CN103215259A - 一种预测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒，属于检测技术领域。通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的A20基因第6内含子区rs610604位点的基因型，预测受试者对强直性脊柱炎的易感性；A20基因第6内含子区rs610604的基因型为AA时，受试者的易感性最低；rs610604的基因型为AC时，受试者的易感性较高；rs610604的基因型为CC时，受试者的易感性最高。本发明的优点是：首次阐述了A20基因多态性位点与强直性脊柱炎的相关性，提供了一种预测强直性脊柱炎易感性的方法，该方法可用于强直性脊柱炎的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

Description

一种预测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种预测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒，更具体的说是通过测定与AS相关基因A20的多态性预测受试者对于强直性脊柱炎的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物技术领域。

背景技术

强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一种自身免疫性疾病，多发于16-40岁的青壮年，男女患病比例约为4～10∶1。病变常首先发生于骶髂关节，少数重症患者表现为整个脊柱强直。此外，部分患者伴有不同程度的髋关节、眼、肺、心血管、肾等脊柱外病变。AS在白种人群中的发病率约为1％～3％，我国AS患病率约为0.2-0.6％，其中60％以上的患者伴有髋关节受累，致使20％以上AS患者残疾，炎症主要累及关节囊、肌腱和韧带的骨附着点，导致局部关节粘连强直，活动受限。临床上至今尚缺乏可明显缓解和控制疾病发展的药物。AS属多基因疾病，具有明显的遗传倾向，虽然通常认为遗传与免疫因素在AS发病中起主导作用，但确切的病因与发病机制仍不清楚。

目前进行AS遗传病因研究，多采用SNPs作为基因组标志的关联分析方法，是有效的，已得到证明。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需＞1％，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1％为同型碱基之间的转换：如G/A或T/C，29.1％为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C(胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺嘧啶)，SNPs包含了已知多态性的80-90％，是最常见的遗传变异。

由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNPs以其密度高(平均每1kb就有1个)、代表性强(位于基因内部的SNPs可能直接影响蛋白质结构或表达水平)、遗传稳定性好(同微卫星多态性比较而言)、易于自动化分析(因SNPs在人群中为双等位基因标记，可简单以“+/-或1/0”直接分型)等特点成为很好的遗传标志。

1973年，Brewerton等首先发现了与AS强相关的人类白细胞抗原-B27(HLA-B27)。随着研究的进展，与AS相关的其他易感基因如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)陆续被识别。近年来关于A20基因多态性与自身免疫性疾病的关联研究时有报道。

A20基因位于6q23，全长15869bp，含有9个外显子，其编码产物是位于细胞质内的一种锌指蛋白。A20又称肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosisfactor alpha-induced protein 3，TNFAIP3)，可抑制NF-κB的激活以及TNF介导的细胞凋亡。普遍认为A20的上调能限制持久NF-κB的激活造成的潜在性危害作用。动物实验证明，A20缺陷的小鼠患严重炎症和恶病质，对脂多糖和TNF高度敏感，不成熟就死去，并且A20缺陷细胞不能终止TNF-α诱导的NF-κB反应。可见，A20在体内可通过终止TNF-α诱导的NF-κB反应而起到限制炎症的作用。

近年来有不少关于A20基因多态性与自身免疫性疾病相关联的研究报道。Musone等报道了欧洲人群中A20基因上3个独立的SNPs(rs13192841，rs2230926和rs6922466)与***性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)有关联。2008年，在欧洲人群中做的全基因组关联分析(genome-wide associationstudy，GWAS)发现包括A20在内的许多SLE的新易感基因。Stahl EA等对GWAS相关结果进行了荟萃分析识别了与风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)相关的7个危险位点，其中A20基因SNP rs5029937(T)和rs6920220(A)可分别使RA的发生风险增加20％和40％。

因AS亦属自身免疫性疾病，可以推测A20基因多态性可能与AS的易感性也存在相关性。但是，经过现有国内外文献检索，未见有A20及其多态性位点与AS相关联的研究报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种预测强直性脊柱炎易感性的方法。

本发明的第二个目的是提供一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒，包括PCR引物和含有该引物的试剂。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测强直性脊柱炎易感性的核苷酸序列，为序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。

所述核苷酸序列为A20基因第6内含子区包含+401位单核苷酸多态性位点的核苷酸片段。rs610604即是第+401位碱基R(R＝A或C)。该核酸序列为A20第6内含子区的部分序列与第7外显子区的部分序列。图1为A20基因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有9个外显子，rs610604位点标在A20基因图中第6内含子区的相应位置。

所述+401位单核苷酸多态性位点的基因型为AA时，强直性脊柱炎易感性最低；基因型为AC时，易感性较高；基因型为CC时，受试者的易感性最高。

一组检测强直性脊柱炎易感性的引物，为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的碱基序列，长度分别为17bp和21bp，能扩增得到A20基因第6内含子区包含+401位单核苷酸多态性位点的核苷酸片段。

