CN104540966A - 通过微小rna诊断类风湿性关节炎 - Google Patents

通过微小rna诊断类风湿性关节炎 Download PDF

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松田秀一
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Abstract

本发明提供了测试衍生自测试对象血液的样品用于确定类风湿性关节炎的病理状态的方法，其包括下述步骤：（a）在衍生自测试对象血液的样品中，测量选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，和（b）使步骤（a）中测量的一种或多种表达水平与类风湿性关节炎的病理状态关联。

Description

通过微小RNA诊断类风湿性关节炎
技术领域
本发明涉及测试衍生自测试对象血液的样品用于确定类风湿性关节炎的病理状态的方法，用于其的诊断试剂等。
背景技术
类风湿性关节炎（RA）是特征在于破坏性关节炎的全身性炎性疾病。它的发病率据说是全世界人口的1%，并且0.7-1百万患者位于日本，其中每年15,000人新近发展该疾病。近年来，已阐明类风湿性关节炎中的不可逆关节破坏比常规预测的更早开始，并且因此已推荐从早期开始积极使用显示出高关节破坏抑制性作用的生物制剂，这增加类风湿性关节炎的早期诊断的重要性。
微小RNA（miRNA）是长度约22个碱基的短链RNA分子，并且通过与其信使RNA的3'非翻译区中的互补序列结合而抑制靶基因的翻译。miRNA已知调节多种生物现象，并且整个基因的1/3假定为处于通过miRNA的表达调节下。在2008年，显示miRNA（miR-141）存在于血浆中，并且可用作***癌的生物标记（非专利文件1），其中由于RNA降解酶的存在，在血浆中RNA长久以来被视为不存在。
另一方面，本发明人已阐明通过测量血浆中的miR-16、miR-132、miR-146a、miR-155和miR-223浓度，可以确定类风湿性关节炎，并且可以判断疾病状态，所述miRNA已报道为细胞内存在且与类风湿性关节炎相关（专利文件1）。
[文件列表]
[专利文件]
专利文件1：WO 2011/126105
[非专利文件]
非专利文件1：Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105：10513-10518。
发明概述
待由本发明解决的问题
根据2010年公布的类风湿性关节炎的新分类标准，因为显著重点在于诊断评分中风湿病因子和抗CCP抗体的得分，所以即使当关节肿胀很小时，这些检查项目阳性的病例也可以诊断为具有类风湿性关节炎，而阴性病例不能诊断为具有类风湿性关节炎，除非关节肿胀在11个或更多部分中发现。在据说占0.7-1百万人的日本类风湿性关节炎患者中，百分之三十预测为对于抗CCP抗体是阴性的。因为根据目前的诊断标准，诊断在抗CCP抗体阴性病例中是延迟的，所以需要即使在抗CCP抗体阴性病例中也能进行类风湿性关节炎的早期诊断的诊断标记。
考虑到上述情况，本发明旨在建立属于不同于自身抗体例如抗CCP抗体、风湿病因子等那种的类别的类风湿性关节炎标记，特别是同样可应用于自身抗体阴性病例的标记，并且提供用于确定类风湿性关节炎病的存在或不存在和类风湿性关节炎患者中症状的进展（即，疾病状态）的方法。
解决问题的方法
在实现上述目标的尝试中，本发明人全面研究类风湿性关节炎患者和健康人的血浆中的miRNA浓度。因此，他们已发现在类风湿性关节炎患者的血浆中比健康人的那些显示显著更高的表达水平的miRNA（miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p）。当来自这些miRNA的miR-24、miR-26a和miR-125a-5p用作标记时，类风湿性关节炎确定中的灵敏度和特异性分别为63.7%/89.5%、53.9%/94.3%和64.7%/89.5%，具有最佳截断值。作为常规用于确定类风湿性关节炎的最出名标记的风湿病因子和抗CCP抗体的灵敏度和特异性据报道分别为54%/91%和48%/98%（ARTHRITIS & RHEUMATISM 2000，43（1）：155-163）。因为miR-24、miR-26a和miR-125a-5p无一迄今据报道与疾病相关，所以与众所周知的类风湿性关节炎确定标记的那些可比较的高灵敏度和特异性完全是无法预测的。另外，使用miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p组合的三种miRNAs（ePRAM，使用微小RNA估计的RA概率）的复合值，可以执行灵敏度78.4%、特异性92.3%的测试，并且进一步地，使用现有的抗CCP抗体和这三种miRNA组合，可以执行灵敏度94.1%、特异性95.2%的测试。此外，在抗CCP抗体阳性病例和阴性病例之间未观察到miR-24、miR-26a和miR-125a-5p表达水平中的显著差异，其已阐明miRNA也可用于确定抗CCP抗体阴性病例中的类风湿性关节炎。
本发明人还研究了在类风湿性关节炎患者的血浆中的miRNA浓度的绝对值或其对数和类风湿性关节炎的指数（VAS、DAS28（ESR）和DAS28（CRP））之间的关联。因此，在VAS和miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-126-3p和miR-502-5p；DAS28（ESR）和miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p；以及DAS28（CRP）和miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p之间发现关联，并且发现这些miRNA可用作疾病状态标记。这些miRNA和类风湿性关节炎之间的关系迄今为止尚未报道。
本发明人已基于这些发现进行进一步研究并且完成本发明。
相应地，本发明如下所述。
[1] 测试衍生自测试对象血液的样品用于确定类风湿性关节炎的病理状态的方法，其包括下述步骤：
（a）在衍生自测试对象血液的样品中，测量选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平，并且用样品中的内部标准miRNA的表达水平来标准化一种或多种表达水平。
[2] [1]的方法，其进一步包括下述步骤：
（b）使步骤（a）中测量的表达水平与类风湿性关节炎的病理状态关联。
[3] [1]或[2]的方法，其中在步骤（a）中，在衍生自测试对象血液的样品中，测量选自miR-24, miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平。
[4] [3]的方法，其中在步骤（a）中，在衍生自测试对象血液的样品中，测量miR-24和miR-125a-5p的表达水平。
[5] [3]或[4]的方法，其进一步包括下述步骤：
（a’）在衍生自测试对象血液的样品中，测量抗CCP抗体的水平，
其中在步骤（b）中，使步骤（a）中测量的表达水平和步骤（a’）中测量的抗CCP抗体水平与类风湿性关节炎的病理状态关联。
[6] [3]或[4]的方法，其中所述测试对象是抗CCP抗体阴性的。
[7] [1] - [6]中任一项的方法，其中所述衍生自血液的样品是血浆。
[8] [1] - [7]中任一项的方法，其中所述测试对象是人。
[9]用于确定类风湿性关节炎的病理状态的诊断试剂，其包含能够特异性检测选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的核酸探针或核酸引物，或
能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，
和
能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物。
[10] [9]的诊断试剂，其包含能够特异性检测选自miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的核酸探针或核酸引物，或
能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，
和
能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物。
