CN104388453B - 一种猪圆环病毒cap蛋白嵌合猪瘟病毒B细胞表位的重组病毒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒cap蛋白嵌合猪瘟病毒B细胞表位的重组病毒及应用，本发明将人工合成的cap‑24B基因置于杆状病毒转移载体pH启动子下表达，获得了重组杆状病毒，CCTCC NO:V201432。本发明的重组杆状病毒所表达嵌合PCV2 VLP蛋白制备亚单位疫苗，免疫小鼠后，可诱导机体产生特异性体液免疫，能产生针对CSFV和PCV2的特异性抗体水平。为临床上同时防治这两种疾病提供了很好候选疫苗，也为研究圆环病毒为载体表达其他外源抗原提供可行性试验数据。

Description

一种猪圆环病毒cap蛋白嵌合猪瘟病毒B细胞表位的重组病毒 及应用

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒cap蛋白嵌合猪瘟病毒B细胞表位的重组病毒及应用。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的成员，包括P CV1和PCV2，是目前发现的世界上最小的脊椎动物病毒。PCV1无致病性，而PCV2有致病性。PCV2在临床上可感染5-12周龄的猪发生断奶猪多***衰竭综合征(postweaningmul tisystemic wastingsyndrome，PMWS)，还可引起猪皮炎肾病综合征(porcinedermatitis and nephropathy，PDNS)，猪呼吸道疾病复合症(porcine respiratorydiease complex，PRDC)，增生性坏死性肺炎(proliferative and necrotizingpneumonia，PNP)等疾病。目前，国际上为了研究的方便，把这些疾病统称为猪圆环病毒病(postweaning multisystemic wasting syn drome associated diease,PCVAD)。PCV的ORF2基因全长702bp(nt 1,735-1,034)，其编码的Cap蛋白由234个氨基酸组成，大小为27.8kDa。Cap是主要的免疫原性蛋白并能诱导特意的PCV2中和抗体(Pogranichnyy etal.,2000)，因此ORF2基因是设计PCV2新型疫苗的首选目标基因。Liu等(2001)通过大肠杆菌表达ORF2基因，证明其具有很强的免疫原性；在杆状病毒表达ORF2基因后可以形成圆环病毒样颗粒(Virus like particles，VLP)(Nawagitgul,2000)。Cap蛋白的N段是高度保守且富含精氨酸的序列，N段前41个氨基酸片段是Cap蛋白核定位信号序列(NLS)，研究表明缺失N段核定位序列不影响其组装成病毒样颗粒的特性。

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由黄病毒科瘟病毒属猪瘟病毒(Classicalswine f ever virus,CSFV)引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病。世界动物卫生组织(O IE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。当前猪瘟在我国很多猪场流行，临床上表现为早产、流产、死胎、木乃伊胎及猪生产能力下降等。同时该病与伪狂犬病、圆环病毒感染相关疾病等多重感染和混合感染常常发生。E2蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原主要成分，可以抵抗强毒的攻毒保护实验(Dong et al.,2006；Che n et al.,2011；Llilianne Gangesa et al.,2012)。E2蛋白存在4个相对独立的抗原区：A，B，C和D，而B区693-716之间的氨基酸序列(CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT)属于B细胞表位，能产生中和抗体并提供完全的保护率(Dong XN,et al.,2006，2007)。

近年来，杆状病毒表达载体因其具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效率高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点，已经在表达载体上占了主导的地位(Anderson et al.,1995；Wang et al.,2001；Ri beiro et al.,2001)。而近年来发展起来的病毒样颗粒疫苗，含有病毒的一个或多个抗原蛋白、具有与病毒粒子相似结构的颗粒，不含有病毒的遗传物质，不能自主复制、没有感染性，能以天然构象和模式递呈抗原，有效刺激体液和细胞免疫，诱导机体产生良好的免疫保护。本发明在PCV2的ORF2基因基础上，缺失其N段核定位39个氨基酸序列，***CSFV B细胞表位或偶联T细胞氨基酸的基因序列，以杆状病毒表达***表达嵌合B细胞表位的PCV2的Cap蛋白，研究B细胞表位的PCV2的病毒样颗粒疫苗形成的能力。同时利用形成的嵌合病毒样颗粒制备亚单位二价疫苗，通过动物试验评价对猪瘟病毒和猪圆环病毒的免疫原性效果，为临床上防控猪瘟和猪圆环病毒病提供理想的候选疫苗株。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种人工修饰合成的猪圆环病毒cap蛋白基因和猪瘟病毒B细胞表位基因序列嵌合的cDNA基因序列cap-24B，其序列分别为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的是提供一种转移载体pFBD-cap-24B，为含有3个拷贝的嵌合cap-24B cDNA基因序列的杆状病毒转移载体pFBDPHmHNM1P10eGFP。

