CN109321552A

CN109321552A - 一种新型普鲁兰酶及其基因、工程菌和制备方法

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Publication number: CN109321552A
Application number: CN201811182852.1A
Authority: CN
Inventors: 王兴吉; 刘逸寒; 王克芬; 路福平; 刘文龙
Original assignee: Shandong Longkete Enzyme Preparation Co Ltd; Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Shandong Longkete Enzyme Preparation Co Ltd; Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2018-10-11
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2038-10-11
Also published as: CN109321552B

Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，涉及一种新型普鲁兰酶及其基因和氨基酸序列以及制备的方法，其技术方案是经菌种筛选获得一株能够产生普鲁兰酶的长野解普鲁兰杆菌，通过易错PCR技术对所筛选得到普鲁兰酶基因进行改造，从而得到一段改造后的普鲁兰酶的基因，然后将该新型普鲁兰酶基因，分别在枯草芽胞杆菌表达***、解淀粉芽孢杆菌表达***和地衣芽孢杆菌表达***中进行表达，实现该新型普鲁兰酶的不同制备方法。同时该新型普鲁兰酶在食品工业、医药工业方面有较好的作用。

Description

一种新型普鲁兰酶及其基因、工程菌和制备方法

技术领域：

本发明涉及一种新型普鲁兰酶及其基因、工程菌和制备方法，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该新型普鲁兰酶的重组表达菌株，以及该细菌普鲁兰酶蛋白在工业上的应用，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术：

普鲁兰酶(Pullulanase)，又称为α-糊精内-1,6-α-葡糖苷酶，或普鲁兰糖6-葡糖水解酶。人们最初发现它是由于它能水解普鲁兰多糖中的α-1,6-糖苷键，故命名为普鲁兰酶。它能专一性切开支链淀粉中分支点的α-1,6-糖苷键，剪下支链结构使支链淀粉形成直链淀粉。

在酶分类数据库中，普鲁兰酶属于糖基水解酶第13家族。它广泛存在于动物、植物和微生物中，种类繁多，作用方式也各有差异。根据其作用的底物特异性及生成物的不同，普鲁兰酶又可分为三种类型。I型普鲁兰酶，可直接水解普鲁兰多糖中的α-1,6-糖苷键，切下分支结构形成直链淀粉，主要生成潘糖。Ⅱ型普鲁兰酶，既可以水解淀粉及糖原中的α-1,4-糖苷键又能水解α-1,6-糖苷键，也就是说既具有普鲁兰酶的活性又具有α-淀粉酶的活性，其水解普鲁兰多糖后的生成物主要是异葡糖基麦芽糖。Ⅲ型普鲁兰酶，可以同时作用于普鲁兰多糖、淀粉、支链淀粉等，其水解普鲁兰多糖主要产生麦芽糖、麦芽三糖以及潘糖。虽然三种类型的普鲁兰酶的水解特性不同，但它们在结构上具有相似性，都具有四个保守区域。

普鲁兰酶能分解支链的特性决定了他在食品工业中的广泛应用，通常将糖化酶和普鲁兰酶一起使用来提高糖化率并加速糖化过程，同时也在啤酒酿造、酒精工业和怡糖生产过程中发挥作用，已成为淀粉酶制剂中一个很有前途的新品种，广泛的存在于动物、植物和微生物中。利用Aerobacter aerogenes产气杆菌发酵获得了最初的普鲁兰酶，并具有较好的酶学特性。到如今，许多不同来源和不同类型的普鲁兰酶已被发现和研究。而文献中已报导的I型普鲁兰酶大多来源于中温菌，近年来，也有低温I型普鲁兰酶的相关研究，随着低温普鲁兰酶可用于低温下废水处理和一些低温的食品工业应用，人们对低温普鲁兰酶的兴趣逐渐增加。与I型普鲁兰酶不同，Ⅱ型普鲁兰酶的菌株来源更加广泛分布在极端嗜热菌和超麻热菌，相比之下，另外第三类普鲁兰水解酶的报导较少。

普鲁兰酶分为三大类，不同类型的普鲁兰酶在结构特征方面存在一定的差别。绝大多数Ⅰ型普鲁兰酶具有高度保守的7个氨基酸组成的结构域:YNWGYDP。据推测这一保守区域与酶的底物结合和催化活性有关，保留了长期的选择压力。Ⅱ型普鲁兰酶被两个糖苷水解酶家族涵盖，即GH57家族和GH13家族。Ⅱ型普鲁兰酶也有4个高度保守的结构域。与Ⅰ型普鲁兰酶不同的是，多数Ⅱ型普鲁兰酶的结构域Ⅱ由两个超二级结构组成，其中一个结构位于结构域Ⅲ和结构域Ⅳ之间。Ⅰ型普鲁兰酶是通过形成糖苷键-酶的中间产物形成异头构型的净保留来催化α-1,6-糖苷键，普鲁兰酶的活性中心是Asp622-Glu651-Asp736的催化三联体结构：Asp-622是酶的亲核体，Glu-651参与酸碱催化，Asp-736与O3/O3相互作用稳定过渡态中间物。而Ⅱ型高温普鲁兰酶酶分子的催化三联体的活性中心结构由Asp597-Glu626-Asp703构成，但是Ⅰ型和Ⅱ型普鲁兰酶的催化机制都符合Koshland提出的糖苷水解酶的催化机制。

从自然界分离到的天然菌株，分泌普鲁兰酶的能力很低，这就限制了普鲁兰酶的应用。因此需要将基因工程技术手段应用于普鲁兰酶的研究和开发中，提高酶的产量，以满足众多领域的需要。已经有数十个普鲁兰酶基因进行了异源表达，主要的表达***为大肠杆菌表达***。虽然基因工程技术在普鲁兰酶的研究中取得了一些成绩，但总体来说，普鲁兰酶的表达水平不高。通过基因工程手段表达普鲁兰酶，提高普鲁兰酶表达量，将成为普鲁兰酶基础研究和应用研究的主要发展方向。

