CN108828051A - 快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法。所述方法包括以下步骤:A、以乙醇提取南极磷虾油;B、将南极磷虾油离子化后引入质谱仪检测,获得质谱轮廓图;C、将质谱轮廓图经MassLynx比对后确定样品的脂质组学轮廓。本发明无须进行样品前处理、可实现实时质谱检测、适用于食品的脂质组学检测,可促进南极磷虾为原料的虾油开发。
Description
技术领域
本发明涉及南极磷虾油的脂质的检测方法,特别是一种快速蒸发 离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法。
背景技术
脂质组学(Lipidomics)是继基因组学和蛋白质组学后又一迅速 发展的热门领域,研究内容包括生物体内脂质分子种类的结构鉴定与 定量,以及其在生物代谢、疾病、免疫等所扮演的角色分析。随着软 电离离子化技术和高分辨质谱技术的发展及其在脂质分析中的应用, 已经实现了对生物样品中各种微量脂质进行快速、高精度的分析检 测,极大得促进了规模性、整体性的脂质分析。近几年来质谱技术的 应用越来越广泛,研究人员对质谱高通量快速检测技术也提出了更高 的要求。然而生物组织样本无法直接用于高灵敏度的质谱检测,通常 需要专业人员经组织匀浆、化合物提取、分离纯化等复杂繁琐的样品前处理步骤后,方能用于质谱分析,故无法实现组织样本的实时质谱 检测研究,亦无法满足高通量组学技术研究的需求。脂质组学检测常 规采用的提取方法为Folch法和Bligh&Dyer法,然而这两种方法 需要用到氯仿等毒性级别较高的有机试剂,不适用于食品的脂质组学 检测。
快速蒸发离子化质谱(Rapid evaporative ionization mass spectr ometry,REIMS)是一种用于临床生物组织原位动态实时鉴定的新兴 的技术手段,以热电灼蚀生物组织物质为基础,诱导生物分子离子化, 形成含有带电粒子的气溶胶,经离子传输管道进入质谱仪分析。200 9年,Takatas等人在解吸电喷雾技术(Desorption electrosprayioniza tion,DESI)的基础上基于高频电刀装置耦联高分辨质谱仪研发了R EIMS,为原位电离质谱研究和质谱代谢组学研究提供了一种全新的 研究方法和研究思路。
南极磷虾(Euphausia superba)是一类生活在南大洋中的甲壳类 浮游动物,其具有生物蕴藏量大、分布广等特点,是重要的战略性海 洋新资源。据估计,南极磷虾贮藏量有6.5-10亿吨之巨,最大耐受 捕捞量约为400-600万吨。在世界海洋渔业资源日益衰减的背景下, 日本、挪威等国家相继加入南极磷虾的科研与开发,并已有磷虾油等 相关产品产业化。南极磷虾中富含磷脂结合型n-3脂肪酸,比鱼油中 的甘油三酯型n-3脂肪酸更易吸收,是二十碳五烯酸(EPA)和二十 二碳六烯酸(DHA)的有效来源。实验表明,南极磷虾油具有降低 胆固醇、预防老年痴呆症、预防动脉硬化、抗炎症、保护视力、及改 善大脑学习机能等生理功能。目前针对南极磷虾脂质组学研究尚未见 报道,开展南极磷虾脂质组学研究将深化南极磷虾脂质营养学认识, 促进南极磷虾为原料的虾油开发。
因此,现有的脂质组学轮廓检测方法,存在样品前处理繁琐、无 法实现实时质谱检测、不适用于食品的脂质组学检测的问题;目前针 对南极磷虾油的脂质组学轮廓检测尚未见报道。
发明内容
本发明的目的,是提供一种快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的 脂质实时检测方法。本发明无须进行样品前处理、可实现实时质谱检 测、适用于食品的脂质组学检测。
本发明的技术方案:快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实 时检测方法,包括以下步骤:
