CN105524903B - 一种β-葡萄糖苷酶改良突变体E168Q及其编码基因和应用 - Google Patents

一种β-葡萄糖苷酶改良突变体E168Q及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地，本发明涉及一种β‑葡萄糖苷酶改良突变体E168Q及其编码基因和应用。本发明以来源于嗜热真菌篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802的高温酸性β‑葡萄糖苷酶BGL3A为母本，采用分子生物学技术对β‑葡萄糖苷酶序列进行定点突变后表达。在此改造条件下，突变体的对纤维二糖的亲和力比野生型(突变前)提高2.0倍，催化效率提高1.5倍，且最适反应pH值和温度不变。利用此策略可以大大提高β‑葡萄糖苷酶的催化效率，为其在食品、生物乙醇等工业生产领域提供了应用基础。此策略对β‑葡萄糖苷酶及其它酶的催化效率提高具有重要的指导意义。

Description

一种β-葡萄糖苷酶改良突变体E168Q及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地，本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶改良突变体E168Q及其编码基因和应用。
背景技术
纤维素是自然界中数量最庞大的可再生资源，它的降解不仅构成了自然界碳循环的一个重要环节，而且为生物燃料的生产提供了一个潜在的应用空间。然而,由于木质纤维素结构特殊，由此形成的抗生物降解屏障使其转化加工过程的成本居高不下,构成了利用纤维素材料生产生物能源的最大瓶颈。自然界中存在三种协同降解纤维素的酶：内切葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)。其中内切葡聚糖酶主要作用于纤维素的非结晶区，随机水解纤维素链中的糖苷键，产生大量不同聚合度的纤维素短链；外切酶(纤维二糖水解酶)可以从纤维素链的还原端(CBHⅠ)或非还原端(CBHⅡ)开始持续水解单根纤维素糖链,释放纤维二糖并由此破坏纤维素的结晶区；β-葡萄糖苷酶则主要水解纤维二糖和可溶性纤维寡糖,最终将纤维素转化为可利用的葡萄糖。
酶分子改良目的性强，针对酶分子具体结构分析进行改造，从而达到提升酶的酶学性质的目的，可用于获取高活性的基因工程突变体。本发明的高温酸性β-葡萄糖苷酶可较好地满足生物质转化、工业生产和饲用酶制剂的应用需求，且其高表达量和高催化效率可大大降低生产成本，具有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供了一种高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体E168Q。
本发明的再一目的是提供编码上述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体E168Q的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明以来源于嗜热真菌篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802的酸性β-葡萄糖苷酶为母本，采用分子生物学技术对酸性β-葡萄糖苷酶序列进行区域替换后表达。
根据本发明的高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体E168Q，是β-葡萄糖苷酶的催化活性通道loop区域替换后得到的突变体，即β-葡萄糖苷酶的168位氨基酸由谷氨酸“E”突变为谷氨酰胺“Q”
所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
YGFGGSGWDAAYGRAKAALNKLNQTEKVGIVTGVKWMGGPCVGNTYKPSSIDYPSLCLQDSPLGVRFANPVTAFPAGINAGATWDRSLINARGAAMGAEAKGLGVNVQLGPVAGPLGKNPNSGRIWEGFSNDPYLSGVAMEETIAGMQGSGVQACAKHYIGNEQEHNRQTISSNIDDRTLHELYVWPFMNAVKANVASVMCSYNEVNGSWSCENDALLNGLLKTELGFPGYIMSDWNAQHTTVNSANSGLDMTMPGSDFNNPPGSIYWGPNLEAAVANGSVPQSRLDDMVTRILASWYLVGQDEGYPPVAFSSWNGGKANVDVTGDHKSVVRAVARDSIVLLKNDNNALPLRKPKSLAIIGQDATVNPAGPNACSDRGCDTGTLAMGWGSGTAQFPYIVGPLDAIQSQAAADGTNITTSTTDDTTAAASAAASAGTAIVFINSDSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNELVQAVAAVNKNVIVVVHSVGPVILEAILAQPNVKAIVWPGLPGQESGNALVDVLYGSTSPSGKLPYTIAKQFSDYGTTWTTSLVDDFTEGLFIDYRHFDENNITPRYEFGYGLSYTTFKYSDLDVNVQARPGAAEGPIVPGGVKELFDTVGTVTVTVQNSGKVAGAEVAQLYIGLPDSAPSTPPKQLRGFQKLHLAPGQREGATFELTRRDISYWDVQQQKWVVPSGTFKVYVGSSSRDIREQGSFRI
所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
