚碳酸酯膜的底部。按照细胞迁移的分析方法，48小时后检测移位细胞的数目。分别进行4个独立实验(图62)。与细胞迁移实验中获得的分析结果相符，IGF-1对细胞侵入没有影响(数据未示出)。
两种类型细胞的迁移相似，并在有100ng/ml HGF的条件下达到高峰。第5小时，转移到下面小室中的c-kitPOS和MDR1POS细胞分别是对照组的3倍和2倍。较高的HGF浓度并不会改善细胞迁移(图61和62)。基于此，也使用浓度为100ng/ml的HGF检测c-kitPOS和MDR1POS细胞穿透侵入小室的合成的细胞外基质的能力。48小时中，生长因子使小室下部分中c-kitPOS和MDR1POS细胞的数目分别增加了8被和4倍(图61和62)。在浓度为25至400ng/ml范围内，IGF-1对于心脏干细胞的移动没有影响。将IGF-1加入到HGF中，也不能改变单用EGF时所得到的c-kitPOS和MDR1POS细胞的迁移和侵入特征。
用磁珠收集小的、未分化的c-MetPOS细胞，并用酶谱法测定细胞裂解明胶的能力(图63)。简单地说，从心脏(n＝4)中分离小细胞，然后再用c-Met抗体包被的微球(Miltenyi，Auburn，CA)分离。将细胞暴露于100ng/ml的HGF中37℃保温30分钟。在与0.1％明胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)共聚合的10％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离细胞裂解产物。将凝胶放在5％考马斯亮蓝染色溶液(0.5％)中染色，并根据对照灰色背景所反映出的清淅带检测液化明胶活性的面积。这可以证明是否c-MetPOS细胞表达了基质金属蛋白酶(MMP)，并能够消化凝胶中存在的底物(94，95)。获得的阳性结果(图63)说明这些原始细胞的移动性至少在一定程度上是由于金属蛋白酶的活化。总之，这些体外实验表明，HGF对CSC有趋化功能。HGF的作用似乎由于它与c-Met受体结合后而被介导，随后刺激MMP合成(94，95)。
小鼠的心肌梗塞
造成心肌梗塞小鼠，5小时后，从心房到边缘区域4次注射含有HGF和IGF-1的溶液。投用渐增浓度的HGF后，在储存的CSC和死亡的组织之间形成一个趋化梯度。引入这个实验方案提高CSC回归到受损区域的数目并产生新的心肌组织。假如是这样的情况，大量由于心肌梗塞而死亡的动物就会减少，并通过这种干预限制心肌梗塞的面积和延长存活时间。
实验中使用129SV-EV雌性小鼠。麻醉(150mg***，1mg乙酰丙嗪)后，给小鼠插管，暴露心脏并结扎左冠状动脉(61，87)。用生长因子处理的小鼠，冠状动脉结扎时，要尽可能地靠近主动脉起点，以诱导形成大的梗塞。然后，封闭胸腔并使动物恢复。5个小时后，麻醉小鼠，重新打开胸腔，从心房到梗塞的边缘区域4次注射含有HGF和IGF-1的溶液，每次2.5μl。最后两次注射，在边缘区域的对面完成。在梗塞方向，HGF的浓度逐步增加，从50到100和200ng/ml。投用恒定浓度200ng/ml的IGF-1。从第6天到16天，对实验小鼠进行BrdU(50mg/kg体重)注射，以便在这个间隔时间里鉴定小细胞、新形成的和增植的心肌细胞。假手术和梗塞后未处理的小鼠，分别在四个相同位点注射生理盐水。
在讨论心脏干细胞对器官修复的影响之前，在对照组小鼠的心房和左心室，检测c-Met和IGF-1R在表达c-kit和MDR1的细胞上的存在。对遭受冠状动脉阻塞的小鼠的心房与梗塞和未梗塞的LV进行同样的分析。在投用生长因子后2到3小时，即冠状动脉堵塞后7到8个小时进行这项检测(目的是记录侵入死亡组织和周边活的心肌组织的原始细胞，及参予这个过程的HGF和IGF-1)。
检测散布于正常(n＝5)，梗塞后处理的(n＝6)和梗塞后未处理(n＝5)心脏区域中的c-kitPOS和MDR1POS细胞内的c-Met和IGF-1R(图22，A-F)。大部分的c-kitPOS和MDR1POS细胞表达了c-Met和IGF-1R之一或两者。在心肌中有或没有c-Met和IGF-1R的情况下，心肌梗塞和投用生长因子都没有以一致的方式改变CSC的相对比例(图64)。使用发夹1(凋亡)和发夹2(坏死)标记和细胞核(循环细胞)中的Ki67表达，分别确定心脏受损和未受损的不同部分中c-kitPOS和MDR1POS细胞的存活性和活化(图22，G-L)。
在对照小鼠心房中，CSC的数目要比心室中更多。急性心肌梗塞和投用生长因子都会明显地改变心脏中原始细胞的数量和分布。在梗赛区的边缘带和远距离区域中的剩余心肌组织，以及发生梗塞后死亡的心肌组织中，活的c-kitPOS和MDR1POS细胞显著增加。重要的是，心房中的CSC减少(图22，M，N)，提示原始细胞从储存区域向受到应力的活的和死亡的心肌组织转位。梗塞后未处理的小鼠的一个不同现象是，心房中活的CSC数目仍然高于心室中的数目。对照组和梗塞后处理的小鼠中，梗塞和周边心肌组织内的c-kitPOS和MDR1POS细胞中未发现凋亡和坏死现象。分布在边缘带和梗塞区的Ki67标记的未分化细胞分别是35％和20％(图65)。在梗塞后未处理的小鼠中，梗塞区域的大部分c-kitPOS和MDR1POS细胞是凋亡的(图22，M，N)。但未看到坏死细胞。实验中观察到，凋亡的CSC存在着从梗塞区域到远距离心肌和心房组织变化的死亡梯度。这些小鼠中，只有10-14％的活c-kitPOS和MDR1POS细胞表达了Ki67(图65)。
因此，这些结果支持了这样的观点，即CSC表达c-Met和IGF-1R，所以HGF和IGF-1对梗塞心脏中CSC的回归、增殖和存活有积极的影响。基于体外和体内的实验数据，HGF似乎在细胞迁移中发挥优势作用，而IGF-1对细胞***和存活起主要作用。在梗塞后未处理的小鼠中，CSC并没有移位到梗塞区域，并且已存在的原始细胞因凋亡而死亡。一个重要的问题是，位于梗塞区内的CSC是否能够分化成不同的心脏细胞谱系并重建死亡的心肌。积极发现会为梗塞后处理的小鼠的心脏修复提供一个机制，并可能解释为什么梗塞后未处理的小鼠没有发生心肌再生。
为了进行解剖学检测，注射CdCl2使心脏停止在舒张期并用10％***灌注心肌。在压力等于与体内测量的终末舒张压的条件下，对左心室腔填充固定液。测量左心室腔内轴并使用中段组织切片测得LV厚度和室腔直径。根据包括心室间隔在内的LV心肌细胞的丢失数目检测梗塞面积(87)。
第16天，心肌梗塞导致未处理的小鼠和HGF与IGF-1处理的小鼠左心室以及室间隔分别丢失42％(n＝15)和67％(n＝22)的心肌细胞(图23A)。尽管梗塞大于60％，生长因子处理的小鼠却能够更好地保留心脏功能(图23B)。HGF与IGF-1导致左心室终末舒张压的小幅度升高以及+和-dp/dt的小幅降低。梗塞大小差异并没有影响到细胞的移动性，这与两组小鼠的数据即未处理组为43％，处理组为40％相似。重要的是，接受生长因子后，虽然心肌梗塞影响左心室面积达LV的60％以上，但是22只小鼠中有14只存活。其中，7只小鼠梗塞影响范围达到LV的75％到86％。未经处理的小鼠心肌梗塞范围没有超过LV的60％(图23，C，D)。与注射的小鼠相反，为使未经处理的动物存活，必须保留小鼠的一部分左心室壁和整个心室间隔。梗塞面积大于LV的60％的大鼠、小鼠、狗、以及其它哺乳动物的寿命各不相同。人类的心肌梗塞面积为46％，便发生不可逆的心源性休克和死亡(99)。
冠状动脉堵塞后16天，有可能根据假手术小鼠的左心室体积和梗塞后未处理的小鼠以及处理的小鼠的梗塞面积，计算出心肌组织中留存部分和损失部分的体积。除了生长因子处理的小鼠外(面积是8mm3)，检测新生成的心肌组织，包括心肌细胞，血管结构和其他组织成分。因此，修复带使梗塞面积从67％减小到57％(图68和69)。
HGF-IGF-1的趋化性和促有丝***特性，导致梗塞区域原始细胞的迁移、增殖和分化，产生新的心肌。尽管这种方法学手段在小动物中具有复杂性，但是在85％的小鼠心脏梗塞区域有心肌带形成(在26只小鼠中有22只)。新生成的心肌带占据了受损区域的65±8％，位于梗塞区域的中间部分，与心室壁外层和内层距离相等。在很大的梗塞中，整个心室壁厚度被发育的心肌组织所替代(图23，E至H)。
在解剖学上，两组梗塞小鼠的心脏纵轴和心腔直径都相似，表明治疗干预能够促进心室的积极修复。这个见解与处理的小鼠60％以上梗塞的结果相符。此外，与未处理的小鼠相比，处理的小鼠的壁厚与室内半径的比率降低。结合处理的小鼠左心室终末舒张压的小幅度提高，这种比例关系明显的削弱了该组小鼠舒张期室壁压力的增加(图67)。
用单克隆c-kit和MDR抗体标记原始细胞(82，83)。用BrdU抗体检测BrdU的掺入(61，87)。用因子VIII抗体识别内皮细胞，，并使用抗α-平滑肌肌动蛋白抗体识别平滑肌细胞。为了研究心肌细胞分化，使用了巢蛋白、桥粒蛋白、心脏肌球蛋白、α-肌节肌动蛋白、N钙粘着蛋白和连接蛋白43等各种抗体。用抗I型和III型胶原蛋白抗体的混合物检测梗塞组织中的疤痕形成(83，61，87)。
形态学上评价修复心肌的组合物。使用对心肌细胞、内皮细胞及平滑肌细胞特异的抗体识别实质细胞和血管结构(61，87)。而且，用BrdU标记的细胞作为指示整个时间里再生组织的标志。心肌细胞占带的84±3％，冠状动脉血管占12±3％，其他结构成分占4±1％。新形成的心肌细胞体积为600至7200μm3不等，平均体积为2200±400μm3(图68和69)。同时，3.1±1.1百万个细胞的形成补偿了2.4±0.8百万个细胞的丢失。细胞再生中的这种轻微过量是随心肌细胞大小而变化的。在假手术的心脏中，心肌细胞的体积为18000±3600μm3，是生长的细胞体积的8.2倍。更重要的是，梗塞后的第16天，重建了16％的肌肉质量(丢失的肌肉质量：18000 x 2.4 x 106＝43mm3；再生的肌肉质量：2200 x 3.1 x 106＝7.0mm3；7.0：43＝16％)。虽然新的心肌细胞仍然在成熟过程中，但体内超声心动描记和体外力学方法却证明了细胞在体内和体外已具有完整的功能。
使用配备了13MHz线性换能器(87)的Acuson Sequoia 256c***，以超声心动描记方法检查清醒的小鼠。在***肌水平从胸骨旁短轴切面记录二维影像和M-模式示踪。从二维短轴切面的LV横断面积推算出射血分数(EF)：EF＝[(LVDA-LVSA)/LVDA]×100，其中LVDA和LVSA相当于舒张与收缩期的LV面积。为了进行血液动力学检查，麻醉小鼠，将连接图像记录仪的Millar微头压力换能器穿入左心室，监测封闭胸腔中的血压以及+和-dp/dt。在第15天，超声心动描记显示，处理的梗塞心室壁的再生部分收缩活动已部分恢复。处理的小鼠的射血分数高于未处理的小鼠(图24，A至E)。因此，结构修复与功能修复是联合在一起的。
为了证实新的心肌细胞具有功能活性，并且有助于改善心室性能，从心室壁梗塞区的心肌组织中酶促分离这些细胞(129)并于体外评估其收缩行为(124，130)。经胶原酶消化，分离处理的小鼠的心肌细胞，将这些细胞放入含1.0mM Ca2+的细胞浴中(30±0.2℃)，用0.5Hz的去极化矩形脉冲电流刺激，两次舒张压阈值的间隔时间为3-5毫秒。
将得自视频图像的参数储存在电脑中。发育中的心肌细胞较小，并且有位于肌膜下区域细胞周围的肌原纤维。新的心肌细胞像新生细胞一样自动复制DNA。它们比其余肥大的心室心肌细胞小得多(图25，A，B)。与存活的老心肌细胞相比，生长中的细胞则表现出更高的峰值缩短和缩短的速度，并且到达峰值缩短的时间较少(图25，C至J)。
用Ki67着染分离的新生心肌细胞，确定这些细胞是否为循环的，并因此能合成DNA的细胞。用同样的实验方案分离梗塞后处理的小鼠的活的肥大的细胞。在这个基础上，借助PI染色和聚焦显微镜测定每个单核和双核细胞中的心肌细胞核的DNA含量(图25，A和B)。以对照双倍体小鼠淋巴细胞作为基线。目的是要确定在它们分化为各种细胞谱系之前，CSC中是否发生细胞融合。最近的体外实验已提示了这种可能性(131，132)。非循环的新的心肌细胞和增大的剩余心肌细胞只有二倍体核，排除这种现象在心脏修复中起作用(图66)。
为了确定再生带内正在成熟的心肌细胞的分化水平，估测巢蛋白、桥粒蛋白、心脏肌球蛋白重链、α-肌节肌动蛋白、N钙粘着蛋白和连接蛋白43的表达。N-钙粘着蛋白识别筋膜粘着和连接蛋白43以及闰板中的缝隙连接。这些蛋白质受到发育上的调节。连接蛋白43对电偶联和心肌细胞的同步收缩也是重要的。在基本上所有新形成的心肌细胞中检测这六种蛋白质(图26，A到N)。BrdU标记的心肌细胞占了84±9％，表明再生组织中的细胞增殖正在进行。心脏修复包括毛细血管和细动脉的形成(图27，A到D)。在血管内腔中出现了红细胞，说明生成的血管已经参与了冠状循环。心肌修复阶段的特点在于，抗性小动脉的生长比毛细血管结构的生长更占优势。
目前的发现表明，居留的CSC可以从它们的储存区迁移到梗塞的心肌组织，然后分化成为心脏细胞谱系，致使组织再生。这里所说的干预是指能够挽救患有与哺乳动物的生命不相容的梗塞的动物。
实施例9：获得体内功能活性的心脏干细胞体外分化
A.细胞收集和克隆
分离20至25周龄雌性Fischer大鼠的心脏细胞(111，112)。分离完整细胞并弃去心肌细胞。重新悬浮小细胞，并使用滤网除掉集聚体。将细胞与识别位于细胞膜外面的N末端抗原决定部位的兔c-kit抗体(H300，Santa Cruz)保温(121)。将细胞暴露于包被抗兔IgG(Dynal)的磁珠，通过磁场收集c-kitPOS细胞(n＝13)。为了进行荧光激活细胞分选(FACS)(n＝4)，细胞用r-藻红蛋白连接的大鼠单克隆抗c-kit抗体(Phamingen)染色。用这两种方法，从小细胞群中分选到6-9％不等的c-kitPOS细胞。
对于心肌细胞(α-横纹肌肌动蛋白、肌球蛋白、桥粒蛋白、心脏辅肌动蛋白、连接蛋白43)、内皮细胞(因子VII、CD31、波形蛋白)，平滑肌细胞(α-平滑肌肌动蛋白)和成纤维细胞(F；波形蛋白)胞浆蛋白质，c-kitPOS细胞评分为阴性。测得心肌细胞系的核标志物(Nkx2.5，MEF2，GATA-4)为细胞的7-10％，胞浆蛋白为细胞的1-2％。c-kitPOS细胞不表达骨骼肌转录因子(MyoD，肌细胞生成素，Myf5)或者髓样细胞、淋巴样细胞和类红细胞的标记物(CD45、CD45RO、CD8、TER-119)，表明这些细胞是Lin-c-kitPOS细胞。