芽胞杆菌属于革兰氏阳性菌。芽胞杆菌表达***具有以下优点：1、许多芽胞杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；2、有很强的蛋白分泌能力，可将蛋白直接分泌到培养基中(利于纯化)；3、无明显的密码子偏好性；4、有成熟的发酵工艺，能达到很高的密度(在简单的培养基中)能够高效地分泌各种蛋白质；5、芽胞杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；6、发酵过程简单，芽胞杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；7、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。

在本发明中，原始普鲁兰酶酶编码基因来源于长野解普鲁兰杆菌，它属于细菌，对长野解普鲁兰杆菌基因组中原始普鲁兰酶编码基因进行克隆和突变，获得新型普鲁兰酶基因，并在在枯草芽胞杆菌表达***、解淀粉芽孢杆菌表达***以及地衣芽孢杆菌表达***中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌高稳定性普鲁兰酶重组菌株、解淀粉芽孢杆菌高稳定性普鲁兰酶表达重组菌株以及地衣芽孢杆菌高稳定性普鲁兰酶表达重组菌株，重组菌株发酵后，经过相应的处理，可以得到高稳定性普鲁兰酶，并且该新型重组普鲁兰酶可以用于水解支链淀粉。

发明内容：

本发明的目的在于克服和避免目前工业上生产普鲁兰酶所存在的不足之处，并提供一种新型细菌普鲁兰酶及其编码基因，同时提供表达该新型细菌普鲁兰酶基因的工程菌株。

本发明实现目的的技术路线如下：以长野解普鲁兰杆菌的基因组为模板，并根据已报道的长野解普鲁兰杆菌普鲁兰酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的普鲁兰酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2，其中，上游引物P1和下游引物P2是用来扩增在枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoR I、Not I。通过酶切、连接等构建重组载体之后，利用易错PCR技术对野生型普鲁兰酶基因进行随机突变，得到普鲁兰酶突变体及其编码基因pulm，将其与pBSA43载体连接后，构建重组质粒pBSA43-pulm转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-pulm。再次将验证正确的重组质粒pBSA43-pulm，分别在枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌中成功表达，得到产高稳定性新型普鲁兰酶的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高稳定性新型普鲁兰酶。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之一为：一种新型细菌普鲁兰酶，所述普鲁兰酶，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：2所示；

所述普鲁兰酶的编码基因为pulm，碱基序列如序列表中的SEQ ID No：1所示；

野生型普鲁兰酶的编码基因序列如序列表中的SEQ ID No：3表示，对应的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：4所示。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之二为：将上述基因重新构建重组载体，并在枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的高效表达，得到产高稳定性新型普鲁兰酶酶的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高稳定性新型普鲁兰酶；

用于表达所述的新型细菌普鲁兰酶的宿主细胞为枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，表达载体为pBSA43；

进一步地，所述枯草芽胞杆菌为CGMCC 10787；

进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌为CICC 10079；

进一步地，所述地衣芽孢杆菌为CGMCC 10785。

本发明的实验步骤概述如下：

1、获得新型普鲁兰酶突变体编码基因的过程，包括如下步骤：

(1)将野生型普鲁兰酶基因pul与载体pET-22b(+)连接，构建重组质粒pET-pul，通过易错PCR随机突变野生型普鲁兰酶基因，得到普鲁兰酶突变体编码基因pulm；(2)将含有普鲁兰酶突变体编码基因的质粒pET-pulm保存。

2、一种新型普鲁兰酶，构建表达该新型普鲁兰酶的重组菌株(枯草芽胞杆菌CGMCC10787/pBSA43-pulm)及该新型细菌普鲁兰酶的制备过程，包括如下步骤：

(1)将普鲁兰酶基因pulm，与大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pBSA43连接后，构建重组质粒pBSA43-pulm，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-pulm；

(2)将重组质粒pBSA43-pulm转化入枯草芽胞杆菌CGMCC 10787，构建获得重组菌株CGMCC 10787/pBSA43-pulm；

(3)将重组菌株进行发酵制备高稳定性新型细菌普鲁兰酶；

(4)制备高稳定性新型普鲁兰酶。

2、一种新型普鲁兰酶，构建表达该新型普鲁兰酶的重组菌株(解淀粉芽孢杆菌CICC 10079/pBSA43-pulm)及该新型细菌普鲁兰酶的制备过程，包括如下步骤：

(1)将普鲁兰酶基因pulm，与大肠杆菌-解淀粉芽胞杆菌穿梭质粒pBSA43连接后，构建重组质粒pBSA43-pulm，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-pulm；

(2)将重组质粒pBSA43-pulm转化入解淀粉芽孢杆菌CICC 10079，构建获得重组菌株解淀粉芽孢杆菌CICC 10079/pBSA43-pulm；

(3)将得到的重组菌株经卡那霉素筛选，结合普鲁兰酶的酶活测定，得到产高稳定性普鲁兰酶的重组菌株；

(4)将高产重组菌株进行发酵制备高稳定性新型细菌普鲁兰酶；

(5)制备高稳定性新型普鲁兰酶。

3、一种新型普鲁兰酶，构建表达该新型普鲁兰酶的重组菌株(地衣芽孢杆菌CGMCC10785/pBSA43-pulm)及该新型细菌普鲁兰酶的制备过程，包括如下步骤：(1)将普鲁兰酶基因pulm，与大肠杆菌-地衣芽胞杆菌穿梭质粒pBSA43连接后，构建重组质粒pBSA43-pulm，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-pulm；