TATGGCTTCGGCGGCTCTGGCTGGGACGCCGCTTATGGCAGAGCAAAGGCTGCGCTGAACAAGCTCAACCAGACCGAGAAGGTTGGTATCGTCACCGGTGTCAAGTGGATGGGCGGCCCTTGTGTTGGCAACACCTACAAGCCCAGTTCGATTGACTACCCTTCTCTGTGTTTGCAAGACTCTCCTCTCGGGGTGCGTTTTGCCAACCCTGTGACTGCCTTCCCGGCTGGTATCAACGCCGGCGCCACATGGGATAGATCTCTCATCAACGCCCGTGGTGCGGCCATGGGCGCTGAGGCCAAGGGCCTCGGTGTGAACGTCCAGCTTGGCCCCGTCGCTGGTCCTCTCGGCAAGAATCCCAATAGTGGCAGAATCTGGGAAGGGTTCTCGAATGATCCCTATCTCAGCGGTGTTGCGATGGAGGAAACCATCGCCGGAATGCAAGGATCTGGTGTGCAGGCCTGCGCCAAGCACTATATTGGTAACGAGCAAGAGCACAACCGTCAAACCATCAGCTCCAACATCGATGACCGCACTCTGCACGAGCTCTACGTCTGGCCGTTCATGAACGCCGTCAAGGCCAACGTCGCCTCCGTCATGTGCTCGTACAACGAGGTCAATGGTTCCTGGTCCTGTGAGAATGATGCTCTTCTCAACGGTCTGTTGAAGACTGAGCTCGGATTCCCCGGATACATCATGAGCGATTGGAACGCGCAGCACACCACGGTCAACAGCGCCAACTCGGGTCTCGATATGACCATGCCTGGCAGTGACTTCAACAACCCTCCTGGCAGCATCTACTGGGGGCCCAACCTCGAAGCCGCCGTCGCCAATGGCTCCGTTCCGCAGTCCCGTTTGGACGACATGGTCACTCGTATCCTTGCGTCTTGGTACTTGGTTGGCCAGGATGAGGGCTACCCACCGGTCGCCTTCAGCTCCTGGAATGGCGGCAAGGCCAATGTTGACGTGACGGGCGATCACAAGAGCGTCGTCAGAGCTGTGGCTCGTGACTCTATCGTTCTTCTGAAGAACGACAATAACGCTTTGCCTCTGCGCAAGCCCAAGAGCCTCGCGATCATCGGCCAGGATGCAACTGTCAACCCTGCCGGGCCCAACGCTTGCTCTGATCGCGGCTGCGACACCGGTACTCTCGCCATGGGTTGGGGCAGTGGTACCGCTCAGTTCCCATACATCGTCGGCCCTCTCGATGCTATCCAGTCTCAGGCTGCCGCTGATGGCACTAACATCACCACCAGCACGACCGATGATACCACCGCGGCAGCTTCTGCAGCCGCCTCCGCCGGAACCGCCATCGTCTTCATCAACTCCGACTCTGGTGAAGGTTACATCACCGTCGAGGGCAACGCTGGTGACCGCAACAACCTCGACCCCTGGCACAACGGCAACGAGCTCGTCCAGGCCGTTGCGGCTGTGAACAAGAATGTCATTGTCGTTGTCCACAGCGTCGGTCCCGTGATCTTGGAGGCTATCCTTGCACAGCCCAACGTCAAGGCCATTGTGTGGCCCGGTCTCCCTGGACAAGAGAGCGGCAATGCCCTGGTCGATGTTCTGTACGGCTCCACCTCCCCCAGCGGCAAGTTGCCCTATACCATTGCCAAGCAGTTCAGCGACTATGGCACCACCTGGACGACCTCCCTGGTCGATGACTTCACCGAGGGTCTGTTCATTGACTACCGCCACTTTGACGAGAACAACATTACTCCCAGATACGAGTTCGGATACGGCTTGTCTTACACCACCTTCAAATACTCCGACCTGGACGTCAACGTCCAGGCCCGCCCCGGCGCAGCCGAAGGCCCCATCGTCCCCGGCGGCGTCAAGGAACTTTTCGACACCGTCGGCACCGTCACCGTCACCGTCCAGAACAGCGGCAAGGTTGCCGGCGCGGAAGTTGCCCAGCTGTACATCGGCCTTCCCGACTCTGCCCCGTCGACCCCTCCCAAGCAGCTCAGAGGATTCCAGAAGTTGCACCTCGCGCCCGGCCAGAGAGAGGGCGCCACTTTCGAACTCACCCGCCGAGACATCAGCTACTGGGACGTTCAGCAGCAGAAGTGGGTTGTTCCTAGCGGTACGTTCAAGGTCTATGTTGGAAGCTCGAGCAGGGACATTAGGGAGCAGGGATCTTTCCGTATTTGA
本发明还是提供一种制备高催化效率β-葡萄糖苷酶的方法：
1)采用over-lap PCR的方法扩增高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因序列；
2)将催化效率β-葡萄糖苷酶突变体序列片段克隆到表达载体pPIC 9r上，重组载体命名pPIC9r-A-E168Q；
3)将突变体重组载体转化毕赤酵母GS115，诱导表达，获得突变株，优选为GS115/A-E168Q。
本发明还提供了包含上述β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体，优选为pPIC9r-A-E168Q。将本发明的β-葡萄糖苷酶突变体基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-葡萄糖苷酶基因***到质粒pPIC9r上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9r-A-E168Q。