将c-kitPOS细胞以1-2 x 104细胞/ml的密度培养在NSCM中，用于神经干细胞的筛选和生长(122)。该培养基由Dulbecco＇s MEM和Ham’s F12(比例为1：1)、bFGF(10ng/ml)、EGF(20ng/ml)、HEPES(5mM)、胰岛素-转铁蛋白-***盐组成。两周后c-kitPOS细胞贴壁并开始增殖(图.28a，b)。用分化培养基(DM)取代NSCM，并在7-10天细胞汇合。胰蛋白酶消化后进行细胞传代。根据Ki67的表达确定，循环细胞从第一代到第五代(P1-P5)(每5只动物)的细胞数从74±12％增加到84±8％。第二代(P2)到***(P4)细胞倍增时间平均为41小时。细胞继续***到第23代(P23)，没有受到生长限制和发生衰老，此时将细胞冰冻。从原代到23代鉴定心脏细胞谱系。在原代(P0)(n＝7)、第三代(P3)(n＝10)、第十代(P10)(n＝10)和第二十三代(P23)(n＝13)，心肌细胞占29-40％，内皮细胞占20-26％，平滑肌细胞占18-23％，成纤维细胞占9-16％。在液氮中培养的第23代细胞的等分样品，生长6个月后，细胞表达了如亲代细胞的同样表型。
在分化培养基生长的原代和第一代细胞，50％表达Nkx2.5，60％表达MEF2，30％表达GATA-4，55％表达GATA-5(图28c-f)。相反，没有鉴定出骨骼肌细胞(MyoD，肌细胞生成素，Myf5)、血细胞(CD45，CD45RO，CD8，TER-119)和神经细胞(MAP1b，神经丝200，GFAP)标志物。
为了克隆，将细胞以10-50个细胞/ml的密度接种到NSCM中(图28g)(109，110)。一周后，从单个细胞衍生成克隆(图28h)；除了在成纤维细胞系外，其他细胞谱系不存在纤连蛋白、I型前胶原和波形蛋白。用克隆圆桶分开单个克隆并铺板培养。选择发育形成的多克隆和单一克隆进行定性分析。使用含有10％FSC和10-8M地塞美松的MEM诱导细胞分化(DM)。为了亚克隆化，将得自多克隆的细胞以10-50个细胞/ml的密度铺板在NSCM中。分离单个亚克隆并铺板在分化培养基(EM)中。每个亚克隆步骤，都在悬浮液中培养等量的细胞，以发育成克隆球。
每个克隆都包含2-3个c-kitPOS细胞簇(图29a)，大多数这样的细胞(约20-50个)都分散在c-kitNEG细胞之间。有些细胞是Ki67阳性并偶而看到有丝***(图29b-d)。在各个克隆中鉴定表达心肌肌球蛋白和α-肌节肌动蛋白的心肌细胞、表达因子VIII、CD31和波形蛋白的内皮细胞、表达α-平滑肌肌动蛋白的平滑肌细胞和只表达波形蛋白的成纤维细胞(图29，e-h)。也存在含有的巢蛋白的小细胞聚集体(补充的信息)。因此，从心肌组织中分离的Lin-c-kitPOS细胞具有干细胞的性质。它们是克隆发生、自我更新和多潜能的，而且是主要心脏细胞类型的来源。对几个初级克隆所作的亚克隆分析证实了初级克隆表型的稳定性：克隆发生、自我更新和多潜能性。大部分亚克隆的表型可以与初级克隆的表型区别开。然而，八个亚克隆中有两个，一个只得到心肌细胞，另一个则鉴定为内皮细胞。
悬浮生长在Corning未处理的培养皿中的克隆发生细胞产生了球形克隆(图30a)。这种锚地独立生长是典型的干细胞14，15。球状体由c-kitPOS和c-kitNEG细胞簇以及大量的巢蛋白组成(图30b-d)。与其他干细胞相似14，15，在DM中铺板后球状体会逐渐贴壁，然后细胞迁移出球形体并开始分化(图3e-h)。
将细胞固定在4％仲甲醛中并用c-kit抗体标记未分化的细胞。心肌细胞的标记物包括Nkx2.5、MEF2、GATA-4、GATA-5、巢蛋白、α-肌节肌动蛋白、α-心脏辅肌动蛋白、桥粒蛋白和心脏肌球蛋白重链。平滑肌细胞的标记物包括α-平滑肌肌动蛋白和桥粒蛋白，内皮细胞的标记物是因子VIII、CD31和波形蛋白，成纤维细胞的标记物中没有因子VIII、纤连蛋白、I型前胶原、MyoD，用肌细胞生长素和Myf5作为骨骼肌细胞的标志物。CD45，CD45RO，CD8，TER-119用于除去造血细胞系。MAP1b、神经微丝200和GFAP用于识别神经细胞系。用BrdU和Ki67鉴定循环细胞(61，87)，细胞核被PI着染。
心肌细胞和CSC不能进行体外收缩。血管紧张素II、肾上腺素、异丙肾上腺素、去甲肾上腺素和电刺激不能促进收缩。在整个分化过程中，内皮细胞也不能表达标志物如eNOS。
B.心肌梗塞和细胞移植
植入BrdU标记的细胞(第二代；、阳性细胞＝88±6％)。使2个月龄雌性Fisher大鼠鼠发生心肌梗塞(111)。5个小时后，分别在22只大鼠梗塞区域的两侧边缘处注射2 x 105个细胞；第10天处死其中的12只大鼠，第20天处死另外10只。在每次间隔期间，给8-9只梗塞的和10只假手术的大鼠注射生理盐水，5只注射Lin-c-kitPOS细胞作为对照组。用***麻醉后，分别在第9天和第19天以超声心动描记法进行监测，第20天处死大鼠。以M模式跟踪法测得终末舒张压、左心室直径和壁厚度。封闭胸腔后，计算射血分数。第10天和20天麻醉动物，测定左心室血压以及+和-dp/d(111)。手术后第10天和第20天，处理的比未处理的大鼠死亡率低，但是统计学差异不显著，各组的平均死亡率为35％。研究所审查委员会认可该实验报告。
C.解剖和功能检查结果
使心脏停止在舒张期并用***固定。根据左心室心肌细胞丢失多少确定梗塞大小(87)，第10天处理缓和未处理的大鼠分别为53±7％和49±10％；第20天处理和未处理的大鼠分别为70±9％和55±10％(P<0.<每个心脏中检测400个新生心肌细胞的体积。用桥粒蛋白、层粘连蛋白和PI着染组织切片。收集有中央核的纵向排列的心肌细胞，根据细胞长度和跨核直径计算细胞体积(87)。
将组织切片与BrdU和Ki67抗体一起保温。第10天，12只梗塞后处理的大鼠中有9只检测到再生的心肌带，第20天所有10只梗塞后处理的大鼠都检测到再生的心肌带。第10天带窄薄而且不连续，第20天带变宽厚，而且存在于整个梗塞区域(图31a-c)。分别借助没有因子VIII的肌球蛋白、因子VIII、α-肌节肌动蛋白和波状蛋白识别心肌细胞(M)、内皮细胞(EC)、平滑肌细胞(SMC)和成纤维细胞(F)。也可以用心脏肌球蛋白抗体及PI识别心肌细胞。在第10天和第20天，测得新的心肌组织体积分别为30和48mm3。组织再生减小了发生心肌梗塞的面积，第10天从53±7％减小到40±5％(P<0.001)，第20天从70±9％减小到48±7％(P<0.001)。
用聚焦显微镜观察BrdU和Ki67标记的细胞。BrdU标记取样的细胞核数为：M＝5229、EC＝3572、SMC＝4010、F＝5529。相应Ki67标记取样的细胞为：M＝9290、EC＝9190、SMC＝8392。利用肌球蛋白、α-肌节肌动蛋白、α-心脏辅肌动蛋白、N钙粘着蛋白和连接蛋白43确定心肌细胞的分化。用I型和III型胶原蛋白抗体检测胶原蛋白。
由于植入的细胞是由BrdU标记的，所以可以使用这个标记鉴定发育中的心肌细胞的来源。检查心肌细胞、细动脉(图31f-n)和毛细血管剖面。第10天，心肌细胞、毛细血管和细动脉的比例较低，但胶原蛋白含量高于第20天。借助Ki67估计细胞生长，第10天较大，而第20天减小(补充的信息)。
检测心肌细胞中的肌球蛋白、α-肌节肌动蛋白，α-心脏辅肌动蛋白，N钙粘着蛋白和连接蛋白43(图31m-t，补充的信息)。第10天心肌细胞体积小，很少被检测到横纹肌肌节，而且N-钙粘着蛋白和连接蛋白43几乎都在胞浆中(图31m，n，q，r)。心肌细胞的平均体积是1500μm3，并且形成了13.9 x 106个心肌细胞。第20天心肌细胞紧密堆集在一起，肌纤维更为丰富；N-钙粘着蛋白和连接蛋白43限定闰板中的筋膜粘着和缝隙连接(图31o，p，s，t)。心肌细胞平均体积为3400μm3并且存在13 x 106个心肌细胞。
原位连接有单一碱基突出的发夹寡核苷酸探针，检测心肌细胞凋亡。为检查细胞凋亡取样的细胞核数目是第10天30464个，第20天12760个。从第10天到第20天，心肌细胞数目的保存是与Ki67标记减少和细胞凋亡增加相一致的(0.33±0.23％至0.85±0.31％，P<0.001)，因此，早期心肌细胞增值占优势，而后期细胞增大占优势。第10-20天血管数目接近加倍。
以前已经描述了确定新生心肌细胞的力学特性的方法30。将从梗塞后处理的大鼠(n＝4)体内分离的心肌细胞放到含有1.0mM Ca2+的细胞浴中(30±0.2℃)，用0.5Hz的去极化矩形脉冲电流刺激，两次舒张压强度的阈值间隔为3-5毫秒。从电脑中存储的视频图像获取力学参数。第20天，检测得自处理的心脏的梗塞和未梗塞区域的心肌细胞的力学行为(图32a-e)。新生成的细胞有钙耐受性并对刺激有反应。然而，与剩余的心肌细胞相比，成熟细胞减少了峰值缩短和缩短速度；两组细胞到达峰值缩短的时间和到达50％再延长的时间相似(图33a-l)。发育中的心肌细胞和肌纤维几乎都分布在***；横纹肌的肌节条纹明显(图32a-e)。
细胞移植减小了梗塞区域的面积和心腔膨大，同时增加了心室壁的厚度和射血分数。梗塞的心室壁重新出现收缩，并且第20天终末舒张压、舒张压以及+和-dP/dt开始改善。处理的小鼠的舒张压低52％(补充的信息)。因此，心脏修复降低了舒张压并改善了心室行为，从而促进心脏结构上和功能上的矫正。尽管两组大鼠梗塞面积相同，但都出现了这种有益的效果。
移植细胞的定居、复制、分化，以及组织的再生需要c-kitPOS细胞和受损的心肌组织。注射到假手术大鼠体内的c-kitPOS细胞转移效果较差，而且不能分化。在梗塞区域边缘注射c-kitNEG细胞对心脏修复没有效果。
本文报道的Lin-c-kitPOS细胞多潜能表型，与鸡(113)、斑马鱼(114)、哺乳动物(115)的心脏细胞谱系检测(包括从各个不同谱系来源的心肌细胞、SMC和EC)形成明显的对照。然而，并不是所有的研究大能够达成一致(116)。因为这些试验(113、114、115、116)并没有说明任何标记细胞的发育潜力，就像本实验所作的，不同的结果可能作为一个特例代表了正常发育命运与发育潜力之间差异。另外，最近已报道了(101、52)利用人类胚胎干细胞(117)、始祖内皮细胞和克隆发生细胞(52)的可塑性作为修复受损心肌的工具。
实施例10：生长因子诱导的心脏干细胞迁移促进梗塞心肌的修复并改善清醒狗的局部和整 个心脏功能
除了下文描述的以外，也使用先前的非限制性实施例中描述的方法。
在啮齿动物，干细胞回归和分化使梗塞后的心肌再生所遗留下了一个未能回答的问题是，在大型哺乳动物中是否也会发生类似的心脏修复。而且，尚不知道新生成的心肌是否影响恢复收缩的梗塞部分的功能异常性。为了这个目的，对狗的血液动力学和局部心室壁功能进行长时间的仪器监测。同时也测量心搏动体积和射血分数。围绕左前降支冠状动脉，扩大水压咬合器以诱导心肌梗塞。四小时后，在梗塞区周边注射HGF和IGF-1，以动员和活化干细胞。对狗监测30天。生长因子使梗塞反向膨出而诱导慢性心脏修复：节片缩短从-2.0±0.7％增加到+5.5±2.2％，心搏工作从-18±11增加到+53±10mm x mmHg，心博体积从22±2增加到45±4ml，射血分数从39±3增加到64±4％。梗塞后8小时处理的狗的原始细胞数目从240±40个c-kitPOS细胞的底线增长到1700±400个细胞/mm2(远距离心肌)，4400±12000个细胞/mm2(边缘带)和3100±900个细胞/mm2(梗塞区域)。根据Ki67标记检测，在远距离、边缘带和梗塞区域的c-kit阳性细胞分别是48％、46％、26％。因此可见，这些细胞都在以高水平复制。未处理的梗塞狗基本上没有这些效果。冠状动脉堵塞后10至30天，对经植入晶体所限定的梗塞心肌进行定量分析，以补充急性实验。新生成的心肌组织从无规则的运动到规律的收缩，这种改变的特征在于心肌细胞的产生，体积从400μm3到16,000μm3不等，平体积为2,000±640μm3。有BrdU标记的内皮细胞和平滑肌细胞的阻力血管为87±48个/mm2组织。毛细血管数是小动脉的2-3倍。总之，有16±9％的梗塞被健康心肌所替代。因此，犬的居留的原始细胞可以从储存部位被动员到死亡的心肌处。干细胞的活化和分化促进梗塞心脏的修复，改善局部心壁的运动和全身血液动力学。
实施例11：在梗塞的心脏动员居留的心脏干细胞构成血管紧张素II造成的阻塞的另一个 重要治疗手段
除了下文描述的以外，也使用先前的非限制性实施例中描述的方法。
心肌梗塞两个主要的并发因素是肌肉组织的损失和心腔扩大，从而不利于左心室的修复并阻抑心脏工作。尝试干扰MI的有害影响，动员并活化居留的心脏干细胞以促进组织再生，并且投用AT1受体阻抗剂losartan(Los)(20mg/kg体重/天)，以减弱细胞肥大和室腔体积的扩大。在这个基础上，造成小鼠的MI并将动物分成四组：第一组为假手术组(SO)，第二组为梗塞组(MI)，第三组为投用losartan的梗塞组(MI-Los)，第四组为投用losartan和CSC的梗塞组(MI-Los-CSC)。心肌梗塞(MI)后一个月后杀死动物，并估测LV功能、梗塞范围以及心脏重建。也检测CSC处理的小鼠的心肌再生情况。基于心肌细胞的损失数量的多少，推测梗塞面积分别是LV的47％(MI)，51％(MI-Los)，和53％(MI-Los-CSC)。与发生心肌梗塞未处理的(MI)和单纯注射losartan的小鼠(MI-Los)相比，注射losartan和CSC的小鼠(MI-Los-CSC)受损心脏有更加良好的结果，心腔直径：与MI组比较为-17％，与MI-Los组比较为-12％；纵轴：与MI组比较为-26％(P<0.001)，与MI-Los组比较为-8％(P<0.02)；心腔体积：与MI组比较-40％(P<0.01)，与MI-Los组比较-35％(P<0.04)。MI-Los-CSC组左心室质量与心腔体积比例分别比MI和MI-Los组高47％(P<0.01)和56％(P<0.01)。MI-Los-CSC组的组织修复是900μm3，包括10 x 106个新的心肌细胞。而且，该组小鼠每平方毫米心肌组织中有70个小动脉和200个毛细血管。新生成的9mm3心肌组织使梗塞面积减小了22％(即从左心室的53％减到41％)。超声波心动描记显示，MI-Los-CSC组小鼠室壁梗塞区重新出现了收缩功能。血液动力学研究显示，MI-Los-CSC组小鼠有较低的LVEDP和较高的+和-dP/dt。总之，由CSC移位到梗塞区域所介导的心脏修复过程可以增强losartan对心室修复的积极影响。被动员的心脏干细胞减少梗塞区面积和心室膨大，因此进一步改善了梗塞心脏的收缩行为。