(2)将重组质粒pBSA43-pulm转化入地衣芽孢杆菌CGMCC 10785，构建获得重组菌株地衣芽孢杆菌CGMCC 10785/pBSA43-pulm；

(4)将高产菌株进行发酵制备高稳定性新型细菌普鲁兰酶；

(5)制备高稳定性新型普鲁兰酶。

有益效果：

本发明通过易错PCR，经筛选获得一个新型普鲁兰酶突变体，经测序其编码基因为一段新的碱基序列。该序列与野生型基因相比，基因同源性为87％。氨基酸同源性为91.24％。突变酶与野生酶相比，其酶活性提高50％，耐热性和pH耐受能力均比野生酶有所提高。

本发明中通过枯草芽胞杆菌表达新型普鲁兰酶重组菌株、解淀粉芽孢杆菌表达新型普鲁兰酶重组菌株和地衣芽胞杆菌表达新型普鲁兰酶重组菌株发酵后制备的新型重组普鲁兰酶具有如下的优点：以普鲁兰多糖为底物测定新型普鲁兰酶酶学性质时，3种宿主表达的新型普鲁兰酶酶学性质相似，最适反应温度为60℃，最适反应pH为5.0，在60℃以下热稳定性良好，pH3.5-10.0稳定性良好。但三者分泌表达量有所差异。表达量最高的是以解淀粉芽孢杆菌为宿主的工程菌，最高酶活能达到3200U/ml，其次是地衣芽孢杆菌表达宿主，最高酶活能达到3130U/ml；而以枯草芽孢杆菌为宿主的工程菌仅能达到2980U/ml。

附图说明：

图1为本发明新型普鲁兰酶成熟肽基因的PCR扩增电泳图；

其中：M为DNA Marker，1为普鲁兰酶突变体基因pulm；

图2为本发明重组质粒pBSA43-pulm酶切验证图(对应实施例2中步骤2)；

其中：M为DNA Marker，2为重组质粒pBSA43-pulm经EcoR I和Not I双酶切图，1为重组质粒pBSA43-pulm经EcoR I单酶切图；

图3为本发明新型普鲁兰酶最适反应温度测定结果图(对应实施例6中步骤1)；

图4为本发明新型普鲁兰酶最适反应pH测定结果图(对应实施例6中步骤2)；

图5为本发明新型普鲁兰酶耐热性实验测定结果图(对应实施例6中步骤3)；

图6为本发明新型普鲁兰酶pH耐受性实验测定结果图(对应实施例6中步骤4)。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例1：长野解普鲁兰杆菌新型普鲁兰酶成熟肽基因的获得

1、野生型普鲁兰酶成熟肽基因来源于申请人实验室筛选出的长野解普鲁兰杆菌，可通过基因合成或PCR扩增该基因(SEQ ID NO.3所示)。其中长野解普鲁兰杆菌基因组DNA的提取步骤如下：

(1)从甘油管中接种划线于LB固体平板中，37℃静置培养12h；

(2)从培养菌体的平板上挑取一单菌落接种于含5mL液体LB培养基中，于220r/min，37℃条件下培养12h；

(3)将菌液分装到灭菌的1.5mL微量离心管中，12000r/min离心1min收集菌体，弃上清；

(4)将沉淀重悬于200μL预冷的溶液I(OMEGA基因组DNA提取试剂盒)中用枪头反复吹打混匀，并加入50μL的50mg/mL溶菌酶，37℃水浴1h；

(5)加入20μL的10％SDS以及10μL的蛋白酶K，65℃水浴2-3h；

(6)加入250μL新配的溶液II(OMEGA)，盖紧管口，温和地将1.5mL的EP管上下翻转6～8次，使EP管中的菌体充***解；

(7)加入350μL预冷的溶液III(OMEGA)，立即温和地将1.5mL的EP管上下翻转6～8次，此时EP管中会出现白色絮状沉淀；

(8)以12000r/min离心10min，将上清转移到另一EP管中，加等体积的Tris饱和酚/氯仿(1：1)混合溶液，混合均匀后，12000r/min离心10min，再将上清转移到另一EP管中；

(9)反复抽提2次，再用等体积氯仿抽提1次，去除痕量苯酚；

(10)加入2倍体积的无水乙醇，混匀，于-20℃放置30min。12000r/min离心10min收集沉淀；

(11)用70％乙醇洗涤沉淀2～3次，弃去残液；

(12)空气中干燥20-30min，用30μL灭菌的ddH₂O溶解沉淀；

2、通过NCBI基因库查找，根据已报道的长野解普鲁兰杆菌普鲁兰酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的普鲁兰酶成熟肽编码基因的扩增引物如下：

上游引物P1(SEQ ID NO.5)：

5’—CCGGAATTCGATGGGAACACCACAAACATC—3’

下游引物P2(SEQ ID NO.6)：

5’—AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTATTTACCATCAGATGGGCTTAC—3’

上游引物P1和下游引物P2是用来扩增在枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoR I、Not I。

扩增模板为长野解普鲁兰杆菌基因组DNA，其扩增的反应条件为：

扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸3min反应30个循坏；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到2700bp的条带(图1)，用小量DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，并进行双酶切和纯化回收，得到本发明的长野解普鲁兰杆菌新型普鲁兰酶成熟肽编码基因pul。

实施例2：普鲁兰酶基因的突变

1.野生型普鲁兰酶基因与pET-22b(+)载体进行连接。

纯化后的pul与pET-22b(+)载体进行连接，随后将重组质粒化转入大肠杆菌DH 5α中，通过EcoRI和NotI双酶切，成功验证野生型普鲁兰酶基因已克隆至pET-22b(+)载体上构建了重组质粒pET-pul。