本发明还提供了包含上述β-葡萄糖苷酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/A-E168Q。
本发明还提供了上述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的应用，例如在果蔬汁工业中的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在食品工业中应用新的β-葡萄糖苷酶。本发明的重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体最适pH为4.5，最适温度为75℃，与野生型的一致，但是亲和力比野生型提高2.0倍，催化效率提高1.4倍。
附图说明
图1：高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体与野生型的最适pH。
图2：高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体与野生型的最适温度。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：表达宿主Pichiapastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r为本实验室保存。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，纤维二糖购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0
(2)YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖
(3)MD固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin
(4)MM固体培养基：1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇
(5)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(V/V)，1.34％YNB，0.00004％Biotin
(6)BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇(V/V)
实施例1高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体编码基因A-E168Q的克隆
本发明以来源于嗜热真菌篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802的酸性β-葡萄糖苷酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.3)为母本，采用分子生物学技术对酸性β-葡萄糖苷酶序列进行区域替换后表达。
SEQ ID NO.3如下所示：
YGFGGSGWDAAYGRAKAALNKLNQTEKVGIVTGVKWMGGPCVGNTYKPSSIDYPSLCLQDSPLGVRFANPVTAFPAGINAGATWDRSLINARGAAMGAEAKGLGVNVQLGPVAGPLGKNPNSGRIWEGFSNDPYLSGVAMEETIAGMQGSGVQACAKHYIGNEQEHNRETISSNIDDRTLHELYVWPFMNAVKANVASVMCSYNEVNGSWSCENDALLNGLLKTELGFPGYIMSDWNAQHTTVNSANSGLDMTMPGSDFNNPPGSIYWGPNLEAAVANGSVPQSRLDDMVTRILASWYLVGQDEGYPPVAFSSWNGGKANVDVTGDHKSVVRAVARDSIVLLKNDNNALPLRKPKSLAIIGQDATVNPAGPNACSDRGCDTGTLAMGWGSGTAQFPYIVGPLDAIQSQAAADGTNITTSTTDDTTAAASAAASAGTAIVFINSDSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNELVQAVAAVNKNVIVVVHSVGPVILEAILAQPNVKAIVWPGLPGQESGNALVDVLYGSTSPSGKLPYTIAKQFSDYGTTWTTSLVDDFTEGLFIDYRHFDENNITPRYEFGYGLSYTTFKYSDLDVNVQARPGAAEGPIVPGGVKELFDTVGTVTVTVQNSGKVAGAEVAQLYIGLPDSAPSTPPKQLRGFQKLHLAPGQREGATFELTRRDISYWDVQQQKWVVPSGTFKVYVGSSSRDIREQGSFRI
以Talaromyces leycettanus JCM12802基因组DNA为模板，在β-葡萄糖苷酶的催化活性通道loop区域处设计区域替换引物，采用over-lap PCR的方法扩增高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体编码基因A-E168Q。
表1.高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体PG63X特异性引物
实施例2高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的制备。