实施例12：肝细胞生长因子(HGF)诱导c-met移位到细胞核，激活GATA-4的表达和心脏 肝细胞(CSC)的分化
除了下文描述的以外，也使用先前的非限制性实施例中描述的方法。
在初步研究中，我们能够证明c-kit和MDR-1阳性CSC表达表面受体c-met。c-met是HGF受体，配体结合通过合成基质金属蛋白酶促进细胞迁移。然而，尚不知道c-met活化对心脏干细胞的生物学和功能是否还有其他影响。为此目的，我们使CSC上表达的c-met暴露于NSCM中的HGF(50ng/ml)，经细胞内在化和移位看是否对的生长因子有反应。
令人惊奇的是，聚集显微镜检查发现，c-met定位在这些保留了原始特征的受刺激的细胞的细胞核中。HGF对于c-met的这种不寻常的影响，提出了这样一种可能性，即被动员的受体可能与其他参予CSC的细胞生长和分化的核蛋白质相互反应。因为心脏的特异性转录因子GATA-4在细胞谱系的定型中起重要作用。使用免疫沉淀和蛋白质印迹法，检测出c-met和GATA-4的蛋白质复合物。单一HGF刺激后的时间依赖性分析，显示15分钟到第3天c-met和GATA-4复合物逐渐增加。原始细胞分化成心肌细胞和其他心脏细胞是与时间相联系的。为了确定c-met和GATA-4在DNA水平上的分子相互作用，对分离自经过一小时HGF刺激的细胞中的核提取物进行凝胶迟滞测定。使用包括GATA序列的探针得到一条移位带。但加入GATA-4抗体，却产生一条超移位条带。相反，加入c-met抗体减弱了GATA带的光密度。由于在c-met启动子中鉴定了GATA序列上游到TATA盒的序列，所以进行第二次移位分析。这种情况下，HGF刺激的细胞的核提取物产生出一条可在加入c-met抗体后减小的带。相反，GATA-4抗体则诱导了超移动带。因此，HGF在细胞核水平上介导c-met移位，可以赋予c-met转录因子功能，今后的研究将会证明是否DNA结合能够增强GATA-4的表达，导致未成熟心脏细胞的分化。
实施例13：分离和扩增人心脏干细胞及所用培养基的制备
在手术室无菌环境下收获心肌组织(平均重量1克或更少)。
使用425-450毫升DMEM/F12(Cambrex 12719F)、5-10％血清(50-75毫升血清得自100-150毫升病人血液，与心房心耳组织一起获得)、20ng/ml人重组bFGF(Peprotech I00-18B)、20ng/ml人重组EGF(Sigma E9644)、5μg/ml胰岛素(RayBiotech IP-01-270)、5μg/ml转铁蛋白(RayBiotech的IP-03-363)，5ng/ml***钠(Sigma S5261)、1.22mg/ml尿苷(Sigma U型3003)和1.34mg/ml肌苷(Sigma 1-1024)制备生长培养基。
将组织浸泡在加有生长培养基的无菌培养皿中，然后在无菌条件下切成小块(200-400毫克)。将每块组织放入1.2ml冻存管中，加入1ml冻存液(冻存液由与DMSO混合的生长培养基组成(9：1体积)；例如，9ml培养基与1ml DMSO混合)。
将冻存管放在程序降温盒中，预冷却在-70℃至-80℃，然后在-70℃至-80℃至少储存3天。
将样品放在37℃含70％乙醇-蒸馏水的水浴锅中解冻。2分钟后，将冻存管拿到超净台打开，用移液器吸走上清液，并加入生理盐水保持室温。然后将样品转移到100毫米培养皿中，用生理盐水洗两次。用Steri 250灭菌钳(Inotech)手工从心脏标本中分离纤维组织和脂肪。然后将样本转移到生长培养基中，剪成1-2mm2碎片。
将碎片铺敷在无盖培养皿中，附盖含上述富含5-10％人血清的生长培养基的盖玻片。将培养皿置于37℃含5％CO2的培养箱中。
接种组织1-2周后，可见CSCs的生长晕。在细胞扩增的整个过程中，每周更换两次培养基。培养基储存在4℃，使用前37℃预热。100mm培养皿中加8ml培养基。为保护培养碎片或细胞所产生的条件培养基，每次只更换6ml新鲜培养基。
再经过两周后，每个组织碎片周围生长大约5,000个心肌细胞的细胞簇。
在细胞汇合之前，吸走生长培养基，每皿加入4ml胰蛋白酶(0.25％)(Carnbrex cat#10170；不含内毒素)消化5-7分钟。加入6ml含血清的培养基终止反应。
然后使用Myltenyi免疫磁珠分选获得c-kitPOS细胞。通过间接技术进行细胞分选，其中利用抗c-kit H-300(sc5535 Santa Cruz)作为第一抗体并使用结合了抗兔抗体的免疫磁珠作为第二抗体(130048602 Miltenyi)。将从心肌样本中长出的细胞培养在15ml Falcon管中，并以850g4℃离心10分钟。除去培养基并将细胞重新悬浮在10ml PBS中。再以850g于4℃离心10分钟，洗细胞一次。去掉PBS后，将细胞沉淀物重新悬浮在975μl PBS中，然后转移到1.5ml管中。加入25μl抗c-kit抗体(相当于25μg抗体)H-300(sc-5535 SantaCruz)。在360度旋转的摇床上，4℃保温一小时。
保温后，以850g4℃离心10分钟，用1ml PBS重悬细胞并再次离心。然后在180度旋转摇床中使细胞在小瓶内与结合免疫磁珠的第二抗体(80μl PBS和20μl抗体)4℃保温45分钟。保温后，加400μl PBS，使细胞悬液通过磁性分离柱(Miltenyi 130042201)分选细胞。回收附着在分离柱上的C-kit+细胞并放在1.5ml管中。离心细胞并重悬在1ml 37℃预热的培养基内，接种在24孔板中。
之后使c-kit+细胞在生长培养基中扩增。3-4个月后((±1个月)，大约获得100万个细胞。在细胞扩增的过程中，每周更换两次培养基。培养基储存于4℃，使用前37℃预热。在24孔板中，每孔使用1ml培养基。为了获得注射所需的细胞数，在细胞汇集之前传代3次：1)35mm培养皿中加2ml培养基；2)60mm培养皿中加4ml培养基；3)100mm培养皿中加8ml培养基。为保护培养细胞所产生的条件培养基，每次传代只更换培养基的2/3。
利用c-kit抗体和抗心肌谱系定型(即心肌细胞，内皮细胞，平滑肌细胞)的其他标志物的抗体，以免疫细胞化学和荧光激活细胞分选仪(FACS)分析c-kit+细胞(CSCs)的特征。所说的标志物包括：(a)转录因子如GATA4、MEF2C、Etsl和GATA6和(b)其他抗原如a-横纹肌肌节肌动蛋白、肌钙蛋白I、肌球蛋白重链(MHC)、连接蛋白43、N-钙粘着蛋白、冯·维勒布兰得因子(von Willebrand因子)和平滑肌肌动蛋白。如果需要，还可以分析细胞的其他标志物和/或抗原决定部位，包括flik-1。
为了活化CSC，将CSC与添加了200μg/ml干细胞生长因子和200ng/ml***-1的培养基保温两个小时。
实施例14：人心脏干细胞的分离和扩充以及其在治疗心肌梗塞中的使用
经上述51位经历了心脏外科手术的患者的同意，取得丢弃的心肌样品。将样品研碎后接种于未包被的培养皿的表面上，培养皿中分别添加有肝细胞生长因子(200ng/ml)和类胰岛素生长因子-I(200ng/ml)。有29个样品的细胞正常扩增。接种后大约4天长出细胞，两周以后每个组织周围大约有5000～7000个细胞(图70A-C)。用免疫微球从生长的细胞中筛选出c-kit类型的细胞并培养之(Beltrami，2003；Linke，2005)。用上述的免疫细胞化学和FACS鉴定细胞表型(Beltrami，2003；Oric，2001；Urbanek，2005)。固定筛选的c-kitpos细胞并检查心脏细胞、骨骼肌、神经以及造血细胞谱系的标志物(见下列表1)，以确定谱系阴性(Lin-)-hCSCs(Beltrami，2003；Linke，2005；Urbanek，2005)。第P0代从心肌样品长出的部分细胞表达了干细胞抗原c-kit、MDR1和类Sca-1(图.70D-F)；它们分别占整个细胞群体的1.8±1、7％，0.5±0.7％和1.3±1.9％。这些细胞是造血细胞标志物阴性的，所说的标志物包括CD133，CD34，CD45，CD45RO，CD8，CD20和血型糖蛋白A(下列表1)。
表1.阴性谱系(Lin-)CSCs和早期定型细胞(ECCs)的鉴定
Figure A200780013458D00671
表格1：直接标记技术相当于利用荧光色素连接的第一抗体，而间接标记技术则需要使用未连接的第一抗体和荧光素连接的第二抗体。所采用的荧光素连接的第一抗体的混合物包括：*混合剂1，§混合剂2，
Figure A200780013458D00682
混合剂3，
Figure A200780013458D00683
标志4。QD指示用量子点(GD)直接标记第一抗体；间接/QD指示用GD直接和间接标记。
一些细胞中存在心脏转录因子GATA4和心肌细胞转录因子MEF2C。很多细胞表达了肌细胞、SMCs和EC胞浆蛋白。某些细胞呈神经丝200阳性(图.70G-J)。对未分级分离的细胞的FACS分析进一步证实了得自免疫标记的数据。为了进行细胞化学分析，可以用荧光色素或者量子点直接标记抗体，以避免交叉反应和自体荧光(表1)(Linke，2005；Urbanek，2005)。表2中列出了用于未分级分离细胞的FACS分析和c-kitPOS细胞的抗体(Beltrami，2003；Urbanek，2005)。
表2.用于FACS分析的抗体
Figure A200780013458D00684
Figure A200780013458D00691
表2：直接标记技术相当于利用荧光色素连接的第一抗体，而间接标记技术则需要使用未连接的第一抗体和荧光素连接的第二抗体。(PE：藻红蛋白；FITC：异硫氰酸荧光素；MDR：多药物抗性；PECAM-1：血小板内皮细胞粘附分子1；VEGF-R2：血管内壁生长因子受体2。
鉴于以前的动物实验结果(Beltrami，2003；Linke，2005)，在P0代用免疫微球分选细胞的c-kit类型。c-kitPOS细胞包括Lin-细胞(52±12％)、早期免疫定型细胞(48±12％)(图71A)。在迅速连接的人血清存在下铺敷c-kitPOS细胞，继续生长至第P8代，约有25个细胞群体加倍。在P8代，细胞保持稳定的表型并且没有停止生长和发生衰老。从第P1代到第P8代，c-kitPOS细胞的百分数没有变化，平均为71±8％。从P1到P8，Ki67POS-循环细胞(图71B)维持恒定，平均48±10％。然而，6±4％的细胞表达了p16INK4a(为一种细胞衰老的标志物)(图71C)。FACS分析表明，c-kitPOS细胞仍然对造血细胞系谱有负面作用，大部分都表达与Ki67密切相关的转铁蛋白受体CD71(图71D)。根据没有心脏细胞的细胞核和胞浆蛋白质，确认63±6％的c-kitPOS细胞处于未分化状态(表1)。发现62±14％的c-kitPOS细胞有中间丝巢蛋白(其为无茎指征)(图71E-G)。
克隆试验
在原(P0)代于显微镜控制下分选人c-kitpos细胞，以每孔0.25-0.5个细胞的密度将单个c-kitpos细胞培养在Terasaki平板单一小孔中(图71H)(Beltrami，2003；Linke，2005)。将含有多于一个细胞的孔排除掉；保留下来的小孔中40-60％的c-kitpos细胞是Lin-。5天中每天添加3次BrdU(10uM)(Beltrami，2003；Linke，2005)。大约3-4周后，6700个单独培养的细胞产生了53个小克隆。因此，c-kitPOS-hCSCs有0.8％的克隆效率。在克隆中，细胞的数量由200个到1000个不等(图71I)。在这53个克隆中，有12个没有继续生长。扩增剩余的41个克隆并以免疫细胞化学方法定性。倍增时间为29±10小时，5天后90±7％的细胞为BrdUPOS。使用***诱导分化(Beltrami，2003；Linke，2005)，结果检测到心脏细胞谱系。它们包括肌细胞、SMCs和ECs(图71J)。心肌细胞是占优势的细胞群体，其次是ECs和SMCs(图75)。
心肌梗塞
在麻醉的雌性免疫缺陷Scid小鼠(Urbanek，2005)和用标准免疫抑制方法(Zimmermann，2002)处理过的Fischer344大鼠(Beltrami，2003)中产生心肌梗塞。从作过上述心脏手术的8个病人的心机样本中分离C-kitpos细胞(每个病人取大约三个样本)。在这些研究中，当每份样本中得到大约200,000个c-kitpos细胞时，在P2代收集这些细胞。这种方法需要大约7周。冠状血管阻塞后不久，在边界带的相对位点两次注射大约40,000个人c-kitpos细胞(Beltrami，2003；Orlic，2001；Lanza，2004)。在梗塞和细胞移植后2-3周，将动物暴露于BrdU并杀死(Beltrami，2003；Orlic，2001；Urbanek，2005；Lanza，2004)。在测量左心室压(LV)和dP/dt之前2-3天进行超声心动描记术检查(Beltrami，2003；Orlic，2001；Urbanek，2005；Lanza，2004)。使心脏停止在舒张期并灌注***进行固定。检测每个心脏的梗塞大小、人类肌细胞的形成、微动脉和毛细血管数(Anversa，2002)。
25个只处理的小鼠中有17只(68％)，19只处理的大鼠中14只得到修复(74％)。为更合理的解释重建梗塞的失败的原因，将c-kitpos细胞与罗丹明荧光素标记的微球体一同注射，以便识别注射位点并正确投用细胞(Leri，2005；Kajstura，2005)。将未成功处理的动物视为成功处理的动物的恰当对照。为了使实验更为完善，给12只免疫缺陷的梗塞小鼠和9只免疫抑制的梗塞大鼠注射PBS并用作额外对照。所有各组的梗塞大小相似，小鼠平均为48±9％，大鼠平均为52±12％.