[11] [10]的诊断试剂，其包含能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，
和
能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物。
[12] [9] - [11]中任一项的诊断试剂，其进一步包含环状瓜氨酸肽。
[13] [1] - [8]中任一项的方法，其中所述内部标准miRNA是miR-30a-5p。
[14] [9] - [12]中任一项的诊断试剂，其进一步包含能够特异性检测miR-30a-5p的核酸探针或核酸引物。
[1’]测试衍生自测试对象血液的样品用于确定类风湿性关节炎的病理状态的方法，其包括下述步骤：
（a）在衍生自测试对象血液的样品中，测量选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，和
（b）使步骤（a）中测量的一种或多种表达水平与类风湿性关节炎的病理状态关联。
[2’] [1’]的方法，其中在步骤（a）中，在衍生自测试对象血液的样品中，测量选自miR-24, miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平。
[3’] [2’]的方法，其中在步骤（a）中，在衍生自测试对象血液的样品中，测量miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平。
[4’] [2’]或[3’]的方法，其进一步包括下述步骤：
（a’）在衍生自测试对象血液的样品中，测量抗CCP抗体的水平，
其中在步骤（b）中，使步骤（a）中测量的表达水平和步骤（a’）中测量的抗CCP抗体水平与类风湿性关节炎的病理状态关联。
[5’] [2’]或[3’]的的方法，其中所述测试对象是抗CCP抗体阴性的。
[6’] [1’] - [5’]中任一项的方法，其中所述衍生自血液的样品是血浆。
[7’] [1’] - [6’]中任一项的方法，其中所述测试对象是人。
[8’]用于确定类风湿性关节炎的病理状态的诊断试剂，其包含能够特异性检测选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的核酸探针或核酸引物，或
能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，
能够特异性检测miR-30a-5p的核酸探针或核酸引物，和
能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物。
[9’] [8’]的诊断试剂，其包含能够特异性检测选自miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的核酸探针或核酸引物，或
能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，
能够特异性检测miR-30a-5p的核酸探针或核酸引物，和
能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物。
[10’] [9’]的诊断试剂，其包含能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，
能够特异性检测miR-30a-5p的核酸探针或核酸引物，和
能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物。
[11’] [8’] - [10’]中任一项的诊断试剂，其进一步包含环状瓜氨酸肽。
发明效应
本发明使得能够确定类风湿性关节炎病的存在或不存在且确定类风湿性关节炎患者疾病状态，而无需利用常规标记例如风湿病因子和抗CCP抗体。因为可以获得与常规标记的那些可比较的高灵敏度和特异性，所以本发明可以精确地确定类风湿性关节炎病的存在或不存在。此外，即使在对于其类风湿性关节炎的早期诊断常规是困难的患者中（因为他们是抗CCP抗体阴性的），本发明也可以在早期确定类风湿性关节炎病的存在或不存在。
附图简述
图1显示关于miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的ROC曲线分析结果，以区分类风湿性关节炎患者（RA）与健康个体（HC）。（上图）ROC曲线。垂直轴显示灵敏度，并且水平轴显示1-特异性。（下图）来自RA和HC的血浆样品中的miRNA浓度分布。垂直轴显示样品数目，并且水平轴显示血浆中的浓度（pM）。（下表）关于每种miRNA的截断值、灵敏度和特异性。
图2显示关于miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p组合的3种miRNA的复合值的ROC曲线分析结果。（A）每种miRNA的似然比卡方和p值。（B）ROC曲线。垂直轴显示灵敏度，并且水平轴显示1-特异性。（C）来自RA和HC的血浆样品中的复合值分布。垂直轴显示样品数目，并且水平轴显示复合值（ePRAM）。（D）关于ePRAM的截断值、灵敏度和特异性。
图3显示关于抗CCP抗体的存在或不存在，以及miR-24, miR-30a-5p和miR-125a-5p组合的3种miRNA的复合值（ePRAM-C）的ROC曲线分析结果。（左上表）CCP定性[-]和每种miRNA的似然比卡方和p值。（左下表）来自RA和HC的血浆样品的复合值分布。垂直轴显示样品数目，并且水平轴显示ePRAM-C。虚线显示截断值。（右图）ROC曲线。垂直轴显示灵敏度，并且水平轴显示1-特异性。
图4显示来自RA（抗CCP抗体（ACPA）阳性病例）、RA（抗CCP抗体（ACPA）阴性病例）和HC的血浆样品中，miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的浓度分布，以及miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的复合值（ePRAM）分布。垂直轴显示样品数目与每组样品总数目的比（%），并且水平轴显示血浆中的浓度或复合值。
图5显示骨关节炎（OA）和***性红斑狼疮（SLE）患者的临床特征。
图6显示在骨关节炎（OA）和***性红斑狼疮（SLE）患者的血浆中，miR-24和miR-125a-5p的浓度（pM）分布，以及miR-24和miR-125a-5p的复合值（ePRAM）分布。灰色区域显示诊断有类风湿性关节炎的测试对象的每种miRNA的浓度和ePRAM。
实施方案的描述
1. 衍生自测试对象血液的样品用于确定类风湿性关节炎的病理状态的测试方法
本发明提供了测试衍生自测试对象血液的样品用于确定类风湿性关节炎的病理状态的方法，其包括下述步骤：（a）在衍生自测试对象血液的样品中，测量选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平，并且用样品中的内部标准miRNA的表达水平来标准化一种或多种表达水平（下文有时也称为本发明的测试方法）。
在上述步骤（a）中，优选地，测量miR-24和miR-125a-5p单独的表达水平。更优选地，使用内部标准miRNA的表达水平来标准化表达水平。最优选地，使用miR-30a-5p作为内部标准测量miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平。
本发明的方法一般在体外执行。
在本发明中，类风湿性关节炎的病理状态的确定意指确定对象中的类风湿性关节炎的症状的进展阶段，并且不仅包括确定测试对象的类风湿性关节炎的症状的进展（即疾病状态），还包括确定测试对象中的类风湿性关节炎的开始，以及确定类风湿性关节炎的预后。本发明的测试方法基于下述发现：在类风湿性关节炎患者中，miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p的表达水平与类风湿性关节炎的常规指数（VAS、DAS28（ESR）和DAS28（CRP））之间的关联，并且在类风湿性关节炎患者的血浆中，具有的表达水平显著高于健康人的表达水平的miRNAs（miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p），并且类风湿性关节炎的病理状态可以通过检查衍生自测试对象血液的样品以高准确度进行确定。