A、南极磷虾油的提取:将南极磷虾匀浆后冷冻干燥,得A1品, 称量A1品置于离心管中,向离心管加入乙醇,震荡混匀,在恒温水 浴锅中常温浸提,用冷冻离心机离心,转移上清液,向下层沉淀加入 乙醇重复萃取两次,合并上清液,于65℃下将乙醇蒸干得到油脂浓 缩液,即A2品;
B、将A2品通过加热探头离子化形成气溶胶,所述加热探头的温 度为500℃,所形成的气溶胶由Venturi泵经氮气以2bar的压强驱 动,采用正交方式经PTFE管引入质谱仪,以丙二醇/亮氨酸脑啡肽混 合物为辅助溶剂,经针泵注射进样器引入端口;所述质谱接口内设1. 1Ω、3V、500℃的Kanthal A1灯丝用作辅助碰撞电离,离子碰撞 后进入质谱仪的StepWave装置;所述质谱仪的扫描时间为1秒,扫 描范围为m/z 50-1200;以负电离模式收集数据,获得南极磷虾油质 谱轮廓图;
C、将质谱轮廓图经MassLynx进行峰匹配、峰对齐、滤噪处理, 结果保存为文本格式,根据质谱数据得到相对含量为5%以上的质谱 峰的质荷比、相对含量为10%以上的主峰碎片离子信息,结合已知数 据比对后确定样品的脂质组学轮廓。
前述的快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法 中,步骤A中,所述乙醇为95%的乙醇;所述向离心管加入乙醇,是 以每克样品加5ml乙醇的量加入;所述离心机以9000r/min离心10m in;所述向下层沉淀加入乙醇,是每克样品加3ml乙醇的量加入;所 述浸提时间为2h。
前述的快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法 中,步骤A中,所述丙二醇与亮氨酸脑啡肽的质量比为98:2。
前述的快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法 中,步骤B中,所述针泵注射进样器内的流量为0.1mL/min。
前述的快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法 中,步骤B中,所述将A2品通过加热探头离子化,是将A2品用预先 脱胶的大豆油稀释4倍后通过加热探头离子化。
与现有技术比较,本发明采用REIMS高通量实时检测南极磷虾油 的脂质组学轮廓,以实现脂质的实时检测。在负电离模式下南极磷虾 油受电热探头或单级电极离子化,形成气溶胶,所形成的气溶胶由泵 经氮气以2bar的压强驱动,采用正交方式经PTFE管引入质谱仪,设 置质谱仪参数,质谱仪仅扫描1秒即可得到质谱轮廓图,由软件比对 便可后确定样品的脂质组学轮廓。该方法脂质组学轮廓实时检测快 速、高效,相关数据能为质谱工作者提供理论基础,为海洋功能食品 企业和部门提供相关依据和参考。南极磷虾油经质量分析器检测共检 出20种脂肪酸和26种磷脂分子,其中EPA(m/z 301,21.59%)和D HA(m/z327,14.44%)为质谱图中主要离子峰。本发明无须进行样 品前处理、可实现实时质谱检测、适用于食品的脂质组学检测,可促 进南极磷虾为原料的虾油开发。
附图说明
图1为REIMS高通量实时检测南极磷虾油脂质组学轮廓的检测装 置;
图2为乙醇浓度对南极磷虾油提取得率的影响;
图3为南极磷虾油REIMS质谱轮廓图;
图4为南极磷虾油脂质组学轮廓图m/z 200-500区域内脂肪酸离 子峰;
图5为南极磷虾油脂质组学轮廓图m/z 400-900范围内的磷脂离 子峰。
图中的附图标记为:1-控制器,2-电热探头,3-南极磷虾油浓缩 液,4-气溶胶,5-注射泵(即针泵注射进样器),6-质谱仪。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明,但并不作为对本发明限 制的依据。
以下是本发明的实验例。
实验例。
1.1主要仪器与装置
Xevo G2-XS四极杆飞行时间质谱仪:美国Waters公司产品,配 有快速蒸发离子源;Pump11elite针泵注射进样器:美国Harvard 公司产品;Milliplus 2150超纯水处理***:美国Millipore公司 产品;Masslynx 4.1数据采集软件和LiveID统计分析软件:美国Waters公司产品;其它为实验室常用仪器和设备。