所有病例中都存在人心肌，其中在梗塞小鼠和大鼠的边缘内适当地递送人c-kitpos细胞。人类心肌的这些病灶定位于梗塞内，并且可以通过用Alu探针检测人DNA序列识别出来(Just，2003)。在小鼠中丢失的心肌重建范围小鼠为1.3±0.9mm3，大鼠为3.7±2.9mm3(图72A-C)。结构的BrdU标记也决定了新生成的细胞的积聚；观测的整个阶段都给动物投用BrdU。虽然人c-kitPOS细胞得自8个病人，但是在心脏修复的程度上，不同人的细胞并没有明显的区别。组织再生的可变性并不依赖于细胞的来源，从而提示还有其他因素影响被处理的心脏的恢复。
用人Alu DNA序列识别处理的大鼠的梗塞部分，进一步证实了人心肌的形成。另外，用人Alu DNA也鉴定出了人MLC2v DNA序列(图72D)。在同一只动物中，存活的心肌并不含有人Alu或人MLC2v DNA序列。存活的心肌中存在大鼠MLC2v DNA。
在处理的小鼠中，人心肌由紧密接合在一起的心肌细胞组成，其占据了新生组织的84±6％，而阻力小动脉和毛细动脉总共只占了7±3％。经过处理的大鼠相应的值为83±8％和8±4％。检测分散于整个梗塞区的人心肌细胞、SMC和EC，连同分离的人血管剖面(图76)。在未成功注射的梗塞大鼠或用PBS处理的动物中未发现人心肌细胞、SMC和EC。
原位杂交和PCR
用FITC标记的探针对人特殊性Alu重复序列进行原位杂交，以检测人细胞(Biogenex)(Just，2003)。另外，鉴定人X染色体，以及大鼠和小鼠的X染色体(Quaini，2002)。从应用人细胞处理的大鼠活的梗塞的LV组织切片中提取DNA。然后对人的Alu序列(长度约300个碱基对；特别是发现于原始基因组中；占人基因组的10％以上；并且在人类的基因组中定位平均距离为4千碱基)，和小鼠及人肌球蛋白轻链2v序列进行PCR操作(见下列表3)。
表3.识别大鼠和人细胞：检测肌球蛋白轻链2v基因和Alu序列
Figure A200780013458D00711
表3：每份样品均与15μl铂PCR BlueMix溶液(Initrogen)和各0.2μM引物混合，然后进行PCR。PCR反应操作如下：94℃ 30秒；94℃ 30秒循环35次，60℃ 30秒，接着72℃ 1分钟；72℃ 3分钟。最后在2％琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物。
为了避免第二抗体的非特异性标记，直接用荧光染料标记大多数第一抗体(表1)。尽管采取了上述预防措施，但用这种方法仍不可能消除最低水平的自身荧光在组织切片上的黏附(Leri，2005；Linke，2005；Urbanek，2005)。可能的话，为了排除这种人为来源，将第一抗体与量子斑点共轭接合；这些半导体粒子发射的波长超出自身荧光的范围，从而排除这种混淆的变量(Leri，2005)。量子斑点标记应用于鉴定转录因子、心肌细胞的胞浆和膜蛋白质、再生的人心肌中的平滑肌细胞和内皮细胞。
用Alu探针识别人细胞后，检测带有转录因子GATA4和MEF2C的新生心肌细胞中的心脏肌球蛋白重链和肌钙蛋白。另外，在这些发育中的心肌细胞的表面也鉴定出来了接合蛋白质连接蛋白43和N-钙粘着蛋白(图72E-J)。在条间部也明显可见层粘连蛋白。人心肌细胞的大小有很大不同，两种动物模型中可以从100到2900μm3不等(图77)。
将女性人细胞注射到梗塞的雌性小鼠和大鼠体内。因此，鉴定人X染色体及小鼠和大鼠X染色体，以检测人细胞是否与小鼠和大鼠细胞融合。结果发现，在新形成的心肌细胞、冠状小动脉和毛细管剖面都没有人X染色体与大鼠或小鼠X染色体共同定位(图73H-M)。重要的是，人类心肌细胞、SMC和FC最多携带两个X染色体。因此，细胞融合并没有在嵌合的梗塞心脏内人心肌形成中起显著作用。
人的心肌特征
除人SMC和EC以外，所构成的冠状动脉和毛细血管证明，注射c-kitpos细胞介导了血管形成(图73A-F)。在大鼠及小鼠冠状血管中，没有看到人平滑肌细胞(SMC)和内皮细胞(EC)的整合。我们绝没有发现由人和非人细胞形成的血管。在大鼠及小鼠中人小动脉和毛细血管的数目差不多，并且两种情况下每8个心肌细胞有一个毛细血管(图73G)。此外，氧弥散距离平均为18μm。这些毛细血管参数与见于人胎儿后期和新生儿心脏的参数形似(Anversa，2002)。
人心肌是有功能活性的
为了确定再生的人心肌是否能够胜任功能并且是否恢复了部分梗塞心脏的功能，在记录透壁梗塞的组织学改变之后，在有或没有新形成的人心肌存在下，进行追朔性的超声心动描记图检查(图74A-C；图78)。在心室壁梗塞区域中，心肌的再生与可检测的收缩功能有关；而在没有发生组织重建时，情况绝不是这样。人心肌的形成增加了梗塞心室的射血分数(图74D)。再者，心肌再生会减小心房扩张，增加LV质量对室腔体积的比例(图74E)，梗塞后通过限制LVEDP的升高、降低LVDP以及正和负dP/dt来改善整个心室的功能(图74F)。
该实施例所有结果都是平均值±标准差。使用Student＇s试验和Bonferroni方法确定显著性(Anversa，2002)。
实施例15：心脏干细胞形成大的冠状动脉-生物旁路
为了比较注射用HGF和IGF-1(活化的CSC)活化的克隆发生EGFPPOS-c-kitPOS-CSCs(未活化的CSCs)和EGFPPOS-c-kitPOS-CSCs对血管堵塞的影响，用标准方法阻塞Fischer344大鼠的左冠状动脉。在接近闭塞的左冠状动脉附近植入未活化CSCs或活化的CSCs(在植入前2小时活化)。由于结扎线的解剖位置不同，使这些细胞植入的位点远离心室壁的梗塞区域(图82)。接种在心肌内的未活化的CSC显示高的凋亡速率，从12和24小时逐渐增加到48小时(图83)。在1-2周内，植入的细胞死亡以致完全消失。相反地，植入生长因子活化的CSC则检测到显著的积极效果(图79a)。回归到心肌处的活化的CSCs最初凋亡胜过细胞复制，然后细胞***超过细胞死亡(图79b-d)。
虽然活化和未活化的CSCs在注射部位积累在未受损心肌心肌内，但细胞植入却受到活化细胞的限制。植入需要合成的表面蛋白质，以建立细胞间的接触以及细胞与细胞外基质的相互作用(Lapidot，2005)。连接蛋白43、N-和E-钙粘着蛋白以及L-选择蛋白只在大部分活化的CSC中表达(图79e)。在心肌的未活化CSC细胞簇中没有这些连接和粘附蛋白质。
凋亡没有影响到植入的细胞，而仅仅涉及非植入的细胞(图79f)。这种现象与非移植细胞的失巢相符合，其中因缺乏细胞间的接触而引发了细胞的程序性细胞死亡(Frisch，2001；Melendez，2004)。
为了验证生长因子对CSCs的活化在细胞移植中所发挥的作用，而且验证细胞植入与缺血性损伤无关，在非梗塞对照大鼠的完整心肌内注射活化的CSCs。一个月后，大量的细胞出现于心外膜区域(图79g)。这些细胞表达了连接蛋白43和45、N和E-钙粘着蛋白以及L-选择蛋白。植入的细胞保留了未分化表型，很可能是由于缺乏组织损伤，并缺乏再生丢失的心肌的必要物质(Beltrami，2003；Orlic，2001；Mouquet，2005)。
处理后第2天定量测量显示，注射的80,000-100,000个未活化的CSC中只有大约5％(4,800±2,600)存在于心肌中。递送活化CSC后，检测到有大量的细胞表达EGFP。然而，他们显然少于所投用的细胞总数(48,000±13,000个)。这些细胞分别是未植入和植入的CSC的死亡和***产物。
为了判断因为冠状动脉闭塞所造成的心肌环境的变化，是否影响了活化的CSC分化成血管平滑肌和内皮细胞，确定低氧诱导因子-1(HIF-1)和SDF-1的表达(低氧诱导因子-1是SDF-1(即趋化因子12)的转录调节剂)，因为HDF-1和SDF-1两者都受缺血的上调(Abott，2004；Ceradini，2005)，并可能与组织内的氧梯度有关(Butler，2005)。心肌的这种反应可见于梗塞心脏的纵向切片中，其中低氧程度从梗塞心室的基部到中部和顶部逐渐增加。相反，在心脏的顶端死亡的心肌HIF-1和SDF-1的表达很少，中部区域中等，并且接近基部活心肌的缺血部位高度明显。HIF-1和SDF-1限于血管壁的内皮细胞衬层。免疫标记与蛋白质印迹法测定的HIF-1和SDF-1表达和用ELISA法测定SDF-1水平相符合。
冠状动脉结扎手术和处理后一个月和两周，检测活化的CSC对梗塞心脏中传导性冠状动脉和其分支的发育的影响。选择这些时间点是因为大鼠出生后冠状动脉树成熟大约需要1个月的时间(Anversa，2002)，尽管出生后10至15天就出现血管的显著生长(Olivett，1980；Rakusan，1984)。梗死和细胞移植后2周，在靠近注射位点的心肌外膜中发现大的新生成的EGFP阳性冠状动脉(图80a，b)。所产生的血管只透过周围心肌和接近阻塞冠状动脉的低部梗塞边缘区。直径大于或等于150μm的传导性动脉具有一个限于心室基底和上中部活心肌的内部弹性层。相比之下，左冠状动脉起端的直径为大约275μm。在邻近或远离的再生血管的活的心肌中，没有发现新形成的EGFP阳性心肌细胞。这一点为CSC对器官的区域要求有选择性反应提供了证据，这似乎是由于干细胞生长和分化的条件所致(Baxter，2000)。
直径小于25μm的小阻力小动脉的存在限于有瘢痕形成的梗死区(图80c)。在两周时没有在其余心肌内检测到这样大小的阻力小动脉。同样，少量毛细血管也只存在于梗塞的心肌中。在所有这些情况下，血管壁都是无例外地由EGFP阳性SMC和EC组成的。再生的血管中没有EGFP阴性SMC或EC。这就排除了血管形成中已有的SMC和EC与谱系定型的活化的CSC协同作用的可能性。血管生成似乎是在这些条件下血管生长的唯一机制。
梗塞和细胞治疗后观察一个月，确定是否新形成的冠状血管代表了继后萎缩的或变成有功能活性的血管的临时血管。这个间隔时间不仅关系到检查其他血管生长，而且也关系到梗塞愈合的表征。啮齿动物梗塞愈合完成要大约4周的时间(Fishbein，1978)，并导致坏死组织内III型和I型胶原蛋白的蓄积。瘢痕形成的心肌至多包含有几个分散的血管，因为现有血管大多在愈合早期因凋亡而逐渐死亡(Cleutjens，1999)。因此，于2周和一个月检测梗塞和未梗塞的心肌中不同类别的EGFP阳性冠状血管的分布。
一个月时，活的心肌和室壁梗塞区域存在有许多直径范围为6至250微米的EGFP阳性冠状血管，提示时间导致冠状动脉血管的扩展。一个月时，检测多余心肌和心室壁梗塞部分中的大、中、小型冠状动脉和小动脉连同毛细血管剖面。正如第2周所注意到的，再生的血管只由EGFP阳性SMC和EC组成(图84)。这些观察得到定量分析结果的支持，表明各类冠状血管都有一个月的发育期(图80d)。因此，活化CSC能够从头产生大鼠冠状动脉血管树的各个部分。
为了评估CSC的实际生长潜力，检查居留的EC和SMC与注射的CSC之间是否有涉及融合过程的冠状动脉和毛细血管重建(Wager，2004)。检测血管壁内EGFP阳性EC和SMC核中的性染色体，确定异核体的形成(Urbanek，2005a；Urbanek，2005b；Dawn，2005)。因为雌性克隆发生性CSC植入到了雌性动物的的心脏中，所以可以按照EISH方法鉴定新形成的血管中X染色体的数量(图80e)。在所有情况下，在再生的EC和SMC中大多发现两条X染色体，提示在由活化的CSC恢复冠状血管中，细胞融合所发挥的作用很小。
为了确定是否新的心外膜冠状血管在功能上是与主动脉和现有冠脉循环联系的，就要利用来自体内的制备物。用含有若丹明标记的葡聚糖的充氧Tyrode溶液(70,000兆瓦；红色荧光)通过主动脉连续逆行灌注心脏。葡聚糖这种分子并不能跨越内皮细胞屏障，它允许用双光子显微镜看到整个冠状动脉血管(Urbanek，2005；Dawn，2005)。由于生物结构散射激光(Helmchen，2005)，所以这一分析只限于心外膜的最外约150微米；心室壁的厚度约2.0毫米。分别根据缺乏和存在壁的EGFP标记(绿色荧光)区分居留和新生成的冠状血管。根据二次谐波的产生(蓝色荧光)检测组织胶原蛋白，其中所说的二次谐波是双光子激发和胶原蛋白的周期性结构的结果(Schenke-Layland，2005)。推测胶原蛋白的分散定位符合活的心肌，而胶原蛋白的广泛聚集被解释为有代表性的梗塞心肌。
2周时在处理的大鼠未梗塞心外膜内，从主动脉灌注葡聚糖，鉴定直径近200微米和有EGFP阳性壁的大血管(图81a)。在靠近血管壁处可见有少量胶原蛋白。两周和1个月时，在有瘢痕形成的心肌中也发现有类似的血管(图81b-e)。有时，横切梗塞的心外膜区域的新冠状血管(图81c)被EGFP阳性细胞部取分代，这相当于再生心肌的分散灶(未显示)。如果分辨率允许，可以鉴定原有的(EGFP阴性壁)和新产生的(EGFP阳性壁)冠状血管之间的直接接合(图81f)，有数据证明了冠状血管树的这些暂时不同的、老的和新的部分的整合。
以细胞治疗方法改善冠脉循环是与减轻心室扩张和增加室壁厚度/室腔半径以及心室质量/室腔体积比例相联系的(图81g)。这些结构上变量对心功能及心肌负荷有显著影响(Pfeffer，1990)。正如所预料的，再生冠脉循环没有减小心肌梗塞面积(图81g)。冠血管结扎后不久引入细胞治疗，由闭塞的冠状动脉供应的心肌细胞在4-6小时死亡(Anversa，2002)。然而，左心室血液动力学的改变，包括终末舒张压、舒张压、正和负dp/dt，以及舒张期压应力都因改善了细胞治疗介导的冠脉灌注，而得到有部分地降低(图81h)。
实施例16：在大型动物模型中基于导管的冠状血管内运送心脏干细胞
为双重目的对猪实施开胸手术：1)切除和收获心房附件(心耳)组织，2)通过阻断远端左前降支90分钟然后再灌注诱发心肌梗塞。从心房附件(心耳组织)收获CSC，按上所述方法体外培养和扩大，然后冠脉内注射，并在2-3个月后(平均86天)再次对同一只猪注射。7只猪接受冠脉内的CSC注射，同时8只猪接受赋形剂注射。对所有猪进行一系列实验，检查心肌标志物、二维超声心动图，并对部分猪进行侵入性血液动力学监测以及它们内部器官的详细组织病理学检查。在心脏和组织病理学检查的各个器官中，没有显示与CSC治疗有关的不良影响，并且经过治疗的猪倾向于改善了心功能。这些结果进一步证实了在大的缺血性心肌病模型中冠脉内运送CSC的安全性和可行性。
参考文献
1.Abott，J.D.et al.Stromal cell-derived factor-lalpha plays a critical role in stem cellrecruitment to the heart after myocardial infarction but is not sufficient to induce homing inthe absence of injury.Circulation 110，3300-3305(2004).