本申请人已显示在类风湿性关节炎患者的血浆中显示比健康人显著更高的表达水平的上述miRNA不受软骨组织破坏和一般的***性自身免疫反应影响，即在骨关节炎和***性红斑狼疮中，这些miRNA的表达水平与健康个体的那些并无显著不同。相应地，通过测量本发明的miRNA的表达水平，能够确定对象患有类风湿性关节炎，而不是骨关节炎或***性红斑狼疮。
因此，在进一步方面，根据本发明，能够确定测试对象中的类风湿性关节炎的症状的进展阶段，并且确定对象未患有骨关节炎或***性红斑狼疮。可用作确定指数的miRNA是miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p，优选地，miR-24和miR-125a-5p。
本发明中的测试对象可以是任何哺乳动物。优选的是患有类风湿性关节炎或怀疑患有其的哺乳动物。哺乳动物的例子包括实验动物例如啮齿类动物例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等，兔等，伴侣动物例如犬和猫等，驯养动物例如牛、猪、山羊、马、绵羊等，灵长类动物例如人、猴、猩猩、黑猩猩等，等，并且人是特别优选的。测试对象可以显示或不显示类风湿性关节炎的病理状态，并且可以处于或未处于类风湿性关节炎的治疗下。
在本发明的优选实施方案中，测试对象是抗CCP抗体阴性的。如下述实施例中所示，miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的表达水平在抗CCP抗体阳性病例和阴性病例之间并无显著不同。因此，即使当测试对象是抗CCP抗体阴性时，类风湿性关节炎的病理状态也可以基于这些miRNA的表达水平进行确定。
衍生自测试对象血液的样品的例子包括血液、血清和血浆等，并且从样品的易于制备、检测灵敏度等方面看来，血清和血浆是优选的。血液衍生的样品可以通过本身已知的方法由从测试对象中收集的外周血样品进行制备。当从血液取样到测试的时间是必要的时，血液衍生的样品（排除血液）也可以是冷冻保存的（例如-20℃）。
在步骤（a）中，在衍生自测试对象血液的样品中，测量选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平（优选地，选自miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，更优选地，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平）。此外，考虑到miR-30a-5p是内部标准的事实， miR-24和miR-125a-5p的表达水平的测量也是优选的，并且miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p包括证实为充当内部标准的miR-30a-5p的表达水平的测量是最优选的。这些miRNA是已经知道的分子，并且存在对应于每个生物种类的分子。序列信息可得自数据库例如miRBase（http://www.mirbase.org/）等。在本说明书中，miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30a-5p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p意指天然存在于测试对象的生物种类中的分子。例如，当本发明中的测试对象是人时，如下表1中所示，miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30a-5p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p分别是hsa-miR-24（由SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列组成，在miRBase中登记为登录号MIMAT0000080（也称为has-miR-24-3p））、hsa-miR-26a（由SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列组成，在miRBase中登记为登录号MIMAT0000082（也称为has-miR-26a-5p））、hsa-miR-28-5p（由SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列组成，在miRBase中登记为登录号MIMAT0000085）、hsa-miR-28-3p（由SEQ ID NO：4中所示的核苷酸序列组成，在miRBase中登记为登录号MIMAT0004502）、has-miR-30a-5p（由SEQ ID NO：10中所示的核苷酸序列组成，在miRBase中登记为登录号MIMAT0000087）、hsa-miR-30c（由SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列组成，在miRBase中登记为登录号MIMAT0000244（也称为has-miR-30c-5p））、hsa-miR-30e-3p（由SEQ ID NO：6中所示的核苷酸序列组成，在miRBase中登记为登录号MIMAT0000693）、hsa-miR-125a-5p（由SEQ ID NO：7中所示的核苷酸序列组成，在miRBase中登记为登录号MIMAT0000443）、hsa-miR-126-3p（由SEQ ID NO：8中所示的核苷酸序列组成，在miRBase中登记为登录号MIMAT0000445）和hsa-miR-502-5p（由SEQ ID NO：9中所示的核苷酸序列组成，在miRBase中登记为登录号MIMAT0002873）。
miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30a-5p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p中的每种miRNA可以含有由于天然存在的多态性、突变等（核苷酸置换、缺失、***或添加）的突变，并且因此含有此类突变的miRNA的表达水平可以在步骤（a）中进行测量。
通过本身已知的方法例如杂交、聚合酶链反应（PCR）等，并且使用能够特异性检测每种miRNA或其互补核酸（cRNA或cDNA）的核酸探针或核酸引物，可以测量miRNA的表达水平。测量方法的例子包括miRNA阵列、RNA印迹、定量PCR（实时PCR等）等。
使用从衍生自测试对象血液的样品中提取的miRNA作为靶，测量miRNA的表达水平。提取miRNA的方法并无具体限制，只要它是从衍生自测试对象血液的样品中提取含有miRNA的RNA（例如总RNA）的方法，并且使用例如商购可得的试剂和试剂盒（例如基于苯酚的试剂Tripure 分离试剂（Roche Applied Science）、用于液体样品的基于苯酚的试剂ISOGEN-LS（Nippongene）等），根据与之附着的方案，可以提取含有miRNA的RNA。
还能够从衍生自测试对象血液的样品中提取含有miRNA的RNA，并且随后进一步分离miRNA。通过本身已知的方法，并且使用例如商购可得的试剂和试剂盒（例如RNeasy Mini 柱（Qiagen）、高纯miRNA分离试剂盒（Roche Applied Science）等），根据与之附着的方案，可以分离miRNA。此处，“miRNA的分离”意指除去除miRNA外的组分的操作。
在miRNA的表达水平的测量中，为了标准化由于上述miRNA提取和分离在样品之间的变化，优选基于适当的内部标准来标准化miRNA的表达水平。内部标准并无具体限制，只要它是衍生自测试对象血液的样品中天然含有的任何组分，并且已知在类风湿性关节炎患者和健康人之间未显示统计学显著差异。例如，当血液衍生的样品是血浆时，miR-93-3p、miR-223-3p、miR-550、miR-339-3p和miR-30a-5p可以用作内部标准。在一个实施方案中，在下述miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p组合的表达水平的复合值计算中，使用miR-30a-5p作为内部标准来标准化miR-24和miR-125a-5p的表达水平的测量误差。可替代地，在上述miRNA提取和分离前，天然不存在于衍生自测试对象血液的样品中的miRNA可以作为内部标准加入样品中。例如，当测试对象是人时，秀丽隐杆线虫（C. elegans）miRNA cel-miR-39可以用作内部标准。
