CN101643730A - 微小RNA-146a在类风湿关节炎治疗中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明鉴定了一种在RA炎症细胞中低表达的microRNA(miR－146a)，并且证实了miR－146a能够抑制RA滑膜成纤维细胞的功能，具有抑炎作用。
Description
技术领域
研究涉及微小RNA-146a(miR-146a)在类风湿关节炎外周血单个核细胞中的表达水平、作用途径，以及对滑膜细胞功能的抑制作用。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病。未经正确治疗的RA可迁延不愈，甚至导致关节畸形。目前RA的发病机制并不明确，限制了治疗手段的发展。
微小RNA(microRNA，miRNA)是近年来发现的一类位于真核生物中的长度约21nt的内源性非编码小分子单链RNA，通过与靶mRNA的3’UTR结合，参与转录后基因表达的调控。目前的研究表明，近30％的人类蛋白编码基因接受miRNA的调控，miRNA不仅参与了生物体的正常发育，在疾病的发生中也起着极为重要的作用。MiRNA的发现，为我们了解疾病的发生机制提供了新的线索。
MiR-146a参与了免疫细胞的发育和分化，也有证据表明RA患者外周血单个核细胞(PBMC)和滑膜组织中miR-146a表达异常，但目前尚不清楚miR-146a表达异常的意义。本研究在观察RA患者PBMCs miR-146a及其靶标mRNA表达情况的基础上，进一步探索了miR-146a对RA滑膜成纤维细胞功能的影响，旨在寻找miR-146a潜在的治疗价值。
发明内容
本研究首先通过检测RA患者PBMCs中miR-146a的表达水平，了解炎症状态下miR-146a的改变情况。我们选取了诊断明确的RA患者及正常对照各5例，利用密度梯度离心法提取PBMCs，实时定量PCR(qRT-PCR)检测了PBMC中miR-146a的表达情况，并且与RA患者的临床资料进行了相关性分析。结果发现，miR-146a在RA患者PBMCs中显著下调，并且与疾病活动度指标—血沉(ESR)成负相关。提示miR-146a在RA发病中可能起着负调控的作用。为了进一步了解miR-146a发挥作用的途径，我们检测了与NF-b通路活化密切相关的两个靶标mRNA-TRAF6、IRAK1的表达水平。TRAF6、IRAK1是活化NF-κb通路、产生TNF-α等炎症因子的重要因素，目前已证明是miR-146a的靶标之一。但并不清楚在RA中，miR-146a是否通过这两个靶标mRNA发挥调节作用。我们的结果显示RA中表达下调的miR-146a与上调的TRAF6、IRAK1水平成负相关，表明miR-146a至少部分是通过TRAF6、IRAK1在RA的发病中发挥调控作用的。
为了深入了解miR-146a在RA发病中的负调控作用，我们研究了miR-146a对RA患者FLS增殖及炎性因子分泌的影响。实验分两组进行，一组为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)活化组，一组为无TNF-α活化组，脂质体转染化学合成的miR-146a，以无关序列小RNA为阴性对照。48小时后检测FLS的增殖情况，及细胞上清IL-6及IL-8水平。我们发现TNF-α活化组FLS增殖及IL-8、IL-6分泌水平明显增高；而miR-146a对两组FLS的增殖及炎性细胞因子IL-6、IL-8的分泌均有明显的抑制作用。这表明，TNF-α在RA患者FLS的活化过程中起着重要作用，而miR-146a对RA患者过度活化的FLS具有抑制作用，并且这种抑制作用不受TNF-α的影响。这对于RA的免疫治疗具有重要意义。
附图说明
图1.RA患者PBMCs中miR-146a表达水平显著降低，差异具有统计学意义(0.74±0.81，1.82±1.35，p＜0.01)。
图2.RA患者PBMCs miR-146a的表达水平与ESR成负相关(r＝-0.449，p＜0.05)
图3.RA患者PBMCs IRAK1、TRAF6表达水平显著上调。IRAK1在RA和正常对照PBMCs中的表达量分别为2.62±2.04，1.28±1.32；TRAF6在RA和正常对照PBMCs中的表达量分别为3.74±5.48，1.68±1.32，P值均小于0.05。
图4.RA患者PBMCs miR-146a的表达水平与靶标IRAK1成负相关(r＝-0.486，P＜0.01)。
图5.RA患者PBMCs miR-146a的表达水平与靶标TRAF6成负相关(r＝-0.297，P＜0.05)。
图6.3H掺入法检测miR-146a对RA-FLS增殖的影响。转染miR-146a 48小时后，在TNF-α活化组及无TNF-α组，，FLS cpm值分别为8093.00±2592.98和2015.00±544.75均明显低于阴性对照小RNA(16692.40±976.91，8798.60±1922.08，P值均小于0.01)。
图7.miR-146a对RA-FLS IL-6分泌的影响。在无TNF-α组(A)及TNF-α活化组(B)，转染miR-146a 48小时后，FLS上清IL-6分别为152.59±49.49pg/ml和16479.05±3710.37pg/ml，均明显低于阴性对照小RNA(310.82±123.36pg/ml和27081.47±3874.37pg/ml，P值均小于0.01)。
图8.miR-146a对RA-FLS IL-8分泌的影响：在无TNF-α组(A)及TNF-α活化组(B)，转染miR-146a48小时后，FLS上清IL-8分别为294.65±94.78pg/ml和6549.80±1128.86pg/ml，均明显低于阴性对照小RNA(459.26±125.79pg/ml和9064.51±761.99pg/ml，P值均小于0.01)。