2.Aicher，A.et al.Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization ofstem and progenitor cells.Nat.Med.9，1370-1376(2003).
3.Alvarez-Dolado M，Pardal R，Garcia-Verdugo JM，et al.Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons，cardiomyocytes and hepatocytes.Nature 2003；425：968-73.
4.Amado LC，Saliaris AP，Schuleri KH，et al.Cardiac repair with intramyocardialinjection of allogeneic mesenchymal stem cells after myocardial infarction.Proc Natl AcadSci USA 2005；102：11474-9.
5.American Heart Association.2001 Heartand Stroke Statistical Update.Dallas，Texas：American Heart Association，2000.
6.American Heart Association：Heart Disease and Stroke Statistics-2005 Update.URL:www.americanheart.org/downloadable/heart/1105390918119HDSStats2005Update.pdf
7.Anderson，D.J.“Stem cells and pattern formation in the nervous system：the possibleversus the actual.”Neuron(2001)30，19-35.
8.Anversa，P.& Olivetti，G.Cellular basis of physiological and pathological myocardialgrowth.In Handbook of Physiology：The Cardiovascular System：The Heart.(eds.Page，E.，Fozzard，H.A.& Solaro，R.J.)75-144(Oxford University Press，Oxford，2002).
9.Anversa，P.and Kajstura，J.“Ventricular myocytes are not terminally differentiated inthe adult mammalian heart.”Circ.Res.(1998)83，1-14.
10.Anversa，P.and Nadal-Ginard，B.，“Myocyte renewal and ventricular remodelling.”Nature.(2002)；415(6868)：240-3.
11.Arsenijevic，Y.and Weiss，S.，J.Neurosci.“Insulin-like growth factor-I is adifferentiation factor for postmitotic CNS stem cell-derived neuronal precursors：distinctactions from those of brain-derived neurotrophic factor.”J Neurosci.(1998)18(6)：2118-28.
12.Arsenijevic，Y.et al.，“Insulin-like growth factor-I is necessary for neural stem cellproliferation and demonstrates distinct actions of epidermal growth factor and fibroblastgrowth factor-2.”J Neurosci.(2001)21(18)：7194-202
13.Asahara，T.et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science 275，964-967(1997).
14.Bache，R.J.Effects of hypertrophy on the coronary circulation.Prog.Cardiovasc.Dis.30，403-440(1988).
15.Balsam LB，Wagers AJ，Christensen JL，Kofidis T，Weissman IL，Robbins RC.Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium.Nature 2004；428：668-73.
16.Bautz，F.et al.，“Expression and secretion ofvascular endothelial growth factor-A bycytokine stimulated hematopoietic progenitor cells.Possible role in the hematopoieticmicroenvironment.”Exp Hematol 2000 June；28(6)：700-6.
17.Baxter，A.G.The cells that knew too much.J.Clin.Invest.105，1675(2000).
18.Beardsle，M.A.et al.，“Rapid turnover of connexin 43 in the adult rat heart.”Circ.Res.(1998)83，629-635.
19.Beltrami AP，Barlucchi L，Torella D，et al.Adult cardiac stem cells are multipotentand support myocardial regeneration.Cell 2003；114：763-76.
20.Beltrami，A.P.et al.“Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardialinfarction.”N Engl J Med.(2001)344(23)：1750-7.
21.Beltrami，A.P.et al.，“Chimerism of the transplanted heart.”N Engl J Med.(2002)346(1)：5-15.
22.Beltrami，A.P.et al.，Submitted(2002).
23.Beltrami，C.A.et al.，“Structural basis of end-stage failure in ischemiccardiomyopathy in humans.”Circulation(1994)89，151-163.
24.Bianco，P.et al.“Bone marrow stromal stem cells：nature，biology，and potentialapplications.”Stem Cells(2001)19：180-192.
25.Birchmeier，C.and Brohmann，H.，Curr.Opin.Cell Biol.12，725(2001).
26.Blackstone，E.H.& Lytle，B.W.Competing risks after coronary bypass surgery：theinfluence of death on reintervention.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.119，1221-1230(2000).
27.Blanpain C，Lowry WE，Geoghegan A，Polak L，Fuchs E.Self-renewal，multipotency，and the existence of two cell populations within an epithelial stem cellniche.Cell2004；118：635-48.
28.Blau，H.M.et al.，“The evolving concept of a stem cell：entity or function？”Cell.(2001)；105(7)：829-41.
29.Block，G.D.et al.，J.Cell Biol.132，1133(1996).
30.Blume et al.，“A review of autologous hematopoetic cell transplantation.”Biology ofBlood & Marrow Transplantation，(2000)6：1-12.
31.Bodine，D.M.et al.，“Efficient retrovirus transduction of mouse pluripotenthematopoietic stem cells mobilized into the peripheral blood by treatment with granulocytecolony-stimulating factor and stem cell factor.”Blood(1994)84，1482-1491.
32.Breier，G.et al.，“Molecular cloning and expression of murine vascular endotheiial-cadherin in early stage development of cardiovascular system.”Blood(1996)87，630-641.33.Britten，M.B.et al.Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment inpatients with acute myocardial infarction(TOPCARE-AMI)：mechanistic insights from serialcontrast-enhanced magnetic resonance imaging.Circulation 108，2212-2218(2003).
34.Brooker，G.J.et al.，“Endogenous IGF-1 regulates the neuronal differentiation of adultstem cells.”J Neurosci Res.(2000)59(3)：332-41.
35.Broudy，V.C.“Stem cellfactor and hematopoiesis.”Blood(1997)90，1345-1364.
36.Brugger et al.，“Ex vivo manipulation of hematopoetic stem and progenitor cells.Seminars in Hematology.”(2000)，37(1)：42-49.
37.Bunting，K.D.et al.，Blood 96，902(2000).
38.Butler，J.M.et al.SDF-1 is both necessary and sufficieht to promote proliferativeretinopathy.J.Clin.Invest.115，86-93(2005).
39.Caceres-Cortes，J.R.et al.，“Steel factor sustains SCL expressionand the survival ofpurified CD34+bone marrow cells in the absence of detectable cell differentiation.”StemCells(2001)January；19(1)：59-70.
40.Capasso，J.M.and Anversa，P.，Am.J.Physiol.263，H841(1992).
41.Caplan A.I.and Haynesworth S.E.，“Methodfor enhancing the implantation anddifferentiation of marrow-derived mesenchymal cells.”Filed November 16，1990.U.S.PatentNo.5,197,985
42.Carmeliet，P.Angiogenesis in life，diseaseand medicine.Nature 438，932-936(2005).
43.Ceradini，D.J.& Gurtner G.C.Homing to hypoxia：HIF-I as a mediator ofprogenitor cell recruitment to injured tissue.Trends Cardiovasc.Med.15，57-63(2005).
44.Ceradini，D.J.et al.Progenitor celltrafficking is regulated by hypoxic gradientsthrough HIF-1 induction of SDF-1.Nat.Med.10，858-864(2004).
45.Cheng，W.et al.“Aging does not affect the activation of the myocyte IGF-1 autocrinesystem after infarction and ventricular failure in Fischer 344 rats.”Circ.Res.(1996)78，536-546.
46.Chien KR.Stem cells：lost in translation.Nature 2004；428：607-8.
47.Chimenti C，Kajstura J，Torella D，et al.Senescence and death of primitive cells andmyocytes lead to premature cardiac aging and heart failure.Circ Res 2003；93：604-13.
48.Chiu et al.，“Cellular Cardiomyoplasty：Mycardial Regeneration With Satellite CellImplantation.”Ann.Thorac.Surg.(1995)60：12-18.
49.Cleutjens，J.P.M.，Blankesteijn，W.M.，Daemen，M.J.A.P.& Smits，J.F.M.Theinfarcted myocardium：Simply dead tissue，or a lively target for therapeutic interventions.Cardiovasc.Res.44，232-241(1999).
50.Clutterbuck，R.D.et al.，“G-CSF mobilization of.haemopoietic cell populations inSCID mice engrafted with human leukaemia.”Bone Marrow Transplant(1997)August；20(4)：325-32.
51.Coles，J.G.et al.，“Inhibition of Human Xenogenic or Allogenic Antibodies to ReduceXenograft or Allograft Rejection in Human Recipients”.Patent No.WO 95/34581A1，published December 21，1995.
52.Condorelli，G.et al.，”Cardiomyocytes induce endothelial cells to trans-differentiateinto cardiac muscle：implications for myocardium regeneration.”Proc NatlAcad Sci U S A.(2001)98(19)：10733-8.
53.Coultas，L.，Chawengsaksophak，K.&Rossant，J.Endothelial cells and VEGF invascular development.Nature 438，937-945(2005).
54.Couper，L.L.et al.，“Vascular endothelial growthfactor increases the mitogenicresponse to fibroblast growth factor-2in vascular smooth muscle cells in vivo via expressionof fms-like tyrosine kinase-1.”(1997)Circ.Res.81，932-939.
55.Dang NC，Johnson C，Eslami-Farsani M，Haywood LJ.Bone marrow embolism insickle cell disease：a review.Am J Hematol 2005；79：61-7.
56.Dawn，B.et al.Cardiac stem cells delivered intravascularly traverse the vessel barrier，regenerate infarcted myocardium，and improve cardiac function.Proc.Natl.Acad.Sci.USA102，3766-3771(2005).
57.Development.”(1993)Development 118(2)，489-498.
58.Dinsmore，J.“Procine Cardiomyocytes and Their Use in Treatment of InsufficientCardiac Function”.Patent No.WO 96/38544，published December 5，1996.
59.Durocher，D.et al.，“The cardiac transciption factors Nkx2-5 and GATA-4 are mutualcofactors.”EMBO J.16，5687-5696(1997).
60.Eisenberg，C.A & Bader，D.“QCE-6：a clonal cellline with cardiac myogenic andendothelial cell potentials.”Dev.Biol.(1995)167，469-481.
61.Field L.J.“Myocardial grafts and cellular compositions.”Filed June 7，1995.U.S.Patent No.5,733,727.
62.Field L.J.“Non-human mammal having a graftand methods of delivering protein tomyocardial tissue.”Filed November 16，1992.U.S.Patent No.5,602,301.
63.Field，L.J.“Myocardial Grafts and Cellular Compositions Useful for Same.”PatentNo.WO 95/14079A1，published May 26，1995.
64.Fielding et al.，“Autologous bone marrow transplantation.”Curr.Opin.Hematology，1994，1：412-417.
65.Fishbein，M.C.，Maclean，D.& Maroko，P.R.，Experimental myocardial infarction inthe rat：qualitative and quantitative changes during pathologic evolution.Am.J.Pathol.90，57-70(1978).
66.Frisch，S.M.& Screaton，R.A.Anoikis mechanisms.Curr.Opin.Cell Biol.5，555-562(2001).
67.Gillis S.“Method for improving autologous transplantation.”Filed September 26，1991.U.S.Patent No.5,199,942
68.Gritti，A.et al.“Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenicregulators for a single multipotent stem cell-like populationfrom the subventricular region ofthe adult mouseforebrain.”J.Neurosci.(1999)19，3287-3297.
69.Gussonietal.，“Normal dystrophin transcripts detectedin Duchenne musculardystrophy patients after myoblast transplantation.”Nature 356：435-438(1992).
70.Hamasuna，R.et al.“Regulation of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)byhepatocyte growth factor/scatter factor(HGF/SF)in human gliomacells：HGF/SF enhancesMMP-2 expression and activation accompanying up-regulation of membrane type-1MMP.”Int J Cancer.(1999)82(2)：274-81.
71.Helmchen，F.& Denk，W.Deep tissue two-photon microscopy.Nat.Methods 2，932-940(2005).
72.Hermann，H.and Aebi，U.“In Subcellular Biochemistrv：Intermediate Filaments.”Vol.31(ed.Herrmann，H.& Harris，E.)319-362(Plenum Press，New York，1998).