所述引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示。

一种强直性脊柱炎易感性基因的检测方法，包括如下步骤：

(1)抽提样品的基因组DNA，扩增A20基因第6内含子区包含+401位单核苷酸多态性位点(rs610604多态性位点)的核苷酸片段；

(2)检测步骤(1)产物中+401位单核苷酸多态性位点的基因型为AA时，强直性脊柱炎易感性最低；基因型为AC时，易感性较高；基因型为CC时，受试者的易感性最高。

所述扩增A20基因第6内含子区包含+401位单核苷酸多态性位点(rs610604多态性位点)的核苷酸片段，使用的一组引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示。

本发明提供了一种检测强直性脊柱炎易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增A20基因rs610604位点的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下：

一种检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，由以下试剂组成：

10μL 10×PCR缓冲液；

2μL 10mM dNTP混合液；

2μL Taq DNA聚合酶，2unit/μL；

1μL F1引物，为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

1μL R1引物，为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

8μL 10×LC-green PLUS饱和荧光染料；

2μL寡核苷酸内参引物各0.5μL，浓度为10pmol/μL，其中低温内参引物F为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，低温内参引物R为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，高温内参引物F为SEQ ID NO.6所示的序列，高温内参引物R为SEQID NO.7所示的核苷酸序列；

64μL纯水。

使用方法：

1)PCR扩增：通过PCR扩增A20基因的第6内含子区部分片段，制备混合液10×PCR反应缓冲液1μL，10mmol/L dNTP 0.2μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，10pmol/L上游引物0.1μL，10pmol/L下游引物0.1μL，1×LC Green PLUS饱和荧光染料0.8μL，寡核苷酸内参0.2μL(高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05μL)(序列见表1)，基因组DNA1μL，加去离子水至10μL。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性1min，58℃退火20s，72℃延伸10s，总共45个循环，72℃总延伸7min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理：95℃30s，25℃2min，94℃30s，24℃4min。PCR时于每一体系中加入20μl的石蜡油，以防止液体挥发。

2)基因型判定：将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light scannerTMHR-I 96上进行HRM分析，用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，根据熔解曲线的差异判定基因型。

序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列及其包含+401位单核苷酸多态性位点的核苷酸片段在制备诊断或治疗强直性脊柱炎的试剂或药物中的用途。

A20基因第6内含子区+401位单核苷酸多态性位点在制备诊断或治疗强直性脊柱炎的试剂或药物中的用途。

本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如：体液(血液、腹水及尿液等)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含A20基因突变位点的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含A20基因突变点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。

在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据A20基因的突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定A20基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。

本发明的优点是：本发明首次阐明了A20基因多态性位点与AS的相关性，提供了一种预测AS易感性的方法，该方法可用于AS的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以便公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为A20基因结构及其多态性变异位点的示意图

图2为A20基因变异位点经HRM方法的基因分型图

图3为A20基因变异位点的测序图

具体实施方式

用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下：

10×PCR缓冲液：10mM Tris-HCI(pH＝8.3)，500mM氯化钾(KCI)，10mM氯化镁(MgCI2)，0.01％(W/V)白明胶

dNTP：脱氧核苷三磷酸

EDTA：乙二胺四乙酸二钠

TE：10mM Tris-HCI(pH＝7.5)，1mM EDTA(pH＝8.0)

实施例1：血液样本收集和基因组DNA的提取

1.按纽约1984年的修订诊断标准入选病例，共选取来自吉林地区无血缘关系的AS患者118例(年龄：14-44岁，平均24岁)，同地区的健康对照志愿者148例(年龄：39-72岁，平均46岁)。所有受检者均为汉族且签署书面知情同意书，这项研究得到***北京医院，***老年医学研究所伦理审核委员会的认可，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》：人体医学研究的伦理原则。

2.根据下列方法，制备人基因组DNA。①首先在已标号的1.5mL EP管中加1000uL红细胞裂解液，后加入400μL EDTA抗凝血(抗凝血加入前颠倒混匀3-5次)，颠倒混匀，室温静置10分钟；②13000rpm离心30秒后，除去上清液；③在所得沉淀中加480μl核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20μL蛋白酶K(用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶K)，颠倒混匀，65℃孵箱10分钟，(期间不时上下混匀，确保无凝块)；④拿出后降至室温，加300mL蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm离心2分钟；⑤将上清液移至新EP管中，加入670uL预冷的异丙醇，充分颠倒混匀(10次以上)，可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；⑥弃上清液并确保沉淀留在EP中，加入670uL 70％乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心2分钟；⑦弃上清，使管内乙醇挥发干净；⑧加入TE溶解液(400uL)，充分溶解，然后对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/μL，放置于4℃备用，剩余基因组DNA置-20℃冰箱保存。

