CN104450651B - 一种β‑葡萄糖苷酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种β‑葡萄糖苷酶突变体及其应用。所述β‑葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4，最适作用温度为50℃，且在30℃‑60℃范围内能保持80％以上的酶活，耐热性比野生型更强；最适作用pH为5.0，且在pH3.0‑6.0范围内能保持70％以上的酶活，在酸性条件下的适用范围比野生型更宽泛，因此更加有利于其在纤维素原料降解过程中的应用。

Description

一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因筛选改造技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶(cellobias，CB或β-G)和苦杏仁苷酶。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。

纤维素是由β-1，4-糖苷键连接而成D-吡喃式葡萄糖聚合物，是地球上最丰富且可再生的资源。据估计，地球上每年光合作用产生1.5×1011亿吨纤维素(Ryu，D.D等，1980，Enzyme and Microbial Technology)。多数情况下，要高值化利用纤维素首先必须通过纤维素酶对其进行有效降解。自然界中产纤维素酶的生物很多，主要是微生物，如丝状真菌、细菌和放线菌等。因此，对产纤维素酶微生物的筛选或遗传改造研究及应用就受到了普遍的关注。

一般认为，纤维素类物质经酶促作用生成葡萄糖至少需要三种酶：内切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶把纤维素先降解成纤维二糖，它再被β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。纤维素酶主要是通过这三种酶协同作用，最后将纤维素转化为葡萄糖。在这个过程中β-葡萄糖苷酶起到关键作用。而在纤维素酶组分中β-葡萄糖苷酶含量少、活力低，成为纤维素酶解的瓶颈。因此,通过基因重组技术构建工程菌,分泌表达高活性β-葡萄糖苷酶对纤维素有效降解具有重要意义。为此，已经有很多种β-葡萄糖苷酶基因被构建到不同的工程菌中。而开发性能更加优良的β-葡萄糖苷酶，并提高其表达量依然是本领域的研究热点之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。本发明通过大量突变的筛选，最终获得一种耐热性更强、在酸性环境下适用范围更宽泛的突变体，并构建得到了重组表达该突变体的里氏木霉工程菌株，为实现其应用奠定了基础。

本发明一方面涉及一种β-葡萄糖苷酶，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-葡萄糖苷酶的第93位氨基酸由Leu变为Ile，第133位氨基酸由Tyr变为Phe，第222位氨基酸由Asn变为Gly，第579位氨基酸由Ile变为Leu，第676位氨基酸由Gln变为Phe。

上述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明另一方面涉及携带有编码序列为SEQ ID NO：4的β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组质粒。

本发明还涉及一种工程菌株，其携带有上述重组质粒。

所述工程菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)。

本发明还涉及一种纤维素酶，是由上述里氏木霉发酵制备得到的。

本发明经过大量筛选获得了一种新型β-葡萄糖苷酶突变体，该突变体的最适作用温度为50℃，且在30℃-60℃范围内能保持80％以上的酶活，耐热性比野生型更强；最适作用pH为5.0，且在pH3.0-6.0范围内能保持70％以上的酶活，在酸性条件下的适用范围比野生型更宽泛，因此更加有利于其在纤维素原料降解过程中的应用。

附图说明

图1：SDS-PAGE电泳检测图，

其中泳道1为里氏木霉宿主菌发酵上清液，泳道2为里氏木霉TR-BG发酵上清液，泳道3为里氏木霉TR-BG5发酵上清液，箭头所指处为95KDa；

图2：β-葡萄糖苷酶野生型与突变体相对酶活-作用温度曲线图；

图3：β-葡萄糖苷酶野生型与突变体相对酶活-作用pH曲线图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。在实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。

实施例1β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其突变体的构建

1.1提取烟曲霉总基因组DNA

将烟曲霉(Aspergillus fumigatus)过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100mM Tris-HCl，100mM EDTA，250mMNaCl，1％SDS)；然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl10M NH4AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70％乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

1.2基因克隆

以1.1中提取的基因组总DNA为模板，分别利用引物BG-F和BG-R进行PCR扩增：

BG-F：AAAGGTACCATGAGATTCGGTTGGCTCGAGG；

BG-R：AAATCTAGACTAGTAGACACGGGGCAGAGG；

PCR扩增条件为95℃4min；94℃30S；58℃30S，72℃3min30个循环；72℃，7min；凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

1.3表达载体构建

将1.2中的PCR扩增产物用限制性内切酶XbaI和KpnI进行酶切；同时，用限制性内切酶XbaI和KpnI对木霉表达载体pTG进行酶切；使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶将上述两个酶切产物连接；将连接产物转化进DH5a大肠杆菌，用氨苄青霉素进行选择。通过对所获得的克隆进行测序可知，上述PCR扩增产物的基因序列为SEQ ID NO:2(命名为TR-BG)，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。经NCBI BLAST序列比对发现，SEQ IDNO:1与来源于烟曲霉的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列相似性为100％。