将表达载体pPIC9r进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的基因A-E168Q双酶切(EcoR I+Not I)，切好的编码成熟高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的基因片段与表达载体pPIC9r连接，获得含有高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因A-E168Q的重组质粒pPIC9r-A-E168Q并转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/A-E168Q。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。
重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体最适pH为4.5，最适温度为75℃，与野生型的一致，但是亲和力比野生型提高2.0倍，催化效率提高1.4倍。
实施例3重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的活性分析
β-葡萄糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPG所生成的产物对硝基苯酚(pNP)的量。
反应步骤：125μl 2mM pNPG底物与125μl缓冲液混匀，加入250μl适当稀释的酶液，于75℃反应10min，加入1.5mL 1M的Na2CO3终止反应，使用分光光度计测定OD405值。
酶活单位的定义：1个β-葡萄糖苷酶活性单位(U)定义为在给定反应条件下，每分钟分解底物pNPG生成1μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量。
实施例4重组β-葡萄糖苷酶高催化效率突变体的性质测定
1、重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适pH测定方法如下:
将实施例2纯化的重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物多聚半乳糖醛酸用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中75℃下进行β-葡萄糖苷酶活力测定。结果(图1)表明，重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适反应pH一致，且在pH3.0-6.0范围内有相同的作用趋势。符合不改变最适pH值提高催化效率的目的。
2、重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适温度测定方法如下:
重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适温度的测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图2)表明，重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的最适温度与野生型保持一致(75℃)。
3、重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的动力学参数测定方法如下:
测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为5min。用不同浓度的纤维二糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系中，75℃下测定酶活性，计算出其在75℃下的Km值。突变体及野生酶动力学参数如表2所示：
表2.突变体及野生型对纤维二糖酶催化反应动力学参数
结果显示，重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体最适pH为4.5，与野生型的一致，但是Km值由10.4mM降低为5.0mM，即亲和力比野生型提高2.0倍；kcat/Km值由75.8s-1mM-1提高至174.2s-1mM-1，即催化效率提高1.4倍。

Claims (9)

1.一种高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体。
3.根据权利要求2所述的高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.包含权利要求2所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体。
5.包含权利要求2所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体pPIC9r-A-E168Q，其中，将所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因***到质粒pPIC9r上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组载体pPIC9r-A-E168Q。
6.包含权利要求2所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为重组毕赤酵母GS115。
8.一种制备高催化效率β-葡萄糖苷酶的方法，包括以下步骤：
1)用权利要求4所述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组β-葡萄糖苷酶的表达；
3)回收并纯化所表达的高催化效率β-葡萄糖苷酶。
9.权利要求1所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体用于降解纤维二糖的应用。
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