实施例2：SNP的识别鉴定

本发明采用PCR-高分辨率溶解曲线(HRM)分析法和PCR测序技术同时对A20基因的第6内含子区的rs610604位点(其等位位点为C/A)的基因型进行检测。图2为A20基因变异位点经HRM方法的基因分型图、图3为A20基因变异位点的测序图。

1.PCR-HRM引物的确定

从Genebank中查取rs610604附近的DNA碱基序列(SEQ ID NO.1)，引物设计在Oligo 6.0和primer5.0软件下完成。目的片段定位在A20基因第6内含子区，全长59bp，确定了正义链F1(+383bp--+399bp)与反义链R1(+421bp--+441bp)，特异性引物序列如下：

F1：5’-GGCCTGTGATGAAGAGC-3’(SEQ ID NO.2)

R1：5’-ATGTTGGGAAATGTGTCAGAT-3’(SEQ ID NO.3)

2.PCR-HRM反应体系及条件

通过PCR扩增A20基因第6内含子区部分片段，PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液1μL，10mmol/L dNTP 0.2μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，10pmol/L上游引物0.1μL，10pmol/L下游引物0.1μL，1×LC Green PLUS饱和荧光染料0.8μL，寡核苷酸内参0.2μL(高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05μL)(序列见表1)，基因组DNA 1μL，加去离子水至10μL。PCR时于每一体系中加入20μl的石蜡油，防止液体挥发。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性1min，58℃退火20s，72℃延伸10s，总共45个循环，72℃总延伸7min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理：95℃30s，25℃2min，94℃30s，24℃4min。

表1高、低温寡核苷酸内参引物序列、退火温度及产物片段长度

3.HRM判定基因型

将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light scanner TMHR-I 96上进行HRM分析：从45℃开始，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲线，到98℃结束，用LightScanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，判定基因型。

4.测序验证

从所得的不同基因型的个体中分别随机抽取3例样本进行测序验证。测序样本重新进行PCR扩增，测序引物序列为：F2：5’-ATGGCATAAAGGCTGGGTGTT-3’(SEQ ID No.8)，R2：5’-GGCTGCTAATGCTGGTGGAG-3’(SEQ ID No.9)，扩增片段长717bp。PCR反应总体系为30uL，包含：基因组DNA 3uL，10×PCRBuffer 3uL，10mmol/L dNTP 0.6uL，Taq DNA聚合酶(5U/uL)0.6uL，上下游引物(10pmol/uL)各0.3uL，去离子水补充至总体积30uL。PCR反应条件为：95℃预变性5min后进入主循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸7min。PCR产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像***观察合格后送华大基因测序部进行测序验证。

实施例3：基因SNP与AS的相关性

统计方法：运用Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性。利用SPSS11.0软件中Pearson卡方检验计算A20基因rs610604多态性位点的等位基因、基因型在AS病例组与正常对照组间的分布频率，AS的患病风险OR值及其95％CI可信区间，以P＜0.05为差异显著性标准。

结果：位于6p21.3区域的A20基因上SNP rs610604多态位点的基因型和等位基因频率在病例与对照组间的分布详见表2。

表2 A20基因rs610604C/A多态位点的基因型和等位基因频率在病例对照组间的分布

注：OR：比值比；CI：可信区间。*C等位基因为易患AS的风险等位基因。携带者分为AS的风险等位基因(CC或AC)携带者，和非风险等位基因(AA)携带者。

由表2可见，A20基因rs610604的C等位基因，即在其DNA互补链上为G等位基因，在患者群体中的分布频率显著高于其在健康正常人群中的等位基因分布频率(11.9％vs.6.8％)，具有显著性差异(P＝0.041)，而且C位点的OR值为1.858，95％CI：1.018-3.3；在AS的风险等位基因(CC或AC)携带者和非风险等位基因(AA)携带者中，风险基因型在病例组中的分布频率显著高于对照组中的(P＜0.05)，均表明A20基因rs610604位点与AS患病呈正相关，可能有增加AS发病的风险。

实施例4：检测试剂盒

制备检测AS相关风险的试剂盒，包含有可扩增出A20基因SNP rs610604位点的引物对，及其他PCR-HRM相应试剂。本发明试剂盒供10人份检测应用，于-20℃避光保存，其组分、含量和来源包括：

10μL 10×PCR缓冲液(Pharmacia)，

2μL 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，

2μL Taq DNA聚合酶(2unit/μL)(Takara)，

1μL F1(SEQ ID NO.2)(10pmol/μL)，

1μL R1(SEQ ID NO.3)(10pmol/μL)引物，

8uL 1×LC-green PLUS饱和荧光染料(美国Idaho公司)，

2uL寡核苷酸内参引物，各0.5uL，浓度为10pmol/μL，其中低温内参引物F为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，低温内参引物R为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，高温内参引物F为SEQ ID NO.6所示的序列，高温内参引物R为SEQID NO.7所示的核苷酸序列；

