CN101643730A - 微小RNA-146a在类风湿关节炎治疗中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明鉴定了一种在RA炎症细胞中低表达的microRNA(miR-146a),并且证实了miR-146a能够抑制RA滑膜成纤维细胞的功能,具有抑炎作用。
Description
技术领域
研究涉及微小RNA-146a(miR-146a)在类风湿关节炎外周血单个核细胞中的表达水平、作用途径,以及对滑膜细胞功能的抑制作用。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病。未经正确治疗的RA可迁延不愈,甚至导致关节畸形。目前RA的发病机制并不明确,限制了治疗手段的发展。
微小RNA(microRNA,miRNA)是近年来发现的一类位于真核生物中的长度约21nt的内源性非编码小分子单链RNA,通过与靶mRNA的3’UTR结合,参与转录后基因表达的调控。目前的研究表明,近30%的人类蛋白编码基因接受miRNA的调控,miRNA不仅参与了生物体的正常发育,在疾病的发生中也起着极为重要的作用。MiRNA的发现,为我们了解疾病的发生机制提供了新的线索。
MiR-146a参与了免疫细胞的发育和分化,也有证据表明RA患者外周血单个核细胞(PBMC)和滑膜组织中miR-146a表达异常,但目前尚不清楚miR-146a表达异常的意义。本研究在观察RA患者PBMCs miR-146a及其靶标mRNA表达情况的基础上,进一步探索了miR-146a对RA滑膜成纤维细胞功能的影响,旨在寻找miR-146a潜在的治疗价值。
发明内容
本研究首先通过检测RA患者PBMCs中miR-146a的表达水平,了解炎症状态下miR-146a的改变情况。我们选取了诊断明确的RA患者及正常对照各5例,利用密度梯度离心法提取PBMCs,实时定量PCR(qRT-PCR)检测了PBMC中miR-146a的表达情况,并且与RA患者的临床资料进行了相关性分析。结果发现,miR-146a在RA患者PBMCs中显著下调,并且与疾病活动度指标—血沉(ESR)成负相关。提示miR-146a在RA发病中可能起着负调控的作用。为了进一步了解miR-146a发挥作用的途径,我们检测了与NF-b通路活化密切相关的两个靶标mRNA-TRAF6、IRAK1的表达水平。TRAF6、IRAK1是活化NF-κb通路、产生TNF-α等炎症因子的重要因素,目前已证明是miR-146a的靶标之一。但并不清楚在RA中,miR-146a是否通过这两个靶标mRNA发挥调节作用。我们的结果显示RA中表达下调的miR-146a与上调的TRAF6、IRAK1水平成负相关,表明miR-146a至少部分是通过TRAF6、IRAK1在RA的发病中发挥调控作用的。
为了深入了解miR-146a在RA发病中的负调控作用,我们研究了miR-146a对RA患者FLS增殖及炎性因子分泌的影响。实验分两组进行,一组为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)活化组,一组为无TNF-α活化组,脂质体转染化学合成的miR-146a,以无关序列小RNA为阴性对照。48小时后检测FLS的增殖情况,及细胞上清IL-6及IL-8水平。我们发现TNF-α活化组FLS增殖及IL-8、IL-6分泌水平明显增高;而miR-146a对两组FLS的增殖及炎性细胞因子IL-6、IL-8的分泌均有明显的抑制作用。这表明,TNF-α在RA患者FLS的活化过程中起着重要作用,而miR-146a对RA患者过度活化的FLS具有抑制作用,并且这种抑制作用不受TNF-α的影响。这对于RA的免疫治疗具有重要意义。
附图说明
图1.RA患者PBMCs中miR-146a表达水平显著降低,差异具有统计学意义(0.74±0.81,1.82±1.35,p<0.01)。
图2.RA患者PBMCs miR-146a的表达水平与ESR成负相关(r=-0.449,p<0.05)
图3.RA患者PBMCs IRAK1、TRAF6表达水平显著上调。IRAK1在RA和正常对照PBMCs中的表达量分别为2.62±2.04,1.28±1.32;TRAF6在RA和正常对照PBMCs中的表达量分别为3.74±5.48,1.68±1.32,P值均小于0.05。
图4.RA患者PBMCs miR-146a的表达水平与靶标IRAK1成负相关(r=-0.486,P<0.01)。
图5.RA患者PBMCs miR-146a的表达水平与靶标TRAF6成负相关(r=-0.297,P<0.05)。
图6.3H掺入法检测miR-146a对RA-FLS增殖的影响。转染miR-146a 48小时后,在TNF-α活化组及无TNF-α组,,FLS cpm值分别为8093.00±2592.98和2015.00±544.75均明显低于阴性对照小RNA(16692.40±976.91,8798.60±1922.08,P值均小于0.01)。
图7.miR-146a对RA-FLS IL-6分泌的影响。在无TNF-α组(A)及TNF-α活化组(B),转染miR-146a 48小时后,FLS上清IL-6分别为152.59±49.49pg/ml和16479.05±3710.37pg/ml,均明显低于阴性对照小RNA(310.82±123.36pg/ml和27081.47±3874.37pg/ml,P值均小于0.01)。