2.易错PCR：以上述构建的重组质粒pET-pul为模板，其反应体系如下：

ddH<sub>2</sub>O	21μL
		重组质粒pET-pul(5ng/μL)	1μL
上游引物P1(10μmol/L)	2μL
		下游引物P2(10μmol/L)	2μL
Taq DNA聚合酶	0.5μL
		10×Taq buffer	5μL
dATP(10mmol/L)	1μL
		dGTP(10mmol/L)	1μL
dTTP(10mmol/L)	5μL
		dCTP(10mmol/L)	5μL
MgCl<sub>2</sub>(25mmol/L)	10μL
		MnCl<sub>2</sub>(10mmol/L)	1.25μL

体系构建完成后，进行易错PCR反应，程序设置如下：

a.预变性:95℃5min；

b.变性：95℃30s；

c.退火：70℃45s；

d.延伸：72℃90s；

e.b-d反应35个循环；

f.延伸:72℃10min。

PCR反应结束后，将PCR产物与载体质粒进行EcoRI和NotI双酶切，经过纯化回收，易错PCR产物与同样经过双酶切的载体质粒pET-22b(+)进行连接，通过化转至E.coli BL21(DE3)中，涂布于含Amp^r(100μg/mL)的LB的固体平板中，37℃培养箱静置培养12h，得到转化子。

3.突变体文库的筛选：在96孔板中每个孔中加入200μL含Amp^r(100μg/mL)的LB液体培养基，随后，用灭过菌的牙签挑取每一个转化子的单克隆至96孔板中，挑取过程中尽可能使得每次都刚好沾到少量的菌。将96孔板转移至摇床培养，160r/min，37℃培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8，此时加入IPTG，至终浓度为0.5mM，随后进行低温诱导，16℃，160r/min培养16h。经过4000r/min离心10min(4℃下)，取50μL离心上清进行酶活检测，检测出具有酶活的突变体。

4.酶活检测方法：1mL适当稀释后的酶液加1mL 0.5％的普鲁兰糖溶液(pH4.5)于试管中，60℃保温30分钟，立即加入DNS试剂3mL，在沸水中煮沸7分钟，冷却后加蒸馏水10mL混匀，以煮沸5分钟的灭活酶液加1mL 0.5％的普鲁兰糖反应30分钟做对照，按标准曲线时同样的操作测定光密度值(OD₅₅₀)。酶活的测定为三次平行实验，结果取平均值。

在上述条件下，每分钟产生相当于1μmol葡萄糖还原力的酶活力为一个酶活单位。

酶活力的计算：酶活(U/mL)＝OD×K值÷30÷180×n

式中：

OD----样品与空白光密度值之差；

180---葡萄糖的分子量；

K-----标准曲线的斜率；

30-----酶反应时间；

n------酶液稀释倍数。

经过上述步骤的易错PCR文库构建及筛选，最终获得本发明突变酶，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：2所示；碱基序列如序列表中的SEQ ID No：1所示；经测序结果比对，该序列与野生型基因相比，基因同源性为87％，氨基酸同源性为91.24％，且酶活较野生型提高50％。

5.突变体酶学特性测定

对本发明所述突变体进行酶活重复实验后，对其进行酶学性质的测定。

(1)新型普鲁兰酶最适反应温度测定

取普鲁兰酶成品(9360U/mL)，于不同温度下测定酶活力。由图3确定其最适反应温度为60℃。

(2)新型普鲁兰酶最适反应pH测定

取普鲁兰酶成品(9360U/mL)，用不同pH的乙酸-乙酸钠缓冲液(分别配制0.2mol/L乙酸和乙酸钠溶液，取两种溶液适量调配至所需pH)稀释至相应倍数，底物用相应的pH缓冲液配制，测定酶活力，由图4确定其最适反应pH为5.0。

(3)新型普鲁兰酶耐热性实验

取普鲁兰酶成品(9360U/mL)，将样品稀释2倍，吸取2mL稀释好的酶液于不同试管中，分别置于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的水浴锅中，准确保温2h,迅速取出于冰水浴中冷却，冷却后用pH4.5缓冲液继续稀释至相应倍数，测定酶活力，由图5确定其在60℃以下热稳定性良好。

(4)新型普鲁兰酶pH耐受性实验

取普鲁兰酶成品(9360U/mL)，用不同pH的乙酸-乙酸钠缓冲液(分别配制0.2mol/L乙酸和乙酸钠溶液，取两种溶液适量调配至所需pH)稀释25倍，于室温下放置24h，摇匀继续用pH4.5缓冲液稀释至相应倍数，测定酶活力，由图6确定其在pH3.5-10.0稳定性良好。

实施例3：枯草芽胞杆菌高稳定性新型普鲁兰酶重组菌的构建

1、表达载体pBSA43的构建

pBSA43是以大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽胞杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Amp^r基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有Km^r基因，可以在枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。

2、新型普鲁兰酶表达载体pBSA43-pulm的构建

将经PCR扩增并经EcoR I和Not I双酶切后回收的新型普鲁兰酶基因(pulm)与同样双酶切的枯草芽胞杆菌表达载体pBSA43用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取转化子质粒，并进行单、双酶切验证(图2)和测序，确定构建获得正确的重组菌株JM109/pBSA43-pulm。

3、重组表达载体pBSA43-pulm转化枯草芽胞杆菌

将1μL(50ng/μL)的pBSA43-pulm重组质粒加入到50μL的枯草芽胞杆菌CGMCC10787感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25uF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证，确定获得枯草芽胞杆菌重组菌株CGMCC10787/pBSA43-pulm。