在本说明书中，“能够特异性检测miRNA或其互补核酸”的核酸探针意指核酸探针在适当的杂交条件下与miRNA或其互补核酸杂交，但不与其他核酸杂交，因为它对于miRNA或其互补核酸具有的亲和力高于除miRNA或其互补核酸外的核酸。
此类杂交条件可以通过本领域普通技术人员适当地加以选择。作为杂交条件，例如可以提及低严格条件。低严格条件是在杂交后的洗涤中，例如42℃、5×SSC、0.1% SDS，优选50℃、2×SSC、0.1% SDS的条件。更优选的杂交条件是高严格条件。高严格条件是例如65℃、0.1×SSC、0.1%SDS。影响杂交严格性的因素包括温度、盐浓度等的多种因素，并且本领域普通技术人员可以通过适当地选择这些因素而实现相似严格性。
能够特异性检测miRNA或其互补核酸的核酸探针的例子包括含有不小于约10个碱基（例如10 – 24个碱基，优选15 – 24个碱基）的连续核苷酸序列的多核苷酸，其与miRNA的一部分或整个核苷酸序列或其互补序列互补，并且能够与miRNA或其互补核酸杂交。基于本说明书中所述的核苷酸序列的信息等，可以通过本身已知的方法适当地设计此类核酸探针。例如，使用含有SEQ ID NOs：11 – 20中所示的每种核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸作为核酸探针，由SEQ ID NOs：1 – 10中所示的每种核苷酸序列组成的miRNA或其互补核酸可以各自进行检测。
在本说明书中，“能够特异性检测miRNA或其互补核酸”的核酸引物意指核酸引物通过PCR在适当的PCR反应条件下，且使用miRNA或其互补核酸作为模板来扩增其一部分或整个区域，但通过PCR使用所述核酸作为模板不扩增除miRNA或其互补核酸外的核酸的一部分或整个区域。
能够特异性检测miRNA的核酸引物可以是任何引物，只要它设计为能够特异性扩增miRNA或其互补核酸的核苷酸序列的一部分或整个区域。通过PCR定量miRNA一般通过下述执行：经由聚（A）聚合酶将聚（A）序列加入3'末端，通过逆转录反应合成cDNA，且定量cDNA。在这种情况下，通过含有不少于约10个碱基（例如10 – 24个碱基，优选15 – 24个碱基）的核苷酸序列的多核苷酸（正向引物）（其与每种miRNA的互补核酸（cDNA）的核苷酸序列的一部分杂交），和含有不少于约10个碱基（例如10 – 24个碱基，优选15 – 24个碱基）的核苷酸序列的多核苷酸（反向引物）（其与在从正向引物的杂交位点的3'侧上cDNA序列的互补序列的一部分杂交）的组合，可以特异性扩增每种miRNA或其互补核酸的核苷酸序列的一部分或整个区域。通过本身已知的方法，基于信息例如每种miRNA或其互补核酸的核苷酸序列，用于上述逆转录反应的引物序列等，可以适当地设计正向引物和反向引物。对于由SEQ ID NO：1 – 10中所示的每种核苷酸序列组成的miRNA的互补核酸的特异性扩增，含有SEQ ID NO：11 – 20中所示的每种核苷酸序列的多核苷酸可以用作正向引物。
核酸探针和核酸引物可以含有另外的序列（与其为检测靶的多核苷酸不互补的核苷酸序列），只要特异性检测不被干扰。
核酸探针和核酸引物可以用合适标记进行标记，所述合适标记例如放射性同位素（例如125I、131I、3H、14C、32P、33P、35S等）、酶（例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等）、荧光物质（例如荧光胺、异硫氰酸荧光素等）、发光物质（例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精等）、生物素等。可替代地，吸收由荧光物质发出的荧光能量的猝灭剂（猝灭物质）可以进一步在荧光物质（例如FAM、VIC等）的附近键合。在此类实施方案中，荧光物质和猝灭剂在检测反应期间分开，并且检测荧光。
核酸探针和核酸引物可以是DNA或RNA、或DNA/RNA嵌合体，其中优先给予DNA。另外，核酸探针和核酸引物可以是单链或双链，并且一般是单链。
核酸探针和核酸引物可以是具有人工修饰的核酸衍生物。具有人工修饰的核酸衍生物的例子包括但不限于具有经修饰的磷酸主链的那些，例如硫代磷酸酯型、硼代磷酸酯（boranophosphate）型DNA/RNA等；2'-修饰的核苷酸，例如2'-OMe的修饰RNA、2'-F修饰的RNA等；其中核苷酸的糖分子是交联的经修饰的核苷酸，例如LNA（锁核酸）、ENA（2’-O,4’-C-乙烯桥核酸）等；具有不同基本骨架的经修饰的核苷酸，例如PNA（肽核酸）、吗啉代核苷酸等；碱基修饰的核苷酸，例如5-氟尿苷、5-丙基尿苷等；等。
基于例如本说明书中所述的核苷酸序列的信息，且根据使用DNA/RNA自动化合成仪的常规方法，可以合成上述核酸探针和核酸引物。
能够特异性检测测量靶miRNA或其互补核酸的核酸探针可以结合在适当载体上且作为核酸阵列提供。载体并无具体限制，只要它一般用于有关领域中，并且例如可以提及膜（例如尼龙膜）、珠、玻璃、塑料、金属等。
本发明的方法可以含有下述步骤（b）：
（b）使步骤（a）中测量的表达水平与类风湿性关节炎的病理状态关联。
在步骤（b）中，使如步骤（a）中测量的衍生自测试对象血液的样品中的miRNA的表达水平与类风湿性关节炎的病理状态关联。
衍生自测试对象血液的样品中的miRNA的表达水平与类风湿性关节炎的病理状态关联意指确定步骤（a）中获得的来自测试对象的数据是否提示（或指示）类风湿性关节炎的病理状态。通过比较来自测试对象的数据与得自类风湿性关节炎患者的数据，比较来自测试对象的数据与得自非类风湿性关节炎患者的数据，或比较来自测试对象的数据与得自健康人的数据，来自测试对象的数据一般与类风湿性关节炎的病理状态关联。当来自测试对象的数据未显示与来自类风湿性关节炎患者的数据的统计学显著差异（一般地，p<0.05）时，来自测试对象的数据可以与类风湿性关节炎关联。当来自测试对象的数据显示与来自非类风湿性关节炎患者或健康人的数据的统计学显著差异（一般地，p<0.05）时，来自测试对象的数据可以与类风湿性关节炎关联。因此，能够确定测试对象患有类风湿性关节炎，确定测试对象的类风湿性关节炎的症状的进展速率（即，疾病状态），和确定类风湿性关节炎的预后良好/不良。
本领域普通技术人员可以适当地使上述miRNA的表达水平与类风湿性关节炎的病理状态关联，而无过度尝试和错误。
如下述实施例中所示，类风湿性关节炎患者中的miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的表达水平显著（p<0.05）高于健康人。另外，在类风湿性关节炎患者中组合miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平的复合值显著（p<0.05）高于健康人。即，在衍生自测试对象血液的样品中，当选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平（优选地，选自miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的表达水平，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平，更优选地，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平）统计学显著（一般地，p<0.05）高于非类风湿性关节炎患者或健康人的数据时，测试对象可以确定为患有类风湿性关节炎。
为了建立上述关联，在衍生自测试对象血液的测量样品中，选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平（优选地，选自miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的表达水平，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平，更优选地，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平），可以与发展类风湿性关节炎的许多患者或许多健康人中先前确定的miRNA表达水平的平均值相比较。