具体实施方式
实施例1：RA患者PBMCs miR-146a表达情况的检测
本研究纳入符合1987年美国风湿病学会(ACR)分类标准的RA患者30例，同时选取30例年龄、性别相匹配的正常志愿者，获取知情同意，抽取4ml抗凝血。立即予以密度梯度离心法分离PBMC，Trizol法提取总RNA，用紫外分光光度仪测A260。MiR-146a的相对表达水平用ΔCt和2-ΔΔCt计算，U6snRNA作为内参，检测方法相同。实时定量PCR根据上海吉玛公司提供的miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit进行操作。结果发现RA患者PBMCs中miR-146a表达显著下调，见图1。
实施例2：RA患者PBMCs miR-146a表达情况与临床指标相关性分析
为探讨miR-146a表达水平的临床意义，我们对miR-146a表达量与各项临床指标做了Spearman相关性分析，结果发现miR-146a表达量与ESR成负相关，目前未发现与类风湿因子(RF)、抗CCP抗体等其它的临床指标存在相关性。见图2。
实施例3：RA患者PBMCs miR-146a表达情况与靶标mRNA TRAF6、IRAK1的相关性分析
为了了解miR-146a在RA中发挥作用的途径，我们同时检测了RA患者PBMCs中TRAF6、IRAK1的表达量。TRAF6、IRAK1是能活化NF-κb通路，产生TNF-α等致炎因子，已被证明是miR-146a的靶标。但RA中miR-146a是否通过TRAF6、IRAK1发挥调控作用并不明确。我们用qRT-PCR检测了TRAF6、IRAK1的表达情况，并且与miR-146a做了Spearman相关性分析，发现TRAF6、IRAK1表达明显上调(图3)，并且二者的含量与miR-146a均成负相关(见图4)，说明miR-146a至少部分通过抑制TRAF6、IRAK1的表达发挥在RA中的调控作用。
实施例4：miR-146a对RA-FLS增殖能力的影响
留取RA患者膝关节置换术后滑膜组织，分离培养滑膜成纤维细胞，使用3代后的细胞进行试验。分成两组，一组为TNF-α活化组(10ng/ml)，一组为无TNF-α活化组，分别同时行Lipo2000脂质体转染化学合成的miR-146a(序列为5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3’，根据miRBase release 10.1，http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/，由上海吉玛公司合成)，对照选用无关序列小RNA。转染时使用96孔板，每孔细胞5×103，设三复孔。48小时后收集细胞，3H掺入法检测滑膜成纤维细胞增殖情况。结果发现TNF-α活化组FLS增殖更为明显，但转染miR-146a后对两组FLS增殖均有显著的抑制作用，见图5。
实施例5：miR-146a对RA-FLS分泌炎症因子的影响
使用3代以后的RA患者FLS，5×104/孔接种于12孔板，Lipo2000脂质体转染化学合成的miR-146a及阴性对照后，分成TNF-α诱导(10ng/ml)及无TNF-α组，每组均为复孔，ELISA法检测转染48h后FLS上清IL-6、IL-8的分泌水平。结果表明，TNF-α活化组FLS分泌IL-6、IL-8更为明显，但转染miR-146a后对两组FLS炎症因子的分泌均有显著的抑制作用，见图7、图8。
Claims (3)
1、一种单链非编码小RNA，序列为5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3’。
2、权利要求1中的微小RNA在治疗类风湿关节炎中的应用。
3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：抑制滑膜细胞功能。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| EP2889383A4 (en) * | 2012-08-27 | 2016-07-13 | Univ Kyoto | DIAGNOSIS OF RHEUMATOID ARTHRITIS WITH MICROARN |
| CN106459970A (zh) * | 2013-11-22 | 2017-02-22 | 俞松良 | 微rna146‑a及其于诊断、治疗及预防小核醣核酸病毒感染的用途及微rna146‑a拮抗剂 |
| CN112359107A (zh) * | 2020-11-15 | 2021-02-12 | 安徽中医药大学第一附属医院(安徽省中医院) | Linc02085基因的应用及其检测方法 |
| CN112961914A (zh) * | 2021-02-07 | 2021-06-15 | 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) | miR-3074-5p作为类风湿关节炎标志物的应用及其试剂盒 |
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2009
- 2009-07-27 CN CN200910089633A patent/CN101643730A/zh active Pending
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| CN112359107B (zh) * | 2020-11-15 | 2021-09-14 | 安徽中医药大学第一附属医院(安徽省中医院) | Linc02085基因的应用及其检测方法 |
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