使用质粒中量制备试剂盒从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化重组质粒，该质粒命名为pTG-TR-BG。

1.4突变体的获得

申请人为了进一步提高上述β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:1)的耐热性，以1.3中构建得到的重组质粒pTG-TR-BG为模板，分别设计引物，对目的基因进行多点定点突变，结果发现有些突变对其耐热性没有影响，有些突变甚至使耐热性更差了，另外还有些突变，虽然能提高耐热性，但突变后其pH适用范围变窄，均不符合要求。最终，申请人获得了既能显著提高耐热性，又能扩大酸性条件下的适用范围的突变位点的组合：L93I，Y133F，N222G，I579L，Q676F五点突变。

将上述五点突变体命名为TR-BG5，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，参照该序列合成一个编码核苷酸序列SEQ ID NO:4。该序列是依照里氏木霉的密码偏爱性而优化合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上KpnI和XbaI两个酶切位点，由上海生工生物工程股份有限公司完成。

采用1.3所述操作构建含上述五点突变体基因的重组质粒，命名为pTG-TR-BG5。

实施例2转化与筛选

吸取里氏木霉菌株孢子悬浮液于PDA平板中心(9cm培养皿)，待菌落长满整个培养皿，各切1cm×1cm大小的培养基，置于120mL YEG+U液体培养基中，30℃，200rpm，培养14～16h。

用无菌Miracloth滤布收集菌丝体，并用溶液A清洗一次，在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到40mL原生质体化溶液，30℃，90rpm，培养1-2h，用显微镜观察检测原生质体转化进展。

用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生质体溶液分装于两个50mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45mL，3000rpm，离心10min，弃去上清液，获得沉淀；用5mL溶液B再清洗沉淀两次；将沉淀重悬浮于10mL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目在1×10⁸个/mL左右。

在冰上，将200μL上述原生质体溶液加入预冷的无菌7mL离心管中，每个转化反应用1管，加入10μg重组质粒pTG-TR-BG5，加入50μL溶液C，温和混匀后再冰上放置20min。

将转化上层培养基熔化并保持在55℃；从冰中移出上述7mL离心管，并向管中加入2mL溶液C和4mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物；向3个顶层琼脂试管中的每一个中加入1mL上述原生质体混合物，并立即倾倒与转化下层平板上，并将平板在30℃下培养5-7d至有转化子长出。

挑取其中一个转化子过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100mM Tris-HC，100mM EDTA，250mM NaCl，1％SDS)；然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl10MNH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70％乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

提取上述转化子的基因组DNA，并以此为模板，利用上下游引物进行PCR扩增，对目的基因进行验证。

上游引物序列为：GGGGTACCATGGCTCTCTCCAAGCT；

下游引物序列为：GCTCTAGATTACAAGCACTGCGAATAC；

PCR扩增条件为95℃4min；94℃40S；58℃40S，72℃3min，30个循环；72℃7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，并进行测序分析，结果显示PCR扩增产物的基因序列为SEQ ID NO:4，从而说明本发明构建得到了含β-葡萄糖苷酶突变体TR-BG5基因的里氏木霉工程菌，将其命名为里氏木霉TR-BG5(Trichoderma reesei TR-BG5)。

采用上述同样方法将野生型β-葡萄糖苷酶TR-BG的基因也转化到里氏木霉中，构建得到重组表达野生型β-葡萄糖苷酶TR-BG的里氏木霉工程菌，将其命名为里氏木霉TR-BG(Trichoderma reesei TR-BG)。

溶液A：2.5mL1M K₂HPO₄，2.5mL1M KH₂PO₄，48.156g MgSO₄，加入dlH₂O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

溶液B：5mL1M Tris(pH7.5)，2.77g CaCl₂，109.32g山梨醇，加入dlH₂O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

溶液C：250g PEG4000，2.77g CaCl₂，5mL1M Tris(pH7.5)，加入dlH₂O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

原生质体化溶液：将0.4mg裂解酶(Lysing Enzyme from Trichodermaharzianum，Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

转化下层平板：0.1％MgSO₄,1％KH₂PO₄,0.6％(NH₄)₂SO₄,1％葡萄糖,0.35％琼脂粉。

转化上层培养基：0.1％MgSO₄,1％KH₂PO₄,0.6％(NH₄)₂SO₄,1％葡萄糖,18.3％山梨醇,0.35％琼脂糖。

微量元素：在250mL dlH₂O中加入1g FeSO₄·7H₂O，8.8g ZnSO₄·7H₂O，0.4gCuSO₄·5H₂O，0.15g MnSO₄·4H₂O，0.1g Na₂B₄O₇·10H₂O，50mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH₂O定容至1L，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

PDA平板：20g葡萄糖，200g土豆蒸煮液，15g琼脂，加入dlH₂O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。

YEG+U液体培养基：20g葡萄糖，5g酵母提取物，1g尿苷，加入dlH₂O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。