实施例4：解淀粉芽孢杆菌高稳定性新型普鲁兰酶表达重组菌的构建

1、新型普鲁兰酶表达载体pBSA43-pulm的构建

将经PCR扩增并经EcoR I和Not I双酶切后回收的新型普鲁兰酶基因(pulm)与同样双酶切的解淀粉芽孢杆菌表达载体pBSA43用连接酶进行连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子；提取阳性转化子质粒，经37℃摇管培养后抽提质粒，并进行单、双酶切初步验证，并将酶切验证正确的重组质粒命名为pBSA43-pulm；将酶切验证正确的阳性克隆送至北京华大基因科技股份有限公司测序，以进一步确保目的基因的正确性，最终确定构建获得正确的重组菌株JM109/pBSA43-pulm。

2、重组表达载体pBSA43-pulm转化解淀粉芽孢杆菌

将1μL(50ng/μL)的pBSA43-pulm重组质粒加入到50μL的解淀粉芽孢杆菌CICC10079感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25uF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证，确定获得解淀粉芽胞杆菌重组菌株CICC 10079/pBSA43-pulm。

实施例5：地衣芽孢杆菌高稳定性新型普鲁兰酶表达重组菌的构建

1、新型普鲁兰酶表达载体pBSA43-pulm的构建

2、重组表达载体pBSA43-pulm转化地衣芽胞杆菌

将1μL(50ng/μL)的pBSA43-pulm重组质粒加入到50μL的地衣芽胞杆菌CGMCC10785感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25uF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证，确定获得地衣芽胞杆菌重组菌株CGMCC 10785/pBSA43-pulm。

实施例6：新型普鲁兰酶在枯草芽胞杆菌重组菌株中的表达及制备

将实施例3所得的枯草芽胞杆菌重组菌株CGMCC 10787/pBSA43-pulm接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，即可制备获得高稳定性新型普鲁兰酶粗酶液，以普鲁兰多糖为底物测定新型普鲁兰酶粗酶液酶活力(pH4.5、60℃条件下)，枯草芽胞杆菌表达新型普鲁兰酶重组菌株发酵后普鲁兰酶发酵液酶活可达到2980U/mL，然后采用絮凝半框过滤，超滤浓缩得到超滤液，喷雾干燥制得新型普鲁兰酶酶制剂。

实施例7：新型普鲁兰酶在解淀粉芽孢杆菌表达重组菌株中的表达及制备

将实施例4所得的解淀粉芽孢杆菌重组菌株CICC 10079/pBSA43-pulm接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，即可制备获得高稳定性新型普鲁兰酶粗酶液，以普鲁兰多糖为底物测定新型普鲁兰酶粗酶液酶活力(pH4.5、60℃条件下)，解淀粉芽胞杆菌表达新型普鲁兰酶重组菌株发酵后普鲁兰酶发酵液酶活可达到3200U/mL，然后采用絮凝半框过滤，超滤浓缩得到超滤液，喷雾干燥制得新型普鲁兰酶酶制剂。

实施例8：新型普鲁兰酶在地衣芽孢杆菌表达重组菌株中的表达及制备

将实施例5所得的地衣芽孢杆菌重组菌株地衣芽孢杆菌CGMCC 10785/pBSA43-pulm接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，即可制备获得高稳定性新型普鲁兰酶粗酶液，以普鲁兰多糖为底物测定新型普鲁兰酶粗酶液酶活力(pH4.5、60℃条件下)，地衣芽胞杆菌表达新型普鲁兰酶重组菌株发酵后普鲁兰酶发酵液酶活可达到3130U/mL，然后采用絮凝半框过滤，超滤浓缩得到超滤液，喷雾干燥制得新型普鲁兰酶酶制剂。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 山东隆科特酶制剂有限公司

天津科技大学

<120> 一种新型普鲁兰酶及其基因、工程菌和制备方法

<130> 1

<141> 2018-10-11

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2787

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gatgggaaca ccacaaacat cattgtccac tattttcgtc ctgctggtga ttatcaaccc 60