1.2主要材料与试剂
南极磷虾:辽渔南极磷虾科技发展有限公司产品;甲醇、乙腈、 异丙醇:均为色谱纯,德国Meker公司产品;甲酸:色谱纯,美国T edia公司产品;亮氨酸脑啡肽:美国Sigma-Aldrich公司产品;其 它实验室常用试剂为分析纯。
1.3试验条件
1.3.1南极磷虾油提取条件将南极磷虾组织匀浆后冷冻干燥, 精确称量5.0g样品于50mL离心管中,加入25mL 95%乙醇后震荡 混匀,在恒温水浴锅中常温浸提2h;混合物用冷冻离心机以9000 r/min离心10min,用移液管转移上清液,向下层沉淀加入15mL 9 5%乙醇重复萃取两次,合并上清液;用旋转蒸发仪于65℃下将有机 溶剂蒸干得到南极磷虾油浓缩液。
1.3.2质谱条件南极磷虾油样品通过加热探头(500℃)离子 化,所形成的气溶胶由Venturi泵氮气(2bar)驱动,采用正交方 式经PTFE管引入质谱,主要装置如图1;以丙二醇/亮氨酸脑啡肽混 合物(丙二醇与亮氨酸脑啡肽的质量比为98:2)为辅助溶剂,经针 泵注射进样器以0.1mL/min的流量引入端口,用于清洗杂质、提高 信号强度、锁定质量校正;质谱接口内设Kanthal A1灯丝(1.1Ω, 3V,500℃)用作辅助碰撞电离,离子碰撞后进入质谱仪StepWave 装置;质谱仪扫描时间:1秒;扫描范围:m/z 50-1200;所有数据 均以负电离模式收集。
1.4统计分析
将原始质谱图经MassLynx进行峰匹配、峰对齐、滤噪处理等, 结果保存为文本格式。根据质谱数据得到相对含量为5%以上的质谱 峰的质荷比,相对含量为10%以上的主峰碎片离子信息等,结合Lip id MS Predictor和LipidMap数据库搜索标准品比对及文献报道确 定或推测脂质的结构信息。
2结果
2.1南极磷虾油提取优化
脂质组学分析常规采用的提取方法为Folch法和Bligh&Dyer 法,然而这两种方法需要用到氯仿等毒性级别较高的有机试剂。考虑 到南极磷虾油作为保健食品的安全性指标,本实验采用乙醇作为萃取 媒介,从南极磷虾干粉中提取南极磷虾油。比较优化了不同浓度的乙 醇溶液对南极磷虾油提取率的影响。结果如图2所示,南极磷虾油的 得率随着乙醇含量增加而提高,其中95%乙醇提取效果最佳,当使用 纯乙醇时,得率有所下降。
2.2REIMS脂质组学轮廓分析
REIMS是一种无须任何样品前处理的实时质谱方法,通过对原样 的直接表面离子化,实时获得质谱轮廓图,使用LiveID等软件识别 轮廓图并对特征离子峰降维、建模后,可实现未知样品的实时鉴定与 准确度评分。
REIMS常用的离子源为单极电极,通过在给定电流下切割组织, 使表面的小分子快速蒸发离子化,并通过离子传输管路进入质谱端 口。由于南极磷虾油为液态样品,无法使用单极电极切割模式,故本 实验采用电热探头的方式使南极磷虾油受热快速蒸发,脂类化合物离 子化并随气溶胶一并进入质谱质量分析器。使用电热探头轻触南极磷 虾油表面,质谱扫描范围设定在m/z 0-1200,通过MassLynx记录质 谱数据。如图3所示,南极磷虾脂质分子离子峰主要出现在m/z 200 -900区域范围,并由两个明显的峰簇组成,即m/z200-500的脂肪 酸离子峰簇和m/z 600-900的磷脂离子峰簇。从相对含量来看,脂肪 酸离子峰的信号响应显著强于磷脂离子峰的信号强度,前者的峰面积 约为后者的7.6倍。脂肪酸离子的来源一部分是南极磷虾油中的游离 脂肪酸电离生成,另一部分是由甘油酯、磷脂、胆固醇酯等脂类受电 热探头高能裂解,其脂肪酸链碎片化电离后反映在质谱图中。