本发明的另一个目的就是提供一种表达猪圆环病毒cap蛋白和B细胞表位基因的重组杆状病毒，该毒株于2014年10月19日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO:V201432，分类命名：重组杆状病毒Recominant Autographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus Ac-cap-24B，地址：中国武汉武汉大学。

本发明还有一个目的是提供了重组杆状病毒Ac-cap-24B在制备亚单位疫苗中的应用，将该嵌合病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后可诱导机体产生特异性抗猪瘟病毒和猪圆环病毒的免疫反应，并能产生针对猪瘟和猪圆环病毒的特异性的抗体反应。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

本发明的有益效果是：

1.本发明根据杆状病毒密码子的偏爱性，首次人工修饰合成了猪圆环病毒Cap基因N段核定位序列(NLS)替代为猪瘟病毒B细胞表位的cDNA基因序列的基因序列Cap-24B。

2.本发明是将人工合成目的基因Cap-24B置于杆状病毒pH启动子下表达，提高了外源基因的表达量。***到杆状病毒转移载体上置于杆状病毒pH启动子下表达，因***是3拷贝形式可提高外源基因的表达量。

3.本发明的重组杆状病毒所表达猪圆环病毒Cap基因嵌合猪瘟病毒B细胞表位后，同样能成功形成PCV2样病毒颗粒，表明猪圆环病毒Cap基因N段核定位序列(NLS)被替换后不影响其形成病毒样颗粒的能力，为进一步研制嵌合猪圆环病毒提供可行性依据。

4.本发明的重组杆状病毒所表达嵌合VLP制备亚单位疫苗，免疫小鼠后可诱导机体产生针对猪瘟病毒和猪圆环病毒的特异性免疫反应。

附图说明

图1 cap-24B基因人工合成和杆状病毒转移载体构建的示意图

A：cap-24B基因人工合成的示意图；

B：pFBD-cap-24B杆状病毒转移载体构建示意图。

图2为杆状病毒转移载体pFBD-cap-24B的酶切鉴定图谱。

M：15000bp DNA Marker；1:pFBD-cap-24B/SpeI+NotI酶切

图3重组杆粒rBac-cap-24B PCR鉴定示意图

鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBD-cap-24B转化DH10Bac，蓝白斑筛选获得阳性菌落，提取杆粒进行PCR鉴定的电泳图片。

M：2000bp；1：利用Cap-24B 4F和Cap-R引物扩增；2：利用Cap-24B 4F和M13R引物扩增；3：阴性对照。

图4为一种Western blot分析重组杆状病毒Ac-cap-24B蛋白表达的示意图

M：蛋白marker；1：SF9细胞对照；2：Ac-cap感染sf9细胞(阳性对照)；3：Ac-cap-24B感染sf9细胞；

图5为一种间接免疫荧光分析重组杆状病毒Ac-cap-24B蛋白表达的示意图

Anti-Cap：用PCV2 cap单抗检测目的蛋白表达，观察红荧光；EGFP：杆状病毒携带EGFP标记，观察绿荧光；DAPI：观察细胞核；Merge：红荧光与率荧光合在一起的图片

Ac-cap:Ac-cap感染的sf9细胞；Ac-cap-24B：Ac-cap-24B感染的sf9细胞

图6为杆状病毒Ac-cap-24B感染sf9细胞上清形成病毒样颗粒的电镜示意图

重组杆状病毒Ac-cap-24B接种sf9细胞，84小时后收集病变细胞并超声波裂解和超速离心进行电镜观察，可见大量大小约为17-20nm的无囊膜病毒，形态与典型的PCV2相同，表明组装成病毒样颗粒VLP。