还能够预先设定在衍生自血液的样品中选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平（优选地，选自miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的表达水平，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平，更优选地，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平）的截断值，并且比较来自测试对象的数据与截断值。例如，当衍生自测试对象血液的样品中的miRNA的表达水平不小于截断值时，来自测试对象的数据与类风湿性关节炎的病理状态关联，并且测试对象可以确定为具有类风湿性关节炎。
当使用该值作为标准确定疾病时，“截断值”是满足高诊断灵敏度（真阳性率）和高诊断特异性（真阴性率）的值。例如，在发展类风湿性关节炎的个体中显示高阳性率和在未发展类风湿性关节炎的个体中显示高阴性率的值可以确定为截断值。
截断值的计算方法是有关领域中众所周知的。例如，在衍生自发展类风湿性关节炎的个体和未发展类风湿性关节炎的个体的血液的样品中，测量选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平（优选地，选自miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，更优选地，miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平，进一步更优选地，miR-24和miR-125a-5p的表达水平），确定所测量值的诊断灵敏度和诊断特异性，并且使用商购可得的分析软件，描绘基于这些值的ROC（接受者操作特征）曲线。随后，确定在其下诊断灵敏度和诊断特异性尽可能接近于100%的值，并且该值可以用作截断值。
此外，在类风湿性关节炎患者中，当类风湿性关节炎的常规指数（CRP、ESR、VAS、DAS28（ESR）和DAS28（CRP））的数值增加时，miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p的表达水平趋于变高。即，当测试对象是类风湿性关节炎患者时，基于衍生自测试对象血液的样品中选自miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平与类风湿性关节炎的常规指数之间的阳性关联，可以确定该疾病的状态。例如，当衍生自测试对象血液的样品中选自miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平相对高时，类风湿性关节炎的症状可以确定为已进一步进展。在这种情况下，利用衍生自许多类风湿性关节炎患者的血液的样品中的miRNA表达水平的分布图表等，检查测试对象的miRNA的相对表达水平，并且可以确定该疾病的状态。
在本发明的测试方法中，在衍生自测试对象血液的样品中，仅需要测量选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平（优选地，选自miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA，更优选地，选自miR-24和miR-125a-5p的至少一种miRNA）。有时通过测量来自其的多种（例如两种或更多种，优选不小于3种）miRNAs的表达水平，并且使其与类风湿性关节炎的病理状态关联，能够高度准确地确定类风湿性关节炎的病理状态。此外，如下述实施例中所示，基于来自这些miRNAs的miR-24和miR-125a-5p的表达水平以及内部标准miR-30a-5p的表达水平，能够特别高度准确地确定类风湿性关节炎病的存在或不存在。当测量多种miRNAs的表达水平且与类风湿性关节炎的病理状态关联时，它们可以使用多种miRNAs的复合值进行关联。例如，当待确定“miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的复合值（ePRAM）”时，它可以基于每种miRNA的表达水平（单位pM），由ePRAM=exp（-x）/（1+exp（-x））进行计算，即x=1.797 - 0.773×miR-24 + 0.141×miR-30a-5p - 15.6×miR-125a-5p。
复合值（ePRAM）可以通过任何方法进行分析，只要可以获得所需效应。例如，通过多变量逻辑回归分析获得的计算公式可以用于分析。当对类风湿性关节炎的疾病状态实施多变量逻辑回归时，可以成为靶的miRNAs包括miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-30a-5p，并且这些的表达水平可以组合用于分析。可以成为靶的miRNAs优选是miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p。
基于测量方法、种族和年龄，复合值可以通过上述计算进行调整，或还可以使用除上述那些外的miRNA作为例子。作为内部标准，可以使用miR-30a-5p或其他内部标准miRNA，或在一些情况下，内部标准可能是不必要的。
在本发明的测试方法的优选实施方案中，上述miRNA表达水平可以与抗CCP抗体水平组合，以计算复合值，所述抗CCP抗体水平是用于诊断类风湿性关节炎的已知测试标准之一，基于所述复合值可以确定类风湿性关节炎的病理状态。如下述实施例中所示，因为miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的表达水平在抗CCP抗体阳性病例和阴性病例之间并无显著不同，所以抗CCP抗体阴性病例中的类风湿性关节炎也可以基于这些miRNAs的表达水平进行确定。因此，通过组合在衍生自测试对象血液的样品中选自miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的表达水平与血清抗CCP抗体水平，并且使该水平与类风湿性关节炎的病理状态关联，可以获得高灵敏度和特异性。另外，如下文实施例中所示，通过组合选自miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平与血清抗CCP抗体水平，并且使该水平与类风湿性关节炎的病理状态关联，可以获得特别高的灵敏度和特异性。因为miR-30a-5p是内部标准，所以还能够用任何内部标准来标准化miR-24和miR-125a-5p的表达水平，将其与血清抗CCP抗体水平组合，并且使该值与类风湿性关节炎的病理状态关联。
测试对象的血清中的抗CCP抗体水平可以通过本身已知的方法进行测量。例如，它可以通过ELISA利用环状瓜氨酸肽（CCP）（含有聚角蛋白微丝（filaggrin）的瓜氨酸位点的环状肽）等进行测量，所述环状瓜氨酸肽是针对抗CCP抗体的抗原（Arthritis Rheum., 43（1）：p.155-63（2000）, Ann. Rheum. Dis., 64：p.1510-1512（2005））。另外，还可以使用商购可得的抗CCP抗体测量试剂盒例如MBL的MESACUP-2或MEBChrom CCP测试等。
与类风湿性关节炎的病理状态的关联可以以与上文相同的方式基于例如复合值（ePRAM-C）来执行。ePRAM-C=exp（-x）/（1+exp（-x））（x=3.075 - 614.386×miR-24 + 80.96×miR-30a-5p - 9292.79×miR-125a-p - 5.856×抗CCP抗体（阳性；1，阴性；0）可以由上述miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平以及抗CCP抗体水平进行计算。
由于上述关联，当测试对象确定为患有类风湿性关节炎时，可以执行适当治疗例如施用用于类风湿性关节炎的治疗药物等。当测试对象的类风湿性关节炎的疾病状态确定为已进展时，可以执行适当治疗例如用于类风湿性关节炎的治疗药物剂量中的增加等。另一方面，当测试对象的类风湿性关节炎的疾病状态确定为已减弱时，可以执行适当治疗例如用于类风湿性关节炎的治疗药物剂量中的减少等。
在进一步方面，当基于上述关联，测试对象确定为已患有类风湿性关节炎时，测试对象可以同时确定为未患有骨关节炎或***性红斑狼疮。对于此类确定，测量选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平，优选miR-24和/或miR-125a-5p的一种或多种miRNA表达水平，并且可以通过上述方法进行关联。