图4为南极磷虾油脂质组学轮廓图m/z 200-500区域内脂肪酸离 子峰,各个峰分离度较好,信噪比较高几乎看不到基质峰;通过对其 鉴定和积分,得到结构和相对含量见表1。信号响应强度最大的为m /z 301,相对含量达到了21.59%,经鉴定其结构为FA 20:5,即所熟 知的EPA。其次分别为m/z 327(FA 22:6/DHA,14.44%),m/z 281 (FA 18:1,12.62%),以及m/z 255(FA 16:0,18.74%)。南极磷 虾油中检出疑似FA 18:4的脂肪酸离子峰m/z 275(3.78%),该组 分通常在植物性油料作物中检出。同时,m/z 391、m/z 417等疑似 为超长链脂肪酸FA 26:2(6.17%)、FA 28:3(2.10%),其存在可 能与南极磷虾受极寒环境胁迫,促使其代谢产生长链脂肪酸以提高体 液流动性相关;相关假设尚须生物学进一步验证。
表1.南极磷虾油中脂肪酸相对含量与结构分析
注:1)脂肪酸结构为根据经验和软件解析的结果,尚未进行结 构验证;结构表示为FA c:d,其中c为脂肪酸链的碳原子数,d为双 键数。
图5为m/z 400-900范围内的磷脂离子峰,由于磷脂的信号响应 显著低于脂肪酸,基质效应相对较强,经降噪和峰提取后,共鉴定2 6种磷脂分子。其中信号最强的离子峰为m/z 763(11.67%),其结 构疑似为[PG 36:7-H]-;其次是m/z 737(11.46%),结构[PC o-38: 3-choline]-/[PE o-38:3-NH3]-。相同c:d比下,PC丢失胆碱碎片 后的分子结构与PE脱氨基结构相同,因此在REIMS脂质组学轮廓谱 中无法区分。以质谱峰m/z 695.4为例,经鉴定其sn1/sn2脂肪酸链 的总碳原子和双链数量为34:3,其分子结构组成可能为[PC-choline] –,或[PE-NH3]–,亦或是两者的重叠。南极磷虾油中PI分子较少, 仅有m/z 835([PI 34:1-H]-,1.79%)和m/z 843([PI o-36:4-H] -,1.47%)检出。
表2.南极磷虾油中磷脂相对含量及结构分析
2.3方法学验证
有机溶剂燃点较低,通过电热探头离子化易发生明火,目前尚未 有构建标准定量溶剂体系。因此,方法学验证中的灵敏度测试采用倍 数稀释法,通过向南极磷虾油中添加预先脱胶的大豆油进行稀释后进 行REIMS检测。结果显示,南极磷虾油稀释4倍后26种磷脂分子依 然能快速检出,谱图经降噪后与图5相近,除信号强度降低以外脂质 组学轮廓特征相似,未有显著差异;南极磷虾油稀释10倍后检出的 磷脂分子数减少为14种,各个磷脂离子峰的信号强度等比例下降, 部分轮廓特征丢失。精确度测试采用日内精密度和日间精密度评价,
脂肪酸和磷脂各选取两个离子m/z 301,m/z 327,m/z 763和m /z 737,分别于同一日连续测定7次和连续测定5天,计算得到其日 内精密度RSD≤6.24%,日内精密度RSD≤8.57%。方法学验证结 果显示,该方法能满足南极磷虾油中脂肪酸和磷脂的脂质组学轮廓分 析测试要求。
3结论
采用REIMS技术对南极磷虾油中的脂质直接离子化并获得实时 脂质组学轮廓。在负离子模式下南极磷虾油受电热探头激发成离子 态,并随气溶胶引入质谱端口,经质量分析器检测共有20种脂肪酸 和26种磷脂分子检出,其中EPA(m/z 301,21.59%)和DHA(m/z327,14.44%)为质谱图中主要离子峰。该方法对南极磷虾油脂质组 学轮廓实时检测快速、高效,相关数据能为质谱工作者提供理论基础, 为海洋功能食品企业和部门提供相关依据和参考。
以下是本发明的实施例。
实施例。
快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法,包括以 下步骤:
A、南极磷虾油的提取:将南极磷虾匀浆后冷冻干燥,得A1品, 称量A1品置于离心管中,向离心管加入乙醇,震荡混匀,在恒温水 浴锅中常温浸提,用冷冻离心机离心,转移上清液,向下层沉淀加入 乙醇重复萃取两次,合并上清液,于65℃下将乙醇蒸干得到油脂浓 缩液,即A2品;
B、将A2品通过加热探头离子化形成气溶胶,所述加热探头的温 度为500℃,所形成的气溶胶由Venturi泵经氮气以2bar的压强驱 动,采用正交方式经PTFE管引入质谱仪,以丙二醇/亮氨酸脑啡肽混 合物为辅助溶剂,经针泵注射进样器引入端口;所述质谱接口内设1. 1Ω、3V、500℃的Kanthal A1灯丝用作辅助碰撞电离,离子碰撞 后进入质谱仪的StepWave装置;所述质谱仪的扫描时间为1秒,扫 描范围为m/z 50-1200;以负电离模式收集数据,获得南极磷虾油质 谱轮廓图;