图7为免疫小鼠免疫后不同时间抗PCV2的间接ELISA抗体和中和抗体示意图

A：小鼠免疫后不同时间点产生针对PCV2 cap的ELISA抗体水平；B：小鼠免疫后14天和40天时产生抗PCV2的中和抗体；

图8为免疫小鼠免疫后不同时间抗CSFV抗体示意图

小鼠免疫后不同时间产生针对CSFV的B细胞表位IgG含量。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述实际，如未特别说明，均为商业化或是已公开的试剂材料。

实施例1：

一种表达表达猪圆环病毒cap蛋白嵌合猪瘟病毒B细胞表位基因的重组杆状病毒Ac-cap-2

4B的构建

(一)重组杆状病毒Ac-cap-24B的构建

1、猪圆环病毒cap嵌合猪瘟病毒B细胞表位的目的基因获取

参照PCV2 WH分离株ORF2基因序列(华中农业大学硕士论文：猪圆环病毒2型(PCV2)的分离鉴定及灭活疫苗的研究与应用，硕士生：严伟东；导师：何启盖；毕业时间：2009年6月)，将N段核定位信号39个氨基酸的117个核苷酸序列缺失，替代为猪瘟病毒B细胞表位(CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT)72个核苷酸序列序列(如图1所示)，根据杆状病毒密码子的偏爱性人工合成666bp的cap-24B基因序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。这个序列亚克隆入载体pUC中获得重组质粒pUC-cap-24B(由上海生物工程公司成)。

2、杆状病毒转移载体pFBD-cap-24B的构建

杆状病毒转移载体pFBD-cap-24B的构建示意图如图1所示。

以质粒pUC-57cap-24B为模板，利用三对不同的引物(见表1)扩增cap-24B基因片段，分别克隆入杆状病毒转移载体pFBDPHmHNM1P10eGFP质粒(简称pFBD。钱平等，一种表达人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1基因的重组杆状病毒，专利公开号CN101624580A,专利号ZL200910063217.6)。进而通过BamHI和EcoRI，SpeI和NotI，SalI和HindIII将cap-24B基因片段分别克隆入pFFBD的相应位点，获得转移质粒pFBD-cap-24B。pFBD-cap-24B载体通过BamHI和EcoRI双酶切鉴定，结果显示酶切后有1129bp，750bp片段，大小与预期结果一致，表明转移质粒pFBD-cap-24B构建成功，酶切鉴定结果如图2所示。该转移载体含有3个拷贝的嵌合cap-24B cDNA基因序列。

表1克隆目的基因所用引物

注：黑体是酶切位点序列。

3、重组病毒杆状病毒Ac-cap-24B的构建

(1)重组杆粒Ac-cap-24B的获得与鉴定

取转移质粒1.0μg pFBD-cap-24B加入到100μL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞(GiBCO BRL公司产品)混合，冰浴30min后，于42℃45s水浴进行热激，然后冰浴2min，进而加入900μL SOC液体培养基，37℃振摇培养4h，按10^-1、10^-2、10^-3稀释后，各取100μL涂布于含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的高盐LB平皿，使用浓度按Bac-to-Bac B aculovirusExpression System操作说明书(Invitrogen公司)，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取重组杆粒，进而进行PCR特异引物扩增鉴定：vBac-cap-24B杆粒则分别通过Cap-24B 1-F和Cap-1R；Cap-24B 1-F和M13R两对引物进行鉴定检测，其预计扩增大小分别为为750bp和1500bp。

Cap-24B 4-F 5’-TTGGATCCGCCACCATGTGCAAGGAAGATTACAGGT-3’；

Cap-1R 5’-TTGAATTCTTACTTTGGGTTCAGTGGAGGGTCCT-3’；

M13R：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’；

其PCR扩增体系如下：

按95℃作用5分钟；然后94℃作用45秒分钟，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟的反应条件在ABI PCR仪上进行扩增。将扩增的PCR产物经1.0％(重量/体积，w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳，结果表明能够扩增出1500bp和750bp的两条特异目的条带，大小与预期一致，表明目的基因cap-24B片段已成功重组入杆状病毒基因组中(如图3所示)。

(2)重组杆状病毒Ac-cap-24B获得

无菌挑取含重组杆粒rBac-cap-24B的阳性菌落于高盐LB液体培养基中，在37℃培养16小时后，用0.3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-Cl(pH8.0))重悬，加入0.3mL溶液II(0.2mol/L NaOH,1％SDS,现用现配)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0.3mL溶液III(3mol/L的乙酸钾，pH5.0)混匀，冰浴5-10min，12000r/min离心10min，上清加到0.5mL异丙醇中，混匀冰浴5～10min，室温12000r/min离心20min，75％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于100μL TE中，分装于-80℃保存。