实施例3发酵验证

将未导入外源基因的里氏木霉宿主菌、里氏木霉TR-BG5和里氏木霉TR-BG分别接种于MM发酵培养基(1.5％葡萄糖，1.7％乳糖，2.5％玉米浆，0.44％(NH₄)₂SO₄，0.09％MgSO₄，2％KH₂PO₄，0.04％CaCl₂，0.018％吐温-80，0.018％微量元素)培养，30℃培养48小时，然后25℃培养48小时。分别将发酵液进行离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，本发明所述来源于烟曲霉的β-葡萄糖苷酶的理论分子量大小约为95KDa，即图1中箭头所指的位置，泳道1是宿主菌发酵上清液，其在箭头所指位置几乎没有蛋白条带，而泳道2的里氏木霉TR-BG和泳道3的里氏木霉TR-BG5发酵上清液在箭头所指处各有一条很明显的蛋白条带，从而说明本发明构建的里氏木霉工程菌TR-BG能有效表达野生型β-葡萄糖苷酶TR-BG，里氏木霉工程菌TR-BG5能有效表达β-葡萄糖苷酶突变体TR-BG5。

实施例4β-葡萄糖苷酶酶活测定

1、酶活测定方法

1)酶活性单位定义

在50℃、pH值为4.8(中性为6.0)的条件下，每分钟从浓度为0.5％的水杨苷溶液中降解释放相当于1微摩尔葡萄糖的还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。

2)测定原理

β－葡萄糖苷酶能够水解纤维二糖中的葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的葡萄糖量成正比，而葡萄糖的生成量又与反应液中β－葡萄糖苷酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β－葡萄糖苷酶的活力。

3)测定步骤

取四支25mL比色管(一支空白管，三支样品管)。分别向四支管中，准确加入用相应pH缓冲溶液配制的水杨苷溶液(5.3)2.00mL。分别准确加入稀释好的待测酶液0.50mL于三支样品管中(空白管不加)，用漩涡混匀器混匀，盖塞。将四支试管同时置于50±0.1℃水浴中，准确计时，反应15min。迅速、准确地向各管中加入DNS试剂3.OmL，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.50mL,摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，准确计时，加热10min，取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。以空白管调零，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量。三支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。

4)酶活计算

酶活力计算公式：X1＝A×(10⁶/180.2/10³)×1/0.5×n/15＝0.74×A×n

式中：

X l—β葡萄糖苷酶酶活力，u/g(或u/mL)；

A—吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的还原糖量，mg；

10⁶/180.2/10³—葡萄糖含量换算成微摩尔；

1/0.5—换算成酶液1ml；

n—酶样的稀释倍数；

15—时间换算系数。

2、酶活测定结果

按照上述方法测定里氏木霉宿主菌发酵上清液酶活仅为5.5U/mL，里氏木霉TR-BG的发酵上清液的酶活为242U/mL，而里氏木霉TR-BG5发酵上清液的酶活为291U/mL，从而进一步证明宿主菌本身产β-葡萄糖苷酶的量极少，而重组菌里氏木霉TR-BG和TR-BG5则能高效表达外源的β-葡萄糖苷酶。

实施例5酶学性质分析

1、最适作用温度

分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH6.0条件下测定上述里氏木霉TR-BG和TR-BG5的发酵上清液酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，野生型β-葡萄糖苷酶TR-BG的最适作用温度为40℃，而β-葡萄糖苷酶突变体TR-BG5的最适作用温度为50℃，且在30℃-60℃范围内能保持80％以上的酶活，从而说明突变后β-葡萄糖苷酶的耐热性得到显著提高。

2、最适作用pH值

分别用pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液稀释上述里氏木霉TR-BG和TR-BG5的发酵上清液，在50℃条件下测定其酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图3所示，野生型β-葡萄糖苷酶TR-BG的最适作用pH为6.0，而β-葡萄糖苷酶突变体TR-BG5的最适作用pH为5.0，且在pH3.0-6.0范围内能保持70％以上的酶活，从而说明突变后β-葡萄糖苷酶在酸性条件下的适应能力得到显著增强，适用范围更加宽泛。

综上，本发明获得的β-葡萄糖苷酶突变体在里氏木霉中的表达量显著高于野生型，且突变体的耐热性更强，在酸性条件下的适用范围更宽泛，更加有利于其在纤维素材料酶解过程中的应用。

Claims (7)

1.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的β-葡萄糖苷酶是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-葡萄糖苷酶的第93位氨基酸由Leu变为Ile，第133位氨基酸由Tyr变为Phe，第222位氨基酸由Asn变为Gly，第579位氨基酸由Ile变为Leu，第676位氨基酸由Gln变为Phe；其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求2所述的基因。

5.一种工程菌株，其特征在于，所述的工程菌株携带有权利要求4所述的重组质粒。

6.如权利要求5所述的工程菌株，其特征在于，所述的工程菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)。

7.一种制备权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求5所述的工程菌株发酵制备β-葡萄糖苷酶。