73.Hidemasa，O.et al.“Telomerase reverse transcriptase promotes cardiae muscle cellproliferation，hypertrophy，and survival.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，10308-10313
74.Hillebrands，J-L.etal.“Origin of neointimal endothelium and a-actin-positiv esmoothmuscle cells in transplant arteriosclerosis.”J.Clin.Invest.(2001)107，1411-1422.
75.Huang H.M.et al.，“Optimal proliferation of a hematopoietic progenitor cell linerequires either costimulation with stem cell factor or increase of receptor expression that canbe replaced by overexpression of Bcl-2.Blood.”1999Apr 15；93(8)：2569-77.
76.Ikuta，K.et al.，“Mouse hematopoietic stem cells and the interaction of c-kit receptorand steel factor.”International Journal of Cell Cloning 1991；9：451-460.
77.Jackson，K.A.et al.，“Hematopoietic potential of stem cells isolated from murineskeletal muscle.”Proc Natl Acad Sci U S A.(1999)96(25)：14482-6.
78.Jackson，K.A.etal.，J.Clin.Invest.(2001)107，1395.
79.Janowska-Wieczorek，A.et al.，“Autocrine/paracrine mechanisms in humanhematopoiesis.”Stem Cells 2001；19：99-107.
80.Jessup，M.& Brozena，S.Heart failure.N.Engl.J.Med.348，2007-2018(2003).81.Jo，D.Y.et al.，“Chemotaxis of primitive hematopoietic cells in response to stromalcell-derived factor-1.”The Journal of Clinical Investigation 2000 January；105(1)：101-111.
82.Just L，Timmer M，Tinius J，et al.Identification of human cells in brain xenograftsand in neural co-cultures of rat by in situ hybridisation with Alu probe.J Neurosci Methods2003；126：69-77.
83.Kachinsky，A.M.et al.，“Intermediate filaments in cardiac myogenesis：nestin in thedeveloping mouse heart.”(1995)J.Histochem.Cytochem.43，843-847.
84.Kajstura J，Rota M，Whang B，et al.Bone marrow cells differentiate in cardiac celllineages after infarction independently of cell fusion.Circ Res 2005；96：127-37.
85.Kajstura，J.et al.“Apoptotic and necrotic myocyte cell deaths are independentcontributing variables of infarct size in rats.”Lab.Invest.(1996)74，86-107.
86.Kajstura，J.et al.，“The cellular basis of pacing-induced dilated cardiomyopathy.Myocyte cell loss and myocyte cellular reactive hypertrophy.”(1995)Circulation 92，2306-2317.
87.Kanj et al.，“Myocardial ischemia associated with high-dose carmustine infusion.”Cancer，1991，68(9)：1910-1912.
88.Kasahara，H.et al.，“Cardiac and extracardiac expression of Csx/Nkx2.5homeodomain protein.”(1998)Circ.Res.82，936-946.
89.Kawada H，Fujita J，Kinjo K，et al.Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can bemobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction.Blood2004；104：3581-87.
90.Kawamoto A，Tkebuchava T，Yamaguchi J，et al.Intramyocardial transplantation ofautologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardialischemia.Circulation 2003；107：461-8.
91.Kedes，L.H.et al.，“Compositions and Methods for Transduction of Cells.”PatentNo.WO 95/12979A1，published May 18，1995.
92.Kehat，I.et al.“Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes withstructural and functional properties of myocytes.”J.Clin.Invest.(2001)108，407-414.
93.KeilF.et al.，“Effect of interleukin-3，stem cellfactor and granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor on committed stem cells，long-term culture initi ating cells and bonemarrow stroma in a one-step long-term bone marrow culture.”Ann Hematol.2000May；79(5)：243-8.
94.Kempermann，G.et al.，“Activity-dependent regulation of neuronal plasticity and selfrepair.”Prog Brain Res 2000；127：35-48.
95.Kim，C.H.and Broxmeyer H.E.，“In vitro behavior of hematopoietic progenitor cellsunder the influence of chemoattractants：stromal cell-derived factor-1，steelfactor，and thebone marrow environment.”Blood 1998 Jan1；91(1)：100-10.
96.Kocher，A.A.et al.，“Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis reduces remodel ing andimproves cardiac function.”Nature Medicine 2001 April；7(4)：430-436.
97.Koh et al.，“Differentiation and long-term survival of C2C12 myoblast grafts inheart.”Journal of Clinical Investigation 92：1548-1554(1993).
98.Krause，D.S.et al.，“Multi-organ，multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell.”Cell(2001)May；105(3)369-370.
99.Kronenwett，R.et al.，“The role of cytokines and adhesion molecules for mobilizationof peripheral blood stem cells.”Stem Cells 2000；18：320-330.
100.LaIuppa，J.A.et al.，“Evaluation of cytokines for expansion of the megakaryocyte andranulocyte lineages.”Stem Cells(1997)May：15(3)：198-206.
101.Lanza R，Moore MA，Wakayama T，et al.Regeneration of the infarcted heart withstem cells derived by nuclear transplantation.Circ Res 2004；94：820-7.
102.Lapidot，T.，Dar，A.& Kollet，O.How do stem cells find their way home？Blood 106，1901-1910(2005).
103.Lee，J.Y.et al.“Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscleregeneration and bone healing.”J.Cell Biol.(2000)150，1085-1099.
104.Leong FT，Freeman LJ.Acute renal infarction.JR Soc Med 2005；98：121-2.
105.Leor et al.，＂Transplantation of Fetal Myocardial Tissue Into the InfarctedMyocardium of Rat，A Potential Method for Repair of Infarcted Myocardium？＂Circulation94：(Supplement II)II-332-II-336(1996).
106.Leri A，Kajstura J，Anversa P.Cardiac stem cells and mechanisms of myocardialregeneration.Physiol Rev 2005；85：1373-416.
107.Leri A，Kajstura J，Anversa P.Identitydeception：not a crime for a stem cell.Physiology(Bethesda)2005；20：162-8.
108.Leri，A.et al.，Circ.Res.84，752(1999).
109.Li et al.，“Method of Culturing Cardiomyocytes from Human Pediatric VentricularMyocardium.”(1992)J.Tiss.Cult.Meth.；93-100.
110.Li et al.，＂In Vivo Survival and Function of Transplanted Rat Cardiomyocytes＂Circulation Research 78：283-288(1996).
111.Li et al.，“Cardiomyocyte Transplantation Improves Heart Function”(1996)TheSociety of Thoracic Surgeons；62：654-661.
112.Li et al.，“Human Pediatric and Adult Ventricular Cardiomyocytes in Culture：Assessment of Phenotypic Changes with Passaging”Feb.20，1996 Cardiovascular Research；1-12.
113.Li et al.，Cardiovascular Res.32：362-373(1996).
114.Li et al.，J.Mol.Cell.Cardiol.，26：A162(1994).
115.Li，B et al.，“Insulin-like growth factor-1 attenuates the detrimental impact ofnonocclusive coronary arteryconstriction on the heart.”(1999)Circ.Res.84，1007-1019.
116.Li，P.et.al.“Myocyte performance during evolution of myocardial infarction in rats：effects of propionyl-L-carnitine.”Am.J.Physiol.(1995)208，H1702-H1713.
117.Li，Q.et al.“Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects frommyocyte death after infarction，attenuating ventricular dilation，wall stress，and cardiachypertrophy.”J Clin Invest.100，1991-1999(1997).
118.Lin，Q.et al.，“Control of mousecardiac morphogenesis and myogenesis bytranscription factor MEF2C.”(1997)Science276，1404-1407.
119.Linke A，Muller P，Nurzynska D，et al.Stem cells in the dog heart are self-renewing，clonogenic，and multipotent and regenerate infarcted myocardium，improving cardiacfunction.Proc Natl Acad Sci USA 2005；102：8966-71.
120.Lopez LR，Schocket AL，Stanford RE，Claman HN，Kohler PF.Gastrointestinalinvolvement in leukocytoclastic vasculitis and polyarteritis nodosa.J Rheumatol 1980；7：677-84.
121.MacLellan，W.R.and Schneider，M.D.“Genetic dissection of cardiac growth controlpathways.”Annu.Rev.Physiol.(2000)62，289-319.
122.Malouf，N.N.et al.，“Adult derived stem cells fromthe liver become myocytes in theheart in vivo.”Am J Pathology 2001 June；158(6)1929-35.
123.Matsuura K，Nagai T，Nishigaki N，et al.Adult cardiac Sca-1-positive cellsdifferentiate into beating cardiomyocytes.J Biol Chem 2004；279：11384-91.
124.Maude GH.Bone marrow infarction in sickle cell anemia.Blood 1984；63：243.
125.Melendez，J.et al.Cardiomyocyte apoptosistriggered by RAFTK/pyk2via src kinaseis antagonized by Paxillin.J.Biol.Chem.279，53516-53523(2004).
126.Menasche，P.et al.，(2000)Lancet 357，279-280.
127.Messina E，De Angelis L，Frati G，et al.Isolation and expansion of adult cardiac stemcells from human and murine heart.Circ Res 2004；95：911-21.
128.Mikawa，T.&Fishman，D.A.“The polyclonal origin of myocyte lineages.”Annu.Rev.Physiol.(1996)58，509-521.
129.Mohr A，Zwacka RM，Jarmy G，et al.Caspase-8L expression protecis CD34+hematopoietic progenitor cells and leukemic cells from CD95-mediated apoptosis.Oncogene2005；24：2421-9.
130.Monga，S.P.et al.”Expansion of hepatic and hematopoietic stem cells utilizing mouseembryonic liver explants.”(2001)Cell Transplant.Jan-Feb；10(1)，81-89.
131.Morin，S.et al.，“GATA-dependent recruitment of MEF2 proteins to targetpromoters.”(2000)EMBO J.19，2046-2055.
132.Mouquet，F.et al.Restoration of cardiac progenitor cells after myocardial infarctionby self-proliferation and selective homing of bone marrow-derived stem cells.Circ.Res.97，1090-1092(2005).
133.Murray et al.，＂Skeletal Myobalst Transplantation for Repair of Myocardial Necrosis＂J.Clin.Invest.98：2512-2523(1996).
134.Murry CE，Soonpaa MH，Reinecke H，et al.Haematopoietic stem cells do nottransdifferentiate into cardiac myocytes in myocardialinfarcts.Nature 2004；428：664-8.
135.Musil，L.S.et al.，“Regulation of connexin degradation as a mechanism to increasegapjunction assembly and function.”(2000)J.Biol.Chem.275，25207-25215.
136.Nakamura T，Schneider MD.Theway to a human’s heartis through the stomach：visceral cndodcrm-like cells drive human embryonic stem cellsto a cardiac fate.Circulation2003；107：2638-9.
137.National Institutes of Health.“Stem Cells：A Primer.”National Iusitutes of Health：May 2000.
138.Noishiki et al.，“Angiogenic growth factor release system for in vivo tissuecngineering：a trial of bonc marrow transplantation into ischemic myocardium.”(1999)J.Artif.Organs，2：85-91.
139.Nygren JM，Jovinge S，Breitbach M，et al.Bone marrow-derived hematopoietic cellsgenerate cardiomyocytes at a lowfrequency through cell fusion，but not transdifferentiation.Nat Med 2004；10：494-501.
140.Oh H，Bradfute SB，Gallardo TD，et al.Cardiac progenitor cells from adultmyocardium：homing，differentiation，and fusion after infarction.Proc Natl Acad Sci USA2003；100：12313-8.
141.Olivetti，G.et al.，“Cellular basis of chronic ventricular remodeling after myocardialinfarction in rats.”(1991)Circ.Res.68(3)，856-869.
142.Olivetti，G.，Anversa，P.& Loud，A.V.Morphometric study of early postnataldevelopment in the left and right ventricular myocardium of the rat.II.Tissue composition，capillary growth，andsarcoplasmic alterations.Circ.Res.46，503-512(1980).
143.Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Bone marrow cells regenerate infarctedmyocardium.Nature 2001；410：701-5.
144.Orlic，D.et al.，(1993)Blood 91，3247-3254.
145.Orlic，D.et al.，“Mobilized bonemarrow cells repair the infarcted heart，improvingfunction and survival.”Proc Natl Acad Sci US A.(2001)98(18)：10344-9.
146.Page，D.L.et al.，“Myocardial changes associated with cardiogenic shock.”N Engl JMed.(1971)285(3)：133-7.
147.Pasumarthi，K.B.S.et al.，“Coexpression of mutant p53 and p193 renders embryonicstem cell-derived cardiomyocytes responsive to the growth-promoting activities of adenoviralE1A.”Circ Res.(2001)88(10)：1004-11.
148.Patchen，ML et al.“Mobilization of peripheral blood progenitor cells by PGG-glucan alone and in combination with granulocyte colony-stimulating factor.”StemCells(1998)May；16(3)：208-217.
149.Patel，A.N.，et al.，“Surigical treatment for congestive heart failure with autologousadult stem cell transplantation：A prospective randomized study.”The Journal of Thoracicand Cardiovascular Surgery(2005)Dec；130(6)：1631-38.
150.Perrin，E.C.，et al.，“Transendocardial autologous bone marrow cell transplantation forsevere，chronic ischemic heart failure.”Ciruclation(2003)；107：2294-2302.
151.Pfeffer，M.A.and Braunwald，E.“Ventricular remodeling after myocardialinfarction.”Circulation 81，1161-1172(1990).
152.Pfister O，Mouquet F，Jain M，et al.CD31-but not CD31+cardiac side populationcells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.Circ Res 2005；97：52-61.
153.Pollick，C.et al.，“Echocardiographic and cardiac Doppler assessment of mice.”(1995)J.Am.Soc.Echocardiogr.8，602-610(1995).
154.Powell，E.M.et al.，Neuron.30，79(2001).
155.Quaini，F.et al.“Chimerism of the transplanted heart.”(2002)N Engl JMed.346(1)：5-15N.
156.Rakusan K，Flanagan MF，Geva T，Southern J，Van Praagh R.Morphometry ofhuman coronary capillaries during normal growth and the effect of age in leftventricularpressure-overload hypertrophy.Circulation 1992；86：38-46.
157.Rakusan，K.Cardiac growth，maturation，and aging.In Growth of the Heartin Healthand Disease(ed Zak，R.)131-164(Raven Press，New York，1984).
158.Rao，M.S.and Mattson，M.P.“Stem cells and aging：expanding the possibilities.Mech.Ageing Dev.(1998)122，713-734.
159.Rappolee，D.A.et al.，Circ.Res.78，1028(1996).
160.Reiss，K.et al.，“Overexpression of insulin-like growthfactor-1in the heart is coupledwith myocyte proliferation in transgenic mice.”(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(16)，8630-8635.
161.Reya，T.et al.，“Stem cells，cancer，and cancer stem cells.”(2001)Nature414(6859)：105-11.
162.Roberts M.M.，et al.，“Prolonged release and c-kit expression of haemopoieticprecursor cells mobilized by stem cellfactor and granulocyte colony stimulating factor.”Br JHaematol.1999 Mar；104(4)：778-84.