2. 用于确定类风湿性关节炎的病理状态的诊断试剂
本发明提供了用于确定类风湿性关节炎的病理状态的诊断试剂，其包含能够特异性检测选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的核酸探针或核酸引物，或者能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物和能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物。在优选实施方案中，本发明提供了用于确定类风湿性关节炎的病理状态的诊断试剂，其包含能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物、和能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物，其中所述诊断试剂可以含有能够特异性检测内部标准miRNA的任何核酸探针或核酸引物。作为优选的内部标准miRNA，可以提及miR-30a-5p。使用本发明的诊断试剂，可以容易地执行本发明的上述测试方法，并且类风湿性关节炎的病理状态可以伴随高准确度快速确定。
包含在本发明的诊断试剂中的核酸探针或核酸引物的细节如“1. 衍生自测试对象血液的样品用于确定类风湿性关节炎的病理状态的测试方法”中所述。更具体而言，本发明的诊断试剂含有能够特异性检测选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的核酸探针或核酸引物；能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，能够特异性检测miR-30a-5p的核酸探针或核酸引物，和能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物；或能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，和能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物，优选地，能够特异性检测选自miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的核酸探针或核酸引物；能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，能够特异性检测miR-30a-5p的核酸探针或核酸引物，和能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物；或能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，和能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物，更优选地，能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，能够特异性检测miR-30a-5p的核酸探针或核酸引物，和能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物；或能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，和能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物。
通过将能够特异性检测每种测量靶miRNA或其互补核酸结合到适当载体上，本发明的诊断试剂可以作为核酸阵列提供。载体并无具体限制，只要它一般用于有关领域中，并且其例子包括膜（例如尼龙膜）、珠、玻璃、塑料、金属等。
本发明的诊断试剂中含有的每种组成元件在水或合适缓冲液（例如TE缓冲液、PBS等）中分开（或可能时，以混合状态）溶解至合适浓度，或以冷冻干燥状态置于适当容器中。
根据miRNA表达水平的测量方法，本发明的诊断试剂可以在其组成中进一步含有执行该方法必需的其他组分。通过经由例如miRNA阵列、RNA印迹、定量PCR（实时PCR等）等，通过本发明的诊断试剂（drub），通过测量miRNA表达水平，可以确定类风湿性关节炎的病理状态。当实时PCR用于测量时，本发明的诊断试剂可以进一步含有10×PCR反应缓冲液、10×MgCl2水溶液、10×dNTPs水溶液、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、逆转录酶等。当miRNA阵列和RNA印迹用于测量时，本发明的诊断试剂可以进一步含有印迹缓冲液、标记试剂、印迹膜等。
另外，本发明的诊断试剂可以在其组成中进一步含有测量抗CCP抗体水平必需的其他组分。此类其他组分是有关领域已知的。例如，当抗CCP抗体水平通过免疫学方法例如ELISA等进行测量时，本发明的诊断试剂可以含有环状瓜氨酸肽。环状瓜氨酸肽可以固定到载体（例如膜、珠、玻璃、塑料、金属等）上。除环状瓜氨酸肽之外，可以进一步含有能够与测试对象的抗CCP抗体结合的标记的抗IgG抗体等，由此可以有效执行本发明的测试方法的优选实施方案，其包括测量测试对象的血清抗CCP抗体水平的步骤。
实施例
本发明的实施例在下文说明；然而，本发明决不受这些实施例限制。
方法
（1）血浆样品的制备
该研究由Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, Kyoto University的伦理委员会批准。从206名参与者（102个类风湿性关节炎患者（RA）、104个健康个体（HC））获得知情同意书。RA根据美国风湿病学会（American College of Rheumatology）标准（Arthritis Rheum 1988, 31:315-324）进行诊断。从102个RA中收集外周血。将血样置于含有EDTA-2K的管中，并且分离血浆。将样品以1400 g离心7分钟并且在分析前冷冻保存于-80℃下。
（2）总RNA的制备
将血浆（4 ml）在冰上解冻，用无RNA酶水（4 ml）稀释，并且由用于液体样品的基于苯酚的试剂Sepasol-RNA II（Nacalai Tesque）提取两次。为了标准化通过RNA分离引起的样品间分散，将合成的秀丽隐杆线虫miRNA cel-miR-39（1 pmol, 20 μl, Hokkaido System Science）（在人中不存在同源序列）加入每种变性样品中。将获得的液体样品应用于RT2-qPCR-Grade miRNA分离试剂盒（SABiosciences），并且根据制造商的方案提取RNA。
（3）miRNA的分离
将血浆（150 μl）在冰上解冻，并且溶解于600 μl基于苯酚的试剂Tripure 分离试剂（Roche Applied Science）中。为了标准化通过RNA分离引起的样品间分散，将合成的秀丽隐杆线虫miRNA cel-miR-39（25 fmol, 5 μl, Hokkaido System Science）（在人中不存在同源序列）加入每种变性样品中。将样品静置5分钟，加入氯仿（0.15 ml），并且将混合物剧烈震荡15秒。在静置3分钟后，将混合物在4℃下以12,000 g.离心15分钟。分离水相（400 μl），以制备总RNA。随后，将水相（400 μl）与乙醇（600 μl）混合，并且使RNA结合至RNeasy Mini 柱（Qiagen）。将柱用缓冲液RWT（700 μl, Qiagen）洗涤一次，并且用缓冲液RPE（500 μl, Qiagen）洗涤三次，并且用无RNA酶水（37.5 μl）分离miRNA。
（4）miRNA阵列分析
使用TaqMan人miRNA阵列库A v3.0, B v2.0（Life Technologies）和Applied BioSystems 7900 Real-Time PCR***（Life Technologies），可以对总RNA实施miRNA阵列分析。
（5）miRNA的逆转录和定量实时PCR