C、将质谱轮廓图经MassLynx进行峰匹配、峰对齐、滤噪处理, 结果保存为文本格式,根据质谱数据得到的相对含量为5%以上的质 谱峰的质荷比、相对含量为10%以上的主峰碎片离子信息,结合已知 数据比对后确定样品的脂质组学轮廓。
步骤A中,所述乙醇为95%的乙醇;所述向离心管加入乙醇,是 以每克样品加5ml乙醇的量加入;所述离心机以9000r/min离心10m in;所述向下层沉淀加入乙醇,是每克样品加3ml乙醇的量加入;所 述浸提时间为2h。
步骤A中,所述丙二醇与亮氨酸脑啡肽的质量比为98:2。
步骤B中,所述针泵注射进样器内的流量为0.1mL/min。
步骤B中,所述将A2品通过加热探头离子化,是将A2品用预先 脱胶的大豆油稀释4倍后通过加热探头离子化。
当然,本发明还可有其它多种实施例,在不背离本发明精神及其 实质的情况下,熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应 的改变和变形,但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利 要求的保护范围。
Claims (5)
1.快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
A、南极磷虾油的提取:将南极磷虾匀浆后冷冻干燥,得A1品,称量A1品置于离心管中,向离心管加入乙醇,震荡混匀,在恒温水浴锅中常温浸提,用冷冻离心机离心,转移上清液,向下层沉淀加入乙醇重复萃取两次,合并上清液,于65℃下将乙醇蒸干得到油脂浓缩液,即A2品;
B、将A2品通过加热探头离子化形成气溶胶,所述加热探头的温度为500℃,所形成的气溶胶由Venturi泵经氮气以2bar的压强驱动,采用正交方式经PTFE管引入质谱仪,以丙二醇/亮氨酸脑啡肽混合物为辅助溶剂,经针泵注射进样器引入端口;所述质谱接口内设1.1Ω、3V、500℃的Kanthal A1灯丝用作辅助碰撞电离,离子碰撞后进入质谱仪的StepWave装置;所述质谱仪的扫描时间为1秒,扫描范围为m/z 50-1200;以负电离模式收集数据,获得南极磷虾油质谱轮廓图;
C、将质谱轮廓图经MassLynx进行峰匹配、峰对齐、滤噪处理,结果保存为文本格式,根据质谱数据得到相对含量为5%以上的质谱峰的质荷比、相对含量为10%以上的主峰碎片离子信息,结合已知数据比对后确定样品的脂质组学轮廓。
2.根据权利要求1所述的快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法,其特征在于:步骤A中,所述乙醇为95%的乙醇;所述向离心管加入乙醇,是以每克样品加5ml乙醇的量加入;所述离心机以9000r/min离心10min;所述向下层沉淀加入乙醇,是每克样品加3ml乙醇的量加入;所述浸提时间为2h。
3.根据权利要求1所述的快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法,其特征在于:步骤A中,所述丙二醇与亮氨酸脑啡肽的质量比为98:2。
4.根据权利要求1所述的快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法,其特征在于:步骤B中,所述针泵注射进样器内的流量为0.1mL/min。
5.根据权利要求1所述的快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法,其特征在于:步骤B中,所述将A2品通过加热探头离子化,是将A2品用预先脱胶的大豆油稀释4倍后通过加热探头离子化。
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