64uL纯水。

经PCR-HRM检测后，可轻易检测出A20基因第6内含子区SNP rs610604的多态性。

验证试验：采用本试剂盒，随机选取AS患者样本10例，对照组样本10例，经PCR-HRM检测A20基因第6内含子区+401位点的单核苷酸多态性。

一.方法

1)PCR扩增：通过PCR扩增A20基因的第6内含子区部分片段，制备混合液：10×PCR反应缓冲液1μL，10mM/LdNTP0.2μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，10pM/L上游引物0.1μL，10pM/L下游引物0.1μL，1×LC-Green Plus饱和荧光染料0.8μL，寡核苷酸内参0.2μL(高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05μL)(序列见表1)，基因组DNA1μL，加纯水至10μL。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸5s，总共45个循环，72℃总延伸2min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理：95℃30s，25℃2min，94℃30s，24℃4min。PCR前于每一体系中加入20μL的石蜡油，以防止液体挥发。

2)基因型判定：将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light ScannerTMHR-I 96上进行HRM分析，用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，根据熔解曲线的差异判定基因型。

二.结果：

结果显示，AS患者样本A20基因第6内含子区+401位点的CC或AC基因型频率显著高于对照组样本+401位点的AA基因型。

本发明具有实用性的例证：

本发明的A20基因多态性的检测方法可用于分析人常染色体6p21.3区的A20基因上的常见SNP(rs610604)位点的C等位位点，即在其DNA互补链上为G等位位点，应用于对AS的辅助性诊断和评估个体有多大的AS患病风险，以利于开展AS的早期干预和治疗。

利用本发明阐述A20基因rs610604位点的碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节A20表达的活性分子，促进AS新药研发。

本发明建立的检测A20基因多态性的核酸序列和AS相关位点，可高灵敏度，特异性的应用于AS基因辅助诊断的试剂盒。

如上所诉，得出结论，A20基因rs610604位点的多态性与AS具显著相关性。因此，根据本发明测定此多态性，可用于AS的基因辅助诊断。

本发明叙述了A20基因AS相关的新突变位点，并提供了一种测定A20基因多态性的方法，而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定A20基因的多态性。结果，本发明提供了一种测定AS相关基因多态性的基因辅助诊断方法。

Claims (10)

1.一种检测强直性脊柱炎易感性的核苷酸序列，其特征在于：为序列表SEQID No.1所示核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测强直性脊柱炎易感性的核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列为A20基因第6内含子区包含+401位单核苷酸多态性位点的核苷酸片段。

3.根据权利要求2所述的检测强直性脊柱炎易感性的核苷酸序列，其特征在于：所述+401位单核苷酸多态性位点的基因型为AA时，强直性脊柱炎易感性最低；基因型为AC时，易感性较高；基因型为CC时，受试者的易感性最高。

4.一组检测强直性脊柱炎易感性的引物，其特征在于：能扩增得到A20基因第6内含子区包含+401位单核苷酸多态性位点的核苷酸片段。

5.根据权利要求4所述的一组检测强直性脊柱炎易感性的引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示。

6.一种强直性脊柱炎易感性基因的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)抽提样品的基因组DNA，扩增A20基因第6内含子区包含+401位单核苷酸多态性位点的核苷酸片段；

(2)检测步骤(1)产物中+401位单核苷酸多态性位点的基因型为AA时，强直性脊柱炎易感性最低；基因型为AC时，易感性较高；基因型为CC时，受试者的易感性最高。

7.根据权利要求6所述的强直性脊柱炎易感性基因的检测方法，其特征在于：所述扩增A20基因第6内含子区包含+401位单核苷酸多态性位点的核苷酸片段，使用的一组引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

8.一种检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：

10μL 10×PCR缓冲液；

2μL 10mM dNTP混合液；

2μL Taq DNA聚合酶，2unit/μL；

1μL F1引物，为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

1μL R1引物，为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

8μL 10×LC-green PLUS饱和荧光染料；

2μL寡核苷酸内参引物各0.5μL，浓度为10pmol/μL，其中低温内参引物F为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，低温内参引物R为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，高温内参引物F为SEQ ID NO.6所示的序列，高温内参引物R为SEQID NO.7所示的核苷酸序列；

64μL纯水。

9.序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列及其包含+401位单核苷酸多态性位点的核苷酸片段在制备诊断或治疗强直性脊柱炎的试剂或药物中的用途。

10.A20基因第6内含子区+401位单核苷酸多态性位点在制备诊断或治疗强直性脊柱炎的试剂或药物中的用途。

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