图8.miR-146a对RA-FLS IL-8分泌的影响:在无TNF-α组(A)及TNF-α活化组(B),转染miR-146a48小时后,FLS上清IL-8分别为294.65±94.78pg/ml和6549.80±1128.86pg/ml,均明显低于阴性对照小RNA(459.26±125.79pg/ml和9064.51±761.99pg/ml,P值均小于0.01)。
具体实施方式
实施例1:RA患者PBMCs miR-146a表达情况的检测
本研究纳入符合1987年美国风湿病学会(ACR)分类标准的RA患者30例,同时选取30例年龄、性别相匹配的正常志愿者,获取知情同意,抽取4ml抗凝血。立即予以密度梯度离心法分离PBMC,Trizol法提取总RNA,用紫外分光光度仪测A260。MiR-146a的相对表达水平用ΔCt和2-ΔΔCt计算,U6snRNA作为内参,检测方法相同。实时定量PCR根据上海吉玛公司提供的miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit进行操作。结果发现RA患者PBMCs中miR-146a表达显著下调,见图1。
实施例2:RA患者PBMCs miR-146a表达情况与临床指标相关性分析
为探讨miR-146a表达水平的临床意义,我们对miR-146a表达量与各项临床指标做了Spearman相关性分析,结果发现miR-146a表达量与ESR成负相关,目前未发现与类风湿因子(RF)、抗CCP抗体等其它的临床指标存在相关性。见图2。
实施例3:RA患者PBMCs miR-146a表达情况与靶标mRNA TRAF6、IRAK1的相关性分析
为了了解miR-146a在RA中发挥作用的途径,我们同时检测了RA患者PBMCs中TRAF6、IRAK1的表达量。TRAF6、IRAK1是能活化NF-κb通路,产生TNF-α等致炎因子,已被证明是miR-146a的靶标。但RA中miR-146a是否通过TRAF6、IRAK1发挥调控作用并不明确。我们用qRT-PCR检测了TRAF6、IRAK1的表达情况,并且与miR-146a做了Spearman相关性分析,发现TRAF6、IRAK1表达明显上调(图3),并且二者的含量与miR-146a均成负相关(见图4),说明miR-146a至少部分通过抑制TRAF6、IRAK1的表达发挥在RA中的调控作用。
实施例4:miR-146a对RA-FLS增殖能力的影响
留取RA患者膝关节置换术后滑膜组织,分离培养滑膜成纤维细胞,使用3代后的细胞进行试验。分成两组,一组为TNF-α活化组(10ng/ml),一组为无TNF-α活化组,分别同时行Lipo2000脂质体转染化学合成的miR-146a(序列为5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3’,根据miRBase release 10.1,http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/,由上海吉玛公司合成),对照选用无关序列小RNA。转染时使用96孔板,每孔细胞5×103,设三复孔。48小时后收集细胞,3H掺入法检测滑膜成纤维细胞增殖情况。结果发现TNF-α活化组FLS增殖更为明显,但转染miR-146a后对两组FLS增殖均有显著的抑制作用,见图5。
实施例5:miR-146a对RA-FLS分泌炎症因子的影响
使用3代以后的RA患者FLS,5×104/孔接种于12孔板,Lipo2000脂质体转染化学合成的miR-146a及阴性对照后,分成TNF-α诱导(10ng/ml)及无TNF-α组,每组均为复孔,ELISA法检测转染48h后FLS上清IL-6、IL-8的分泌水平。结果表明,TNF-α活化组FLS分泌IL-6、IL-8更为明显,但转染miR-146a后对两组FLS炎症因子的分泌均有显著的抑制作用,见图7、图8。
Claims (3)
1、一种单链非编码小RNA,序列为5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3’。
2、权利要求1中的微小RNA在治疗类风湿关节炎中的应用。
3、根据权利要求2所述的应用,其特征在于:抑制滑膜细胞功能。
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CN112359107A (zh) * | 2020-11-15 | 2021-02-12 | 安徽中医药大学第一附属医院(安徽省中医院) | Linc02085基因的应用及其检测方法 |
CN112961914A (zh) * | 2021-02-07 | 2021-06-15 | 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) | miR-3074-5p作为类风湿关节炎标志物的应用及其试剂盒 |
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2009
- 2009-07-27 CN CN200910089633A patent/CN101643730A/zh active Pending
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