tggagtttat ggatgtggcc aaagggcggg gacggggctg aatatgattt taatcaacag 120

tctgattcct atggtgcggt tgcaagtgca gatattcctg gaagcccaag tcaggtagga 180

attatcgttc gcactcagga ttggaccaaa gatgtgagtg ttgaccgcta catagattta 240

agcaaaggac atgaggtatg gcttgtccaa ggaaacagcc aaattttcta caatgaaaag 300

gatgctgaga ccgccgcaca acccgctgtc agcaacgcat atttagatgc ttcaaatcaa 360

ctgctggtta agcttagcca gacgttaaca cttggggaag gcgcaagcgg ctttacggtt 420

catgacgaca cagcaaataa ggatattccg gtgacatctg tgtcggattc cagtacaggc 480

caagatgtaa ccgctgtttt agcaggtacc ttccaacata tttttggagg ctccgattgg 540

gcacctgata atcacagtac tttattaaaa aaggtgacta acaatctcta tcaatttaca 600

ggagatcttc ctgaaggaaa ctaccaatat aaagtggctt taaatgatag ctggaataat 660

ccaagttacc catcggacaa cattaattta gcagtccctg ctggtggcgc acacgtcact 720

ttttcgtata ttccgtccac tcatgcagtc tatgatacga ttaataatcc taatgcggat 780

ttacaagtag atgacagtgg gctcaaaaca gatctcgtga cggttactct aggggaagat 840

cccgatgtaa gccataccct atccattcaa acagagggat atcaggcaaa gcaggtcata 900

cctcgtaatg tgcttgactc atcacagtac tattattcag gagatgatct tgggaatacc 960

tataccaaaa aggcaactac ctttaaggtt tgggcaccta catccactca agtgaatgtt 1020

cttctttata acagtgcaac tggcgccgta acaaaaacgg ttccgatggc agcatccagt 1080

aatggtgttt ggaaagcaac agtcaaccaa gatcttgaaa attggtatta catgtatgag 1140

gtaacaggcc agggctctac tcgaaccgct gttgatcctt atgcaactgc gattgcacca 1200

aatggaacaa gaggtatgat tgtggaccta tctaaaacca atccggccgg ctgggagagt 1260

gacacacata ttacaccaaa gaatatagag gatgaagtca tttatgagat gcatattcgt 1320

gacttctcca ttgattctaa ttcgggtatg aataataaag ggaagtactt agctcttacc 1380

gaaaaaggaa caaagggtcc tgataatgta aaaacaggtg tggactcgtt aaaacagctc 1440

ggtattaccc atgttcagct tcagcctgtc tttggattta acagcgtgga tgagacagat 1500

ccaacccaat ataactgggg ctatgatccg cgcaactata atgttcctga gggtcagtat 1560

gcgactaatg caaatgggac aactcgaatt aaagagttta aggaaatggt tctttcactc 1620

catcgcgacc acattggggt taatatggat gttgtttata atcatacctt tgctacgcaa 1680

atctctgact ttgataagat tgtgccggaa tattactacc gcacagatga tgcaggtaac 1740

tacaccaacg gctcgggtac aggtaacgaa attgctgctg aaaagccaat ggtacaaaaa 1800

tttattattg attcacttaa gttctgggtc aatgagtatc atattgacgg cttccgtttt 1860

gacttaatgg cgctacttgg aaaagacaca atgtctaaag cctccgagca gcttcacgag 1920

atcgatccag gaatagcact ctacggcgaa ccatggacag gtggaacttc tgcacttcca 1980

actgaccagc ttttaacaaa aggggctcaa aagggtttgg gagtggccgt atttaatgac 2040

aatttacgaa atgcattgga cggcagtgtc tttgattctt cagctcaagg ctttgcaaca 2100

ggtgccacag gtttaacgga tgctattaaa aatggtgttg aagggagtat taatgacttt 2160

acctcttcac caggcgagac gattaactac gttacaagtc atgataacta taccctctgg 2220

gacaagattg cccaaagcaa tccaaacgat tctgaagccg atcgaatcaa aatggatgag 2280

ctcgctcaag cagtcgtcat gacctcgcaa ggagttccat tcatgcaggg cggagaagaa 2340

atgctccgta caaaaggtgg caacgacaat agctataatg caggagatgc agtgaatgag 2400

tttgattgga gccgaaaagc tcaataccca gatgttttca actattatag cgggctgatc 2460

catcttcgtc ttgatcaccc agccttccgc atgacaacag ctaacgaaat caatagccac 2520

ctccaatttt tagatagccc tgataataca gtggcatatg aaatatcaaa tcatgcgaat 2580

aaagacatat ggggaaatat cattgttgtc tataacccaa ataaaactgc agcaaccctt 2640

aatttgccga gcgggaaatg ggcgattaat gccactaccg ggaaaattgg agaatccacc 2700

cttggtcaag cagaggggag tgtccaagtc ccaggcatat caatgatgat ccttcatcaa 2760

gaagtaagcc catctgatgg taaatag 2787

<210> 2

<211> 928

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Asp Gly Asn Thr Thr Asn Ile Ile Val His Tyr Phe Arg Pro Ala Gly

1 5 10 15

Asp Tyr Gln Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Gly Gly Asp Gly

20 25 30

Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Gln Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Val Ala

35 40 45

Ser Ala Asp Ile Pro Gly Ser Pro Ser Gln Val Gly Ile Ile Val Arg

50 55 60

Thr Gln Asp Trp Thr Lys Asp Val Ser Val Asp Arg Tyr Ile Asp Leu

65 70 75 80

Ser Lys Gly His Glu Val Trp Leu Val Gln Gly Asn Ser Gln Ile Phe

85 90 95

Tyr Asn Glu Lys Asp Ala Glu Thr Ala Ala Gln Pro Ala Val Ser Asn

100 105 110

Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln Leu Leu Val Lys Leu Ser Gln Thr

115 120 125

Leu Thr Leu Gly Glu Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr

130 135 140

Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Ser Asp Ser Ser Thr Gly

145 150 155 160

Gln Asp Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly

165 170 175

Gly Ser Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Val

180 185 190

Thr Asn Asn Leu Tyr Gln Phe Thr Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn Tyr

195 200 205

Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro

210 215 220

Ser Asp Asn Ile Asn Leu Ala Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr

225 230 235 240

Phe Ser Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn

245 250 255

Pro Asn Ala Asp Leu Gln Val Asp Asp Ser Gly Leu Lys Thr Asp Leu

260 265 270

Val Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser

275 280 285

Ile Gln Thr Glu Gly Tyr Gln Ala Lys Gln Val Ile Pro Arg Asn Val

290 295 300

Leu Asp Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr

305 310 315 320

Tyr Thr Lys Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr

325 330 335

Gln Val Asn Val Leu Leu Tyr Asn Ser Ala Thr Gly Ala Val Thr Lys

340 345 350

Thr Val Pro Met Ala Ala Ser Ser Asn Gly Val Trp Lys Ala Thr Val

355 360 365

Asn Gln Asp Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln

370 375 380

Gly Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro

385 390 395 400

Asn Gly Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ser Lys Thr Asn Pro Ala

405 410 415

Gly Trp Glu Ser Asp Thr His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu

420 425 430

Val Ile Tyr Glu Met His Ile Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ser Asn Ser

435 440 445

Gly Met Asn Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr

450 455 460

Lys Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Val Asp Ser Leu Lys Gln Leu

465 470 475 480

Gly Ile Thr His Val Gln Leu Gln Pro Val Phe Gly Phe Asn Ser Val

485 490 495

Asp Glu Thr Asp Pro Thr Gln Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn

500 505 510

Tyr Asn Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Thr Thr

515 520 525

Arg Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Asp His

530 535 540

Ile Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln

545 550 555 560

Ile Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp

565 570 575

Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala

580 585 590

Ala Glu Lys Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Phe

595 600 605

Trp Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala

610 615 620

Leu Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ser Glu Gln Leu His Glu

625 630 635 640

Ile Asp Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr

645 650 655

Ser Ala Leu Pro Thr Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly

660 665 670

Leu Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly

675 680 685

Ser Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly

690 695 700

Leu Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe

705 710 715 720

Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn

725 730 735

Tyr Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Gln Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu

740 745 750

Ala Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr

755 760 765

Ser Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr

770 775 780

Lys Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val Asn Glu

785 790 795 800

Phe Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr

805 810 815

Ser Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr

820 825 830

Thr Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asp Ser Pro Asp

835 840 845

Asn Thr Val Ala Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Lys Asp Ile Trp

850 855 860

Gly Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Ala Thr Leu

865 870 875 880

Asn Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Thr Gly Lys Ile

885 890 895

Gly Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly

900 905 910

Ile Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Ser Asp Gly Lys

915 920 925

<210> 3

<211> 2781

<212> DNA

<213> 长野解普鲁兰杆菌()

<400> 3

gatgggaaca ccacaaacat cgtagtccat tattttcgtc ctagtgggga ttatacggat 60

tggaatcttt ggatgtggcc ggagaacggt gatggggctg agtatgattt taatcaaccg 120

actgattctt atggggaggt tgcaagtgtg gacattcctg gaaacccaag tcaagtaggg 180

attattgtcc gtaaaggaaa ttgggatgcg aaagacattg atagtgaccg ctacatcgat 240

ttaagcaaag ggcatgagat ttggctcgtc caaggaaaca gccagatttt ctatagtgaa 300

aaggatgctg aggcagccgc acaacctgct gtaagtaacg cttatttaga tgcttccaac 360

caagtgttgg tcaagcttag ccagccgttt actcttggtg aaggttcaag cggttttacg 420

gttcatgatg acacagcaaa taaggatatt ccagttacat ctgttagtga tgccaatcag 480

gtaacggctg ttttagcagg tactttccag catatttttg gggggagtga ttgggcaccg 540

gataatcaca atactttact aaaaaaggtg aatagcaatc tctatcaatt ttcaggaaat 600

cttcctgaag gaaactacca atataaagtg gctttaaatg atagctggaa taatccgagc 660

tacccatctg ataacattaa tttgacagtg ccagctggtg gtgcccatgt tacattttct 720

tatataccat ccacccatgc tgtttatgac acgattaaca atcctaatgc ggatttacaa 780

gtagatagca gcggtgttaa gacggatctc gtggcggtta ctcttggaga aaatcctgat 840

gtaagccata ccctgtccat tcaaacagag gactatcagg caggacaggt catacctcgt 900

aaggtgcttg attcatccca gtactactat tccggagatg atctcgggaa tacctataca 960

aagaatgcaa ctacctttaa ggtctgggcg cctacatcca ctcaagtaaa tgtccttctt 1020

tataatagtg caaccggcgc ggtaactaaa acggttccaa tgaccgcatc aggccatggt 1080

gtatgggaag caacagtcaa ccaagacctt gaaaattggt attacatgta tgaggtaaca 1140

ggacaaggct caacccgaac ggctgttgat ccgtatgcaa cagctattgc accaaacgga 1200

acgagaggca tgattgtgga cctagccaaa acagacccgg ccggatggga gagtgacaaa 1260

catattacgc caaagaatat agaagatgaa gtcatctatg aaatggatgt tcgtgacttt 1320

tccatcgact ctaattcggg tatgaaaaat aaaggaaagt atttggcact tacagaaaaa 1380

ggaactaaag gccctgacaa tgtaaagaca ggggtagatt ccttaaaaca acttgggatt 1440

actcatgttc agctgcagcc tgttttcgca tttaatagtg tcaatgaaaa cgatccaact 1500

caatataatt ggggttatga ccctcgcaac tacaatgttc ctgagggaca atatgctact 1560

aatgcaaacg gaacaactcg gattaaagag tttaaggaaa tggttctttc actccatcag 1620

gaccacattg gggttaatat ggatgttgtt tataatcata cctttgccac gcaaatctct 1680

gacttcgata agattgtgcc agaatattac taccgcacgg atgatgctgg taactacact 1740

aacggctcag gtactggaaa cgaaatcgca gccgaaagac caatggttca aaaatttatt 1800

atcgattcac ttaagttttg ggtcaatgag taccacgttg acggtttccg ttttgactta 1860

atggcgttgc ttggaaaaga tacaatgtct aaagctgcca cgcagcttca tgccattgat 1920

ccaggaattg ctctctacgg tgagccatgg acaggaggaa catccgcgct gccagccgat 1980

cagcttttaa caaaaggagc tcaaaaaggc atgggagtgg ctgtatttaa tgacaatctg 2040

cgaaacggtt tggacggcag tgtctttgat tcatctgctc aaggttttgc gacaggtgct 2100

actggtttaa cggatgctat taaaaatgga gttgaaggaa gtattaatga cttcaccgct 2160

tcaccaggcg agacgatcaa ctatgtcaca agtcatgata actataccct ttgggacaag 2220

attgcccaaa gcaatccaaa cgattctgaa gcggatcgaa ttaaaatgga tgagctcgct 2280

caagcgatcg tcatgacctc acaaggcatt cctttcatgc agggcgggga agaaatgctt 2340

cgtacgaaag gcggcaacga caatagctat aatgctggtg atgtagtgaa cgagtttgat 2400

tggagcagaa aagctcaata tccagatgtt ttcaattatt atagcgggct gattcatctt 2460

cgtcttgatc acccagcctt ccgcatgacg acagctaatg aaatcaatag ccacctccaa 2520

ttcctaaata gcccagagaa cacagtggcc tatgaattat ctgatcatgc aaataaagat 2580

acatggggta atattgtggt tatttataat ccaaataaaa cggcagaaac cattaatttg 2640

ccaagcggga aatgggaaat caatgcgacg agcggtaagg tgggagaatc cacacttggt 2700

caagcagagg gcagtgttca agttccaggc atatctatga tgattcttca tcaagaagta 2760

agcccatctg atggtaaata g 2781

<210> 4

<211> 926

<212> PRT

<213> 长野解普鲁兰杆菌()