根据制造商的方案，通过使用NCode VILO miRNA cDNA 合成试剂盒（Invitrogen），执行逆转录。通过使用EXPRESS SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal（Invitrogen）和Applied BioSystems 7500 实时PCR***（Life Technologies），执行实时PCR。根据NCode miRNA数据库（Invitrogen）设计正向引物。上述试剂盒所附的引物用作反向引物。使用SDS 相对定量软件版本2.06（Applied BioSystems）分析数据。
使用的正向引物的序列如下：
对于miR-24扩增，
对于miR-26a扩增，
对于miR-28-5p扩增，
对于miR-28-3p扩增，
对于miR-30a-5p扩增，
对于miR-30c扩增，
对于miR-30e-3p扩增，
对于miR-125a-5p扩增，
对于miR-126-3p扩增，
对于miR-502-5p扩增，。
搜索可用作内部标准的miRNA，并且通过实时PCR鉴定显示接近于许多miRNAs的平均Ct值的表达水平的多种miRNAs。另外在使用geNorm或NormFinder软件的内部标准候选物分析中，鉴定显示接近于平均值的表达水平的多种miRNAs。作为候选内部标准miRNAs，鉴定miR-93-3p、miR-223-3p、miR-339-3p、miR-30a-5p、miR-301a-5p和miR-484-5p。根据这些候选内部标准miRNAs，miR-30a-5p的表达水平用作实施例中的内部标准。
（6）临床指数
VAS（一般健康的视觉模拟评分）是患者的一般状况的自评估。通过患者在100 mm尺度上评分数值，其中使用0=“感觉非常良好（无症状）”和100=“感觉非常糟糕”。通过常规方法（例如由http://www.das-score.nl/中所述的计算公式等）计算DAS28（ESR）和DAS28（CRP）。
（7）统计分析
miRNA的表达水平以平均值±标准差显示。使用JMP8（SAS Japan）执行统计分析。通过斯氏t检验分析两组之间的差异。通过皮尔森积差相关系数分析miRNA浓度及其他临床指数之间的关联。p<0.05视为统计学显著的。
结果
从各自来自类风湿性关节炎患者（RA）和健康（HC）的三个样品的血浆中提取总RNA，并且执行miRNA阵列。关于提示为在RA和HC之间的表达水平中具有差异的26种miRNAs，通过定量PCR证实RA和HC各8个样品之间的表达水平中的差异，并且表2中所示的10种miRNAs选择为候选诊断标记或疾病状态标记。此外，这些miRNAs的表达水平在102个类风湿性关节炎患者和104个健康个体中进行测量，并且进行统计分析。
因此，如表2中所示，与HC相比较，血浆中的miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p显示在RA中的显著增加。
关于RA预测的预测值通过多变量逻辑回归分析进行计算。组合miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-30a-5p的表达水平，并且通过多变量逻辑回归分析最准确地分析预测类风湿性关节炎的疾病状态的值，发现通过miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p组合的计算预测最准确。
通过ROC曲线分析来分析miR-24、miR-26a和miR-125a-5p。因此，曲线下面积分别为0.80、0.80和0.83，并且类风湿性关节炎病的存在或不存在的确定中的灵敏度和特异性分别为63.7%、89.5%（截断值：1.46 pM）；53.9%、94.3%（截断值：3.09 pM）；和64.7%、89.5%（截断值：8.17 x 10-2 pM）（图1）。
另外，基于通过组合miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平获得的复合值ePRAM（基于每种miRNA的表达水平（单位：pM），ePRAM=exp（-x）/（1+exp（-x）），其中x=1.797 - 0.773×miR-24 + 0.141×miR-30a-5p - 15.6×miR-125a-5p），可以执行灵敏度78.4%和特异性92.3%的测试（图2）。
此外，基于通过组合现有抗CCP抗体水平以及miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平获得的复合值（ePRAM-C）（ePRAM-C=exp（-x）/（1+exp（-x）），其中x=3.075 - 614.386×miR-24 + 80.96×miR-30a-5p - 9292.79×miR-125a-p - 5.856×抗CCP抗体（阳性；1，阴性；0）），可以执行灵敏度94.1%和特异性95.2%的测试（图3）。
miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的表达水平在抗CCP抗体阳性病例和阴性病例之间未显示显著差异（图4）。
上述结果显示血浆中的miR-24、miR-26a和miR-125a-5p可以成为用于区分类风湿性关节炎患者与健康人的标记，并且通过组合miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平获得的复合值，和通过组合miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p的表达水平以及现有抗CCP抗体水平获得的复合值，允许实现具有高灵敏度和高特异性的测试。
此外，类风湿性关节炎患者就类风湿性关节炎指数（VAS、DAS28（ESR）和DAS28（CRP））的数值进行检查，并且统计学测试与血浆中的miRNA表达水平的关联。
因此，在miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-126-3p和miR-502-5p和VAS；miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p和DAS28（ESR）；以及miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p和DAS28（CRP）中发现miRNA浓度的绝对值或其对数和这些类风湿性关节炎指数之间的关联。ESR和CRP各自反映炎症反应。显示与之关联的miRNA表达水平可以是用于检查炎症反应的概况的一个指数。另外，VAS是由患者作出的主观疾病评估，并且与之关联意指它可以是能够客观评估由患者作出的主观评估的指数。另外，DAS28（ESR）和DAS28（CRP）反映类风湿性关节炎的疾病活动性。使用这些指数，目前确定增加或减少，药物改变等，并且通过与之关联的标记评估疾病活动性也可以用于治疗的选择。
根据上述结果，已阐明血浆中的miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的表达水平可以用作类风湿性关节炎的疾病状态标记，并且可以用于疾病活动性的时程判断，治疗效应确定等。
（比较实施例）
检查发现作为类风湿性关节炎的疾病状态标记的本发明miRNAs是否还在骨关节炎和***性红斑狼疮中显示增加的表达水平，所述骨关节炎是非炎性关节病，所述***性红斑狼疮是非风湿性自身免疫疾病。作为研究靶的测试对象的信息显示于图5中。分析血浆中的miR-24和miR-125a-5p的表达水平以及这些的复合值（ePRAM）。在骨关节炎患者中，在miR-24和miR-125a-5p以及这些的复合值（ePRAM）的测试中测试阴性的患者比例分别为79%、79%和75%（图6）。在***性红斑狼疮患者中，在miR-24和miR-125a-5p以及这些的复合值（ePRAM）的测试中测试阴性的患者比例分别为91%、64%和64%（图6）。因此，这些结果指示miR-24和miR-125a-5p以及这些的复合值（ePRAM）在骨关节炎和***性红斑狼疮中未显示高值，即，它们充当对类风湿性关节炎特异性的标记。
工业适用性
根据本发明，提供了用于诊断类风湿性关节炎的方法，其基于血浆中的miRNA表达水平。因为本发明提供了还可以诊断抗CCP抗体阴性病例的类风湿性关节炎的诊断试剂，所以早期治疗变得可用于更多患者。根据本发明，此外，患者可以分层用于治疗靶患者的适当选择等。因此，药物的使用效率可以得到增强，因此有利于医学经济。
本申请基于在日本提交的专利申请号2012-186937（提交日期：2012年8月27日），其内容完全引入本文。
                         序列表
 