163.Rosenthal，N.and Tsao，L.“Helping the heart to heal with stem ceHs” NatureMedicine 2001 April；7(4)：412-413.
164.Rossi DJ，Bryder D，Zahn JM，et al.Cellintrinsic alterations underlie hematopoieticstem cell aging.Proc Natl Acad Sci USA 2005；102：9194-9.
165.Saegusa M，Takano Y，Okudaira M.Human hepatic infarction：histopathological andpostmortem angiological studies.Liver 1993；13：239-45.
166.Sanderson，W.C.& Scherbov，S.Average remaining lifetimes can increase as humanpopulations age.Nature 435，811-813(2005).
167.Schenke-Layland，K.，Riemann，I.，Stock，U.A.&Konig，K.Imaging ofcardiovascular structures using near-infraredfemtosecond multiphoton laser scanningmicroscopy.J.Biomed.Opt.10，024017(2005).
168.Scholzen，T.，and Gerdes，J.“The ki-67 protein：from the known and the unknown.”J.Cell.Physiol.182，311-322(2000).
169.Seale，P.et al.“Pax7is required for the specification of myogenic satellite cells.”Cell(2000)102，777-786.
170.Sherman，W.“Cellular therapy for chronic myocardialdisease：nonsurgicalapproaches.”Basic Appl.Myol.(2003)；13(1)：11-14.
171.Shihabuddin，L.S.et al.，“Adult spinal cord stem cells generate neurons aftertransplantation in the adult dentate gyrus.”J.Neurosci.(2000)20，8727-8735.
172.Shimomura T.，et al.，“Thrombopoietin stimulates murinelineage negative，Sca-1+，C-Kit+，CD34-cells：comparative study with stem cell factoror interleukin-3.”Int J Hematol(2000)Jan；71(1)：33-9.173.Silver J.et al.，“Methods of reducing glial scar formation and promoting axon andblood vessel growth and/or regeneration through the use of activated immature astrocytes.”Filed October 27，1989.U.S.Patent No.5,202,120.
174.Simnett et al.“Autologous stem cell translantationfor malignancy：a systemic reviewof the literature.”Clin.Lab Haem.2000，22：61-72.
175.Smith D.A.and Townsend LE.“Method of isolation，culture and proliferation ofhuman atrialmyocytes.”Filed September 21，1995.U.S.Patent No.5,543，318176.Smith D.A.et al.，“Method for inducing human myocardial cell proliferation.”FiledApril 4，1995.U.S.Patent No.5,580,779
177.Soonpaa et al.“Formation of nascent intercalated disks between grafted fetalcardiomyocytes and host myocardium.”(1994)Science 264(5155)：98-101.
178.Stainer，D.Y.R.et al.，“Cardiovascular development in zebrafish.I.Myocardial fateand heart tube formation.”Development(1993)119，31-40.
179.Strobel，ES et al.“Adhesion and migration are differentially regulated inhematopoietic progenitor cells by cytokines and extracellular matrix.”Blood(1997)November l；90(9)：3524-3532.
180.Taylor，D.A.et al.(1998)Nature Med.4，929-933.
181.Temple，S.“Opinion：Stem cell plasticity-building the brain of our dreams.”NatRev Neurosci 2001 July；2(7)：513-520.
182.Terada，N.et al.Nature，Advanced online publication DOI：nature 730，(2002).
183.Thompson et al.Science 257：868-870(1992).
184.Tomita，S et al.(1999)Circulation 100(supplII)，II-247-II-256.
185.Tropepe，V.et al.“Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGFdeveloping mouse telencephalon.”Dev.Biol.(1999)208，166-188.
186.Urbanek K，Rota M，Cascapera S，et al.Cardiac stem cells possess growth factor-receptor systems that after activation regenerate the infarcted myocardium，improvingventricular function and long-term survival.Circ Res 2005；97：663-73.
187.Urbanek K，Quaini F，Tasca G，et al.Intense myocyte formation from cardiac stemcells in human cardiac hypertrophy.Proc Natl Acad Sci USA2003；100：10440-5.
188.Urbanek K，Torella D，Sheikh F，et al.Myocardial regeneration by activation ofmultipotent cardiac stem cells in ischemic heartfailure.Proc Natl Acad Sci USA2005；102：8692-7.
189.Urbich C，Dimmeler S.Endothelial progenitor cells：characterization and role invascular biology.Circ Res 2004；95：343-53.
190.Vassilopoulos G，Wang PR，Russell DW.Transplanted bone marrow regenerates liverby cell fusion.Nature 2003；422：901-4.
191.Vaughn et al.“Incorporating bone marrow transplantation into NCCN guidelines.”(1998)Oncology，12(11A)：390-392.
192.Wagers，A.J.& Weissman，I.L.Plasticity of adult stem cells.Cell 116，639-648(2004).
193.Wang X，Willenbring H，Akkari Y，et al.Cellfusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes.Nature 2003；422：897-901.
194.Wang，H.and Keiser，J.A.，“Hepatocyte growth factor enhances MMP activity inhuman endothelial cells.”Biochem Biophys Res Commun.2000；272(3)：900-5.
195.Watanabe K，Abe H，Mishima T，Ogura G，Suzuki T.Polyangitis overlap syndrome：afatal case combined with adult Henoch-Schonlein purpura and polyarteritis nodosa.Pathol Int2003；53：569-73.
196.Weimann JM，Johansson CB，Trejo A，Blau HM.Stable reprogrammed heterokaryonsformspontaneously in Purkinje neurons after bone marrow transplant.Nat Cell Biol2003；5：959-66.
197.Weimar，I.S.et al.，“，Hepatocyte growth factor/scatter factor(HGF/SF)is producedby human bone marrow stromal cells and promotes proliferation，adhesion and survival ofhuman hematopoietic progenitor cells(CD34+).”Exp Hematol.(1998)26(9)：885-94.
198.Xing，X.et al.，Am.J.Pathol.158，1111(2001).
199.Yamaguchi，T.P.et al.，“Flk-1，an flt-related receptor tyrosine kinase is an earlymarker for endothelial cell precursors.
200.Ying，Q-L.et al.，Nature，Advanced online publication DOI：nature729，(2002).
201.Yoon YS，Wecker A，Heyd L，et al.Clonally expanded novel multipotent stem cellsfrom human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction.J Clin Invest2005；115：326-38.
202.Yu，C.Z.et al.，Stem Cells 16，66(1998).
203.Zaucha，J.M.et al.“Hematopoietic responses to stress conditions in young dogscompared with elderly dogs.”Blood(2001)98，322-327.
204.Zimmermann WH，Didie M，Wasmeier GH，et al.Cardiac grafting of engineeredheart tissue in syngeneic rats.Circulation 2002；106：I151-7.
205.Ko，SH et al.，J Biol chem.2006(epub ahead of print)
206.Kanemura Y et al，Cell Transplant.14：673-682，2005
207.Kaplan RN et al，Nature 438：750-751，2005
208.Xu RH，Methods Mol Med.121：189-202，2005
209.Quinn J et al，Methods Mol Med.121：125-148，2005
210.Almeida M et al，J Biol Chem.280：41342-41351，2005
211.Barnabe-Heider F et al，Neuron 48：253-265，2005
212.Madlambayan GJ et al，Exp Hematol 33：1229-1239，2005
213.Kamanga-Sollo E et al，Exp Cell Res 311：167-176，2005
214.Heese O et al，Neuro-oncol.7：476-484，2005
215.He T et al，Am J Physiol.289：H968-H972，2005
216.Beattie GM et al，Stem Cells 23：489-495，2005
217.Sekiya I et al，Cell Tissue Res 320：269-276，2005
218.Weidt C et al，Stem Cells 22：890-896，2004
219.Encabo A et al，Stem Cells 22：725-740，2004
220.Buytaeri-Hoefen KA et al，Stem Cells 22：669-674，2004

Claims (27)

1、在有需要的病人中体内形成大的冠状血管或动脉的生物学方法，包括向有预期的血管或动脉的部位投用活化的心肌干细胞。
2、根据权利要求1的方法，其中活化的心脏干细胞是以包括下述步骤的方法得到的：
a、收获心肌组织；
b、提取心肌干细胞；
c、培养并扩增心肌干细胞；
d、使心肌干细胞暴露于一种或多种肝细胞生长因子和/或***。
3、根据权利要求2的方法，其中肝细胞生长因子以0-400ng/ml的量存在。
4、根据权利要求2的方法，其中***以0-500ng/ml的量存在。
5、根据权利要求1的方法，其中活化的心干细胞是自体的。
6、根据权利要求1的方法，其中活化的心干细胞是通过NOGA导管******递送的。
7、根据权利要求1的方法，其中所形成的血管或动脉为阻断或闭塞的动脉或血管提供旁路。
8、活化心干细胞的方法，包括在含有一种或多种生长因子的溶液中培养分离的心干细胞。
9、根据权利要求8的方法，其中一种或多种生长因子是肝细胞生长因子和/或***。
10、根据权利要求9的方法，其中其中肝细胞生长因子以0-400ng/ml的量存在。
11、根据权利要求9的方法，其中***以0500ng/ml的量存在。
12、根据权利要求8的方法，其中溶液还另外含有DMEM/F12、病人血清、胰岛素或、转铁蛋白和***钠。
13、根据权利要求8的方法，其中溶液还另外含有一种或多种人重组bFGF、人重组EGF、尿苷和肌苷。
14、根据权利要求8的方法，其中溶液含有DMEM/F12，和大约5-20％的病人血清、大约5-20％μg/ml的胰岛素、大约5-20％μg/ml的转铁蛋白和大约5-20％ng/ml的***钠。
15、权利要求1的方法，其中溶液还另外含有一种或多种大约10-100ng/ml人重组bEGF、大约10-100ng/ml的人重组EGF、大约0.24-0.44mg/ml的尿苷和大约0.27-0.68mg/ml的肌苷。
16、根据权利要求8的方法，其中溶液还另外含有DMEM/F12、0-400ng/ml的肝细胞生长因子、0500ng/ml的***-1、5-10％的病人血清、20ng/ml的人重组bEGF、20ng/m的人重组EGF、5％μg/ml的胰岛素、50μg/ml的转铁蛋白、5-20ng/ml的***钠、1.22mg/ml的尿苷和1.34mg/ml的肌苷。
17、扩增人心肌干细胞的生长培养基，包括DMEM/F12、病人血清、胰岛素、转铁蛋白和***钠。
18、根据权利要求17的培养基，其进一步含有人重组bFGF、人重组EGF、尿苷和肌苷。
19、权利要求17的培养基，包括大约5-20％的病人血清、2-20μg/ml的胰岛素、大约2-20μg/ml的转铁蛋白、大约2-20ng/ml的***钠，并且可以选择性地含有一种或多种大约10-100ng/ml的人重组bEGF、10-100ng/m的人重组EGF、大约0.24-0.44mg/ml的尿苷和0.27-0.68mg/ml的肌苷。
20、根据权利要求17的培养基，包括DMEM/F12、5-10％病人血清、20ng/ml人重组bEGF、20ng/m人重组EGF、5μg/ml的胰岛素、5μg/ml的转铁蛋白、5ng/ml的***钠、1.22mg/ml的尿苷和1.34mg/ml的肌苷。
21、根据权利要求17的培养基，其中干细胞被传送到缺血心肌的受损伤区域，以产生或再生心肌。
22、在有需要的病人体内产生心肌和/或心肌细胞的方法，包括向受损伤区域投用心肌干细胞。
23、根据权利要求22的方法，其中所说的心脏干细胞是以包括下述步骤的方法得到的：
a、收获心肌组织；
b、提取心肌干细胞；
c、培养并扩增心肌干细胞；
24、根据权利要求22的方法，其中在包括DMEM/F12、病人血清、胰岛素、转铁蛋白和***钠。
25、根据权利要求24的方法，其中培养基进一步含有人重组bFGF、人重组EGF、尿苷和肌苷。
26、根据权利要求24的方法，，其中培养基含有大约5-20％的病人血清、2-20
μg/ml的胰岛素、大约2-20μg/ml的转铁蛋白、大约2-20ng/ml的***钠，并且可以选择性地含有一种或多种大约10-100ng/ml的人重组bEGF、10-100ng/m的人重组EGF、大约0.24-0.44mg/ml的尿苷和0.27-0.68mg/ml的肌苷。
27、根据权利要求24的方法，其中培养基含有DMEM/F12、5-10％病人血清、20ng/ml人重组bEGF、20ng/m人重组EGF、5μg/ml的胰岛素、5μg/ml的转铁蛋白、5ng/ml的***钠、1.22mg/ml的尿苷和1.34mg/ml的肌苷。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154202A (zh) * 2010-04-06 2011-08-17 杭州易文赛生物技术有限公司 储存宫内膜干细胞的方法
CN104587528A (zh) * 2014-12-26 2015-05-06 上海交通大学医学院附属仁济医院 人心脏瓣膜组织脱细胞基质及其制备和应用
CN105142650A (zh) * 2013-01-12 2015-12-09 西斯卡治疗学有限公司 自体骨髓源性干细胞的快速输注
CN106754671A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 张晓南 一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒
CN108753685A (zh) * 2018-06-20 2018-11-06 首都医科大学 一种表达c-Kit的人主动脉血管壁干细胞的分离、筛选、培养及功能鉴定方法
CN110237250A (zh) * 2019-06-10 2019-09-17 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 抗-cd8抗体作为制备治疗心肌梗塞药物的应用
CN115417921A (zh) * 2015-04-09 2022-12-02 雷根科公司 用于修复心脏组织的心外膜衍生的旁分泌因子

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110091428A1 (en) * 2000-07-31 2011-04-21 New York Medical College Compositions of adult organ stem cells and uses thereof
WO2005003321A2 (en) * 2003-07-06 2005-01-13 Roger Williams Medical Center Methods of producing differentiated hematopoietic cells for treatment of cytopenia
ITRM20030376A1 (it) 2003-07-31 2005-02-01 Univ Roma Procedimento per l'isolamento e l'espansione di cellule staminali cardiache da biopsia.