<400> 4

Asp Gly Asn Thr Thr Asn Ile Val Val His Tyr Phe Arg Pro Ser Gly

1 5 10 15

Asp Tyr Thr Asp Trp Asn Leu Trp Met Trp Pro Glu Asn Gly Asp Gly

20 25 30

Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Thr Asp Ser Tyr Gly Glu Val Ala

35 40 45

Ser Val Asp Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gln Val Gly Ile Ile Val Arg

50 55 60

Lys Gly Asn Trp Asp Ala Lys Asp Ile Asp Ser Asp Arg Tyr Ile Asp

65 70 75 80

Leu Ser Lys Gly His Glu Ile Trp Leu Val Gln Gly Asn Ser Gln Ile

85 90 95

Phe Tyr Ser Glu Lys Asp Ala Glu Ala Ala Ala Gln Pro Ala Val Ser

100 105 110

Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln

115 120 125

Pro Phe Thr Leu Gly Glu Gly Ser Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp

130 135 140

Thr Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Ser Asp Ala Asn Gln

145 150 155 160

Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly Gly Ser

165 170 175

Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Asn Thr Leu Leu Lys Lys Val Asn Ser

180 185 190

Asn Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asn Leu Pro Glu Gly Asn Tyr Gln Tyr

195 200 205

Lys Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro Ser Asp

210 215 220

Asn Ile Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr Phe Ser

225 230 235 240

Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn Pro Asn

245 250 255

Ala Asp Leu Gln Val Asp Ser Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu Val Ala

260 265 270

Val Thr Leu Gly Glu Asn Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser Ile Gln

275 280 285

Thr Glu Asp Tyr Gln Ala Gly Gln Val Ile Pro Arg Lys Val Leu Asp

290 295 300

Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr Thr

305 310 315 320

Lys Asn Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln Val

325 330 335

Asn Val Leu Leu Tyr Asn Ser Ala Thr Gly Ala Val Thr Lys Thr Val

340 345 350

Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn Gln

355 360 365

Asp Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly Ser

370 375 380

Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn Gly

385 390 395 400

Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly Trp

405 410 415

Glu Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val Ile

420 425 430

Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ser Asn Ser Gly Met

435 440 445

Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys Gly

450 455 460

Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Val Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly Ile

465 470 475 480

Thr His Val Gln Leu Gln Pro Val Phe Ala Phe Asn Ser Val Asn Glu

485 490 495

Asn Asp Pro Thr Gln Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asn

500 505 510

Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Thr Thr Arg Ile

515 520 525

Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Gln Asp His Ile Gly

530 535 540

Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile Ser

545 550 555 560

Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp Ala

565 570 575

Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala Glu

580 585 590

Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Phe Trp Val

595 600 605

Asn Glu Tyr His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu

610 615 620

Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Thr Gln Leu His Ala Ile Asp

625 630 635 640

Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Ala

645 650 655

Leu Pro Ala Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met Gly

660 665 670

Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Gly Leu Asp Gly Ser Val

675 680 685

Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr

690 695 700

Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr Ala

705 710 715 720

Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr Thr

725 730 735

Leu Trp Asp Lys Ile Ala Gln Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala Asp

740 745 750

Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Ile Val Met Thr Ser Gln

755 760 765

Gly Ile Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys Gly

770 775 780

Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Val Val Asn Glu Phe Asp

785 790 795 800

Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser Gly

805 810 815

Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala

820 825 830

Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn Thr

835 840 845

Val Ala Tyr Glu Leu Ser Asp His Ala Asn Lys Asp Thr Trp Gly Asn

850 855 860

Ile Val Val Ile Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Glu Thr Ile Asn Leu

865 870 875 880

Pro Ser Gly Lys Trp Glu Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly Glu

885 890 895

Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile Ser

900 905 910

Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Ser Asp Gly Lys

915 920 925

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ccggaattcg atgggaacac cacaaacatc 30

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

aaggaaaaaa gcggccgcct atttaccatc agatgggctt ac 42

Claims

1.一种新型细菌普鲁兰酶，其特征在于，所述细菌普鲁兰酶的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：2所示。

2.根据权利要求1所述的一种新型细菌普鲁兰酶，其特征在于，编码所述细菌普鲁兰酶的基因为pulm，其碱基序列如序列表SEQ ID No：1所示。

3.根据权利要求1所述的一种新型细菌普鲁兰酶，其特征在于，所述细菌普鲁兰酶的制备方法包括如下步骤：

(1)将权利要求2所述的基因进行酶切，与表达载体连接得到了新的重组载体；

(2)将重组载体转化入宿主细胞中，得到重组菌株，之后将重组菌株发酵，得到高稳定性细菌普鲁兰酶。

4.包含权利要求2所述的新型普鲁兰酶基因的载体以及工程菌。

5.如权利要求4所述的含有新型普鲁兰酶基因的载体以及工程菌，其特征在于，克隆载体为pBSA43载体、表达载体为pBSA43、宿主细胞为枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌。

6.如权利要求5所述的含有新型普鲁兰酶基因的载体以及工程菌，其特征在于：

所述枯草芽胞杆菌为CGMCC 10787；

所述解淀粉芽孢杆菌为CICC 10079；

所述地衣芽孢杆菌为CGMCC 10785。

7.根据权利要求1所述的一种新型细菌普鲁兰酶在食品加工、医药工业方面的应用。

8.如权利要求4所述载体以及工程菌的应用。