<110>  Kyoto University
 
<120>  通过微小RNA诊断类风湿性关节炎
 
<130>  092074
 
<150>  JP 2012-186937
<151>  2012-08-27
 
<160>  20   
 
<170>  专利版本3.3
 
<210>  1
<211>  22
<212>  RNA
<213>  智人
 
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uggcucaguu cagcaggaac ag                                              22
 
 
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<212>  RNA
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uucaaguaau ccaggauagg cu                                              22
 
 
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<212>  RNA
<213>  智人
 
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aaggagcuca cagucuauug ag                                              22
 
 
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<212>  RNA
<213>  智人
 
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cacuagauug ugagcuccug ga                                              22
 
 
<210>  5
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<212>  RNA
<213>  智人
 
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uguaaacauc cuacacucuc agc                                             23
 
 
<210>  6
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<212>  RNA
<213>  智人
 
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cuuucagucg gauguuuaca gc                                              22
 
 
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<212>  RNA
<213>  智人
 
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ucccugagac ccuuuaaccu guga                                            24
 
 
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<212>  RNA
<213>  智人
 
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ucguaccgug aguaauaaug cg                                              22
 
 
<210>  9
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<212>  RNA
<213>  智人
 
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auccuugcua ucugggugcu a                                               21
 
 
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<212>  RNA
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uguaaacauc cucgacugga ag                                              22
 
 
<210>  11
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<212>  DNA
<213>  人工的
 
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<223>  PCR引物
 
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tggctcagtt cagcaggaac a                                               21
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工的
 
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gatttcaagt aatccaggat aggct                                           25
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工的
 
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<223>  PCR引物
 
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ggcaaggagc tcacagtcta ttgag                                           25
 
 
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cactagattg tgagctcctg ga                                              22
 
 
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cggtgtaaac atcctacact ctcagc                                          26
 
 
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ctttcagtcg gatgtttaca gc                                              22
 
 
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<212>  DNA
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tccctgagac cctttaacct gtga                                            24
 
 
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cgctcgtacc gtgagtaata atgcg                                           25
 
 
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gcttatcctt gctatctggg tgcta                                           25
 
 
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<223>  PCR引物
 
<400>  20
gcgtgtaaac atcctcgact gg                                              22

Claims (14)

1.一种测试衍生自测试对象血液的样品用于确定类风湿性关节炎的病理状态的方法，其包括下述步骤：
（a）在衍生自所述测试对象血液的样品中，测量选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平，并且用所述样品中的内部标准miRNA的表达水平来标准化一种或多种所述表达水平。
2.根据权利要求1的方法，其进一步包括下述步骤：
（b）使步骤（a）中测量的所述表达水平与类风湿性关节炎的病理状态关联。
3.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤（a）中，在衍生自所述测试对象血液的样品中，测量选自miR-24, miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的表达水平，或miR-24和miR-125a-5p的表达水平。
4.根据权利要求3的方法，其中在步骤（a）中，在衍生自所述测试对象血液的样品中，测量miR-24和miR-125a-5p的表达水平。
5.根据权利要求3或4的方法，其进一步包括下述步骤：
（a’）在衍生自所述测试对象血液的样品中，测量抗CCP抗体的水平，
其中在步骤（b）中，使步骤（a）中测量的表达水平和步骤（a’）中测量的所述抗CCP抗体水平与类风湿性关节炎的病理状态关联。
6.根据权利要求3或4的方法，其中所述测试对象是抗CCP抗体阴性的。
7.根据权利要求1 - 6中任一项的方法，其中所述衍生自血液的样品是血浆。
8.根据权利要求1 - 7中任一项的方法，其中所述测试对象是人。
9.一种用于确定类风湿性关节炎的病理状态的诊断试剂，其包含能够特异性检测选自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、miR-30e-3p、miR-125a-5p、miR-126-3p和miR-502-5p的至少一种miRNA的核酸探针或核酸引物，或
能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，
和
能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物。
10.根据权利要求9的诊断试剂，其包含能够特异性检测选自miR-24、miR-26a和miR-125a-5p的至少一种miRNA的核酸探针或核酸引物，或
能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，
和
能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物。
11.根据权利要求10的诊断试剂，其包含能够特异性检测miR-24的核酸探针或核酸引物，
和
能够特异性检测miR-125a-5p的核酸探针或核酸引物。
12.根据权利要求9 - 11中任一项的诊断试剂，其进一步包含环状瓜氨酸肽。
13.根据权利要求1 - 8中任一项的方法，其中所述内部标准miRNA是miR-30a-5p。
14.根据权利要求9 - 12中任一项的诊断试剂，其进一步包含能够特异性检测miR-30a-5p的核酸探针或核酸引物。
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