US11660317B2 (en) 2004-11-08 2023-05-30 The Johns Hopkins University Compositions comprising cardiosphere-derived cells for use in cell therapy
WO2006093276A1 (ja) 2005-03-04 2006-09-08 Kyoto University 心臓組織由来の多能性幹細胞
US20080241111A1 (en) * 2005-03-04 2008-10-02 Kyoto University Pluripotent Stem Cell Derived from Cardiac Tissue
US8637005B2 (en) 2005-11-07 2014-01-28 Amorcyte, Inc. Compositions and methods of vascular injury repair
US20110076255A1 (en) 2005-11-07 2011-03-31 Pecora Andrew L Compositions and methods for treating progressive myocardial injury due to a vascular insufficiency
PL2441461T3 (pl) * 2005-11-07 2014-11-28 Pecora & Co Llc Kompozycje i sposoby naprawy uszkodzenia naczyniowego
JP2009531021A (ja) * 2006-02-16 2009-09-03 フォンダッチォーネ・セントロ・サン・ラファエル・デル・モンテ・タボール 骨格筋周囲血管芽細胞および心筋中胚葉性血管芽細胞、それらの単離および使用方法
WO2008058273A2 (en) * 2006-11-09 2008-05-15 The Johns Hopkins University Dedifferentiation of adult mammalian cardiomyocytes into cardiac stem cells
WO2008156512A2 (en) * 2007-03-23 2008-12-24 The Trustees Of Columiba University In The City Of New York Quantum dot labeled stem cells for use in cardiac repair
US8574567B2 (en) 2007-05-03 2013-11-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
WO2008137115A1 (en) 2007-05-03 2008-11-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
CA2743184A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 New York Medical College Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium using cytokines and variants thereof
CA2743701A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-11 New York Medical College Compositions comprising hdac inhibitors and methods of their use in restoring stem cell function and preventing heart failure
EP2227238A2 (en) * 2007-11-30 2010-09-15 New York Medical College Compositions comprising vascular and myocyte progenitor cells and methods of their use
WO2009073518A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-11 New York Medical College Methods of isolating non-senescent cardiac stem cells and uses thereof
US8512696B2 (en) 2007-11-30 2013-08-20 Autologous, Llc Methods of isolating non-senescent cardiac stem cells and uses thereof
US8124071B2 (en) 2007-11-30 2012-02-28 New York Medical College Methods of reducing transplant rejection and cardiac allograft vasculopathy by implanting autologous stem cells
US8241898B2 (en) * 2007-12-10 2012-08-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Regenerative dot cells
US20110110897A1 (en) * 2008-01-11 2011-05-12 Schwarz Richard P Adult Human Cardiac-Derived Progenitor Cells
US8193161B2 (en) * 2008-06-09 2012-06-05 New York Medical College Compositions comprising cardiac stem cells overexpressing specific micrornas and methods of their use in repairing damaged myocardium
RU2497532C2 (ru) * 2008-12-03 2013-11-10 Эморсайт, Инк. Композиции, улучшающие перфузию в области инфаркта и способы восстановления сосудистого повреждения
WO2010138180A2 (en) * 2009-05-26 2010-12-02 The University Of Vermont And State Agriculture College Compositions and methods for cardiac tissue repair
WO2011056658A1 (en) * 2009-10-27 2011-05-12 Duke University Multi-photon microscopy via air interface objective lens
DK2498796T3 (en) 2009-11-09 2018-03-05 Aal Scient Inc HEART DISEASE TREATMENT
US9249392B2 (en) 2010-04-30 2016-02-02 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for maintaining genomic stability in cultured stem cells
US9845457B2 (en) 2010-04-30 2017-12-19 Cedars-Sinai Medical Center Maintenance of genomic stability in cultured stem cells
RU2645069C2 (ru) 2010-08-18 2018-02-15 Авм Байотекнолоджи, Ллс Композиции и способы для ингибирования связывания стволовых клеток и клеток-предшественников с лимфоидной тканью и для регенерации зародышевых центров в лимфатических тканях
WO2012047951A2 (en) 2010-10-05 2012-04-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Human lung stem cells and uses thereof
JP2015521054A (ja) 2012-06-05 2015-07-27 カプリコール，インコーポレイテッド 心臓組織から心臓幹細胞を作製するための最適化方法および心臓治療におけるそれらの使用
WO2014028493A2 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Cedars-Sinai Medical Center Exosomes and micro-ribonucleic acids for tissue regeneration
US10993418B2 (en) 2012-08-13 2021-05-04 Life Genetics Lab, Llc Method for measuring tumor burden in patient derived xenograft (PDX) mice
US9957557B2 (en) 2012-08-13 2018-05-01 Life Genetics Lab, Llc Development of a highly sensitive quantification system for assessing DNA degradation and quality in forensic samples
GB201304831D0 (en) 2013-03-15 2013-05-01 Coretherapix Slu Adult cardiac stem cell population
WO2015042356A1 (en) * 2013-09-19 2015-03-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chemically defined culture medium for stem cell maintenance and differentiation
WO2015081094A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Cardiac progenitor cells and methods of use therefor
US20150328263A1 (en) * 2014-05-14 2015-11-19 University Of Maryland, Baltimore Cardiac stem cells for cardiac repair
WO2016054591A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of muscular dystrophy
US10071121B2 (en) * 2014-11-14 2018-09-11 San Diego State University (Sdsu) Foundation Cardiac, mesenchymal and endothelial progenitor cell (CPC) chimeras and methods for making and using them
JP7315301B2 (ja) * 2014-12-23 2023-07-26 メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル 進行性心不全の予防
RU2633487C2 (ru) * 2015-10-26 2017-10-12 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства России" (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА РФ) Способ лечения ишемической болезни нижних конечностей
EP3402543B1 (en) 2016-01-11 2021-09-08 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction
US11534466B2 (en) 2016-03-09 2022-12-27 Aal Scientifics, Inc. Pancreatic stem cells and uses thereof
CA2968946A1 (en) 2016-05-30 2017-11-30 Ottawa Heart Institute Research Corporation Serum-free and xenogen-free human cardiac explant-derived stem cells and uses and methods for the production thereof
US11351200B2 (en) 2016-06-03 2022-06-07 Cedars-Sinai Medical Center CDC-derived exosomes for treatment of ventricular tachyarrythmias
WO2018057542A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders
JP2019533703A (ja) 2016-11-02 2019-11-21 エーエーエル サイエンティフィックス，インコーポレイテッド 非間葉系ヒト肺幹細胞及び呼吸器疾患を治療するためのそれらの使用方法
WO2018144754A1 (en) * 2017-02-01 2018-08-09 Aal Scientifics, Inc. C-kit-positive bone marrow cells and uses thereof
EP3612191A4 (en) 2017-04-19 2020-12-30 Cedars-Sinai Medical Center METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SKELETAL MUSCLE DYSTROPHY
CN107941678B (zh) * 2017-11-09 2020-06-30 东南大学 基于非密堆积光子晶体薄膜的心肌细胞检测方法及其应用
EP3727351A4 (en) 2017-12-20 2021-10-06 Cedars-Sinai Medical Center MODIFIED EXTRACELLULAR VESICLES FOR IMPROVED TISSUE DELIVERY
CN115232784B (zh) * 2022-07-25 2024-06-07 复旦大学附属中山医院 一种诱导心肌细胞容量超负荷的药物及其用于体外心肌细胞的容量超负荷模型制备方法

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5202120A (en) 1987-09-11 1993-04-13 Case Western Reserve University Methods of reducing glial scar formation and promoting axon and blood vessel growth and/or regeneration through the use of activated immature astrocytes
US5197985A (en) 1990-11-16 1993-03-30 Caplan Arnold I Method for enhancing the implantation and differentiation of marrow-derived mesenchymal cells
SE9100099D0 (sv) 1991-01-11 1991-01-11 Kabi Pharmacia Ab Use of growth factor
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
US5543318A (en) 1991-06-12 1996-08-06 Smith; David A. Method of isolation, culture and proliferation of human atrial myocytes
WO1992022636A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Smith David A Method for inducing human myocardial cell proliferation
AU1052795A (en) 1993-11-08 1995-05-29 University Of Southern California Compositions and methods for transduction of cells
US5602301A (en) 1993-11-16 1997-02-11 Indiana University Foundation Non-human mammal having a graft and methods of delivering protein to myocardial tissue
US5610134A (en) 1994-04-15 1997-03-11 Genentech, Inc. Treatment of congestive heart failure
US6174333B1 (en) 1994-06-06 2001-01-16 Osiris Therapeutics, Inc. Biomatrix for soft tissue regeneration using mesenchymal stem cells
US5785966A (en) 1994-06-15 1998-07-28 Coles; John G. Inhibition of human xenogenic or allogenic antibodies to reduce xenograft or allograft rejection in human recipients
JPH10503379A (ja) 1994-07-29 1998-03-31 デイド・インターナショナル・インコーポレーテッド Ｍｈｃ複合体およびその用途
DE4441327C1 (de) 1994-11-22 1995-11-09 Inst Pflanzengenetik & Kultur Embryonale Herzmuskelzellen, ihre Herstellung und ihre Verwendung
US5906934A (en) 1995-03-14 1999-05-25 Morphogen Pharmaceuticals, Inc. Mesenchymal stem cells for cartilage repair
US5712258A (en) 1995-03-23 1998-01-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inotropic ADP and ATP analogues and their pharmaceutical compositions
US5919449A (en) 1995-05-30 1999-07-06 Diacrin, Inc. Porcine cardiomyocytes and their use in treatment of insufficient cardiac function
US5908782A (en) * 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
US20050158859A1 (en) 1995-09-29 2005-07-21 Yale University Manipulation of non-terminally differentiated cells using the Notch pathway
CA2216439A1 (en) 1996-09-25 1998-03-25 Derek Van Der Kooy Pharmaceuticals containing retinal stem cells
US5990091A (en) 1997-03-12 1999-11-23 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
US6004777A (en) 1997-03-12 1999-12-21 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
US6547787B1 (en) 1997-03-13 2003-04-15 Biocardia, Inc. Drug delivery catheters that attach to tissue and methods for their use
CA2218145C (en) * 1997-04-14 2008-01-08 Toshikazu Nakamura Method of treating dilated cardiomyopathy
US6110459A (en) 1997-05-28 2000-08-29 Mickle; Donald A. G. Transplants for myocardial scars and methods and cellular preparations
US6099832A (en) 1997-05-28 2000-08-08 Genzyme Corporation Transplants for myocardial scars
US5990901A (en) * 1997-06-27 1999-11-23 Microsoft Corporation Model based image editing and correction
AU8401498A (en) * 1997-07-14 1999-02-10 Osiris Therapeutics, Inc. Cardiac muscle regeneration using mesenchymal stem cells
US6001934A (en) 1997-09-03 1999-12-14 Tonen Chemical Co. Process for the preparation of a functional group-containing polyarylene sulfide resin
NZ505997A (en) 1998-02-05 2003-08-29 Novartis Ag Expand and genetically modified populations of human hematopoietic stem cells
JPH11246433A (ja) 1998-03-03 1999-09-14 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 心筋梗塞治療剤
JP2002506008A (ja) 1998-03-09 2002-02-26 セント エリザベス メディカル センター 血管新生を調整するための組成物及び方法
WO1999049015A2 (en) * 1998-03-23 1999-09-30 Zymogenetics, Inc. Cardiac-derived stem cells
US20020122792A1 (en) 1998-07-24 2002-09-05 Thomas J. Stegmann Induction of neoangiogenesis in ischemic myocardium
US6569619B1 (en) 1998-07-29 2003-05-27 Tularik, Inc. High-throughput in vitro screening assays for modulators of nucleic acid helicases
CA2368677C (en) 1999-03-30 2012-07-10 Ran Kornowski Intramyocardial injection of autologous bone marrow
US6468543B1 (en) 1999-05-03 2002-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods for promoting growth of bone using ZVEGF4
AU775965B2 (en) 1999-10-08 2004-08-19 Anges Mg, Inc. Gene therapy for cardiomyopathy
US6329348B1 (en) 1999-11-08 2001-12-11 Cornell Research Foundation, Inc. Method of inducing angiogenesis
AU778929B2 (en) 1999-12-06 2004-12-23 General Hospital Corporation, The Pancreatic stem cells and their use in transplantation
ATE473751T1 (de) 2000-02-11 2010-07-15 Schepens Eye Res Inst Isolierung und transplantation von retinalen stammzellen
CA2412436C (en) 2000-06-05 2013-05-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Identification and use of human bone marrow-derived endothelial progenitor cells to improve myocardial function after ischemic injury
US7547674B2 (en) * 2001-06-06 2009-06-16 New York Medical College Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium
US20020061587A1 (en) 2000-07-31 2002-05-23 Piero Anversa Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium
AU2003290601A1 (en) * 2002-11-05 2004-06-03 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Mesenchymal stem cells and methods of use thereof
ES2344204T3 (es) * 2003-06-25 2010-08-20 Ottawa Hospital Research Institute Uso de cardiotrofina para modular la proliferacion de celulas madre.
WO2005021738A1 (en) 2003-08-29 2005-03-10 Regents Of The University Of Minnesota Kidney derived stem cells and methods for their isolation, differentiation and use
AR046123A1 (es) 2003-10-17 2005-11-23 Crc For Innovative Dairy Produ Aislamiento de celulas simil-celulas madre, uso de las mismas
AU2006214278C1 (en) * 2005-02-16 2012-07-19 Miltenyi Biotec Technology, Inc. Lentiviral vectors and their use
US7776592B2 (en) 2005-08-31 2010-08-17 Stc.Unm Human renal stem cells
ITFI20060099A1 (it) 2006-04-28 2007-10-29 Azienda Ospedaliera Careggi Popolazione di cellule staminali renali, sua identificazione ed uso per finalita' terapeutiche
WO2008045498A1 (en) 2006-10-12 2008-04-17 Ethicon, Inc. Kidney-derived cells and methods of use in tissue repair and regeneration
CA2743184A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 New York Medical College Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium using cytokines and variants thereof
WO2009073518A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 New York Medical College Methods of isolating non-senescent cardiac stem cells and uses thereof
WO2009114826A2 (en) 2008-03-13 2009-09-17 Angiodynamics, Inc. Treatment systems and methods for renal-related diseases
US20100111908A1 (en) 2008-11-03 2010-05-06 Fangming Lin Induction of Renal Cells for Treatment of Kidney Disease

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154202A (zh) * 2010-04-06 2011-08-17 杭州易文赛生物技术有限公司 储存宫内膜干细胞的方法
CN105142650A (zh) * 2013-01-12 2015-12-09 西斯卡治疗学有限公司 自体骨髓源性干细胞的快速输注
CN105142650B (zh) * 2013-01-12 2019-08-27 西斯卡治疗学有限公司 自体骨髓源性干细胞的快速输注
CN104587528A (zh) * 2014-12-26 2015-05-06 上海交通大学医学院附属仁济医院 人心脏瓣膜组织脱细胞基质及其制备和应用
CN115417921A (zh) * 2015-04-09 2022-12-02 雷根科公司 用于修复心脏组织的心外膜衍生的旁分泌因子
CN106754671A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 张晓南 一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒
CN106754671B (zh) * 2016-11-30 2020-02-07 张晓南 一种用于培养心肌祖细胞的试剂盒
CN108753685A (zh) * 2018-06-20 2018-11-06 首都医科大学 一种表达c-Kit的人主动脉血管壁干细胞的分离、筛选、培养及功能鉴定方法
CN108753685B (zh) * 2018-06-20 2022-06-28 首都医科大学 一种表达c-Kit的人主动脉血管壁干细胞的分离、筛选、培养及功能鉴定方法
CN110237250A (zh) * 2019-06-10 2019-09-17 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 抗-cd8抗体作为制备治疗心肌梗塞药物的应用

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