利用脂质体介导转染法(根据Invitrogen公司Bac-to-Bac BaculovirusExpression System操作说明书操作)，将筛选纯化后的重组杆粒rBac-cap-24B经Reagent转染sf9细胞(购自武汉大学中国典型物保藏中心)中，于28℃培养，转染后72h放置荧光显微镜观察有无绿色荧光出现，收集细胞上清即获得重组杆状病毒Ac-cap-24B，置于-80℃保存。重组杆病毒Ac-cap-24B具有与亲本毒株苜蓿银蚊夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)相同的形态学特性和培养特性，但该重组杆状病毒有绿色荧光标记基因eGFP，能在荧光显微镜下观察病毒扩增情况。该病毒已于2014年10月19日送至中国典型微生物保藏中心进行保藏，分类命名：重组杆状病毒Recominant Autographa californicamultiple Nucleopoly hedrovirus Ac-cap-24B；保藏编号：CCTCC NO：V201432。地址：中国武汉武汉大学。

(二)、重组杆状病毒Ac-cap-24B外源基因表达的检测

1、Westerning blot分析检测外源基因的表达

将sf9细胞接种6孔细胞培养板，待细胞长成80-90％单层时，用1.0m.o.i Ac-cap-24B和Ac-cap(阳性对照，硕士论文：彭波；PCV2 Cap蛋白在毕赤酵母和杆状病毒中表达及亚单位疫苗的制备。导师：钱平)接种sf9细胞，接毒84小时后收集细胞并用NP-40裂解液裂解细胞样品。SDS-PAGE后转膜，以本实验室何启盖教授制备的Cap蛋白单抗为一抗(硕士论文：陈冬焕；表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建及鉴定。导师：何启盖)，HRP标记的羊抗鼠IgG(Sigma)为二抗进行Western-blotting检测Cap蛋白的表达。结果显示重组病毒Ac-cap和Ac-cap-24B感染的细胞样品中分别出现一条27KDa左右大小的特异条带，大小与预期一致，而sf9细胞对照无此特异条带，证实Cap蛋白获得表达，结果如图4所示。

2、间接免疫荧光鉴定外源基因的表达

在刚长成单层的sf9细胞上，以1.0m.o.i的剂量接种重组杆状病毒Ac-cap-24B和Ac-cap，48h后固定细胞并进行间接免疫荧光检测Cap蛋白的表达。以本实验室何启盖教授制备的Cap蛋白单抗为一抗(硕士论文：陈冬焕；表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建及鉴定。导师：何启盖)，二抗为CY3-羊抗鼠IgG(Sigma)进行间接免疫荧光，最后置共聚焦显微镜下观察。结果表明感染Ac-cap-24B的sf9细胞中有很强的红色荧光信号，且主要表达在细胞核中，而正常sf9细胞没有任何红色荧光信号，表明重组杆状病毒Ac-cap和Ac-cap-24B都能有效表达cap蛋白，没有改变蛋白定位情况。结果如图5所示。

3、外源基因的***是否影响PCV2 cap蛋白体外组装成病毒样颗粒的电镜观察

将F4代Ac-cap-24B以1.0m.o.i剂量感染悬浮培养的sf9细胞，感染后在84h收集细胞，加入裂解液并冻融3次。在4℃条件下8000g离心30min，然后用蔗糖浓缩到原体积的1/10，上清中即含有表达的VLP颗粒。将上清27,000rpm/min，超速离心3小时，沉淀重悬于2.0ml的PBS中，并用1.0ml的注射器反复吹打，然后病毒悬液用20-60％蔗糖密度梯度进行27,00rpm/min超速离心16小时，收集最上层的蛋白带进行电镜观察，结果显示在电子显微镜(H-7000FA)下cap-24B蛋白能形成病毒液颗粒(Virus-like particles，VLPs)，直径约为大小为17–25nm，其形态和大小都与PCV2全病毒粒子相似(图6)。表明我们在PCV2 cap蛋白N段缺失NLS序列并替换为CSFV的B表位序列不影响cap蛋白形成VLP的组装。实施例2：

本发明的重组杆状病毒Ac-cap-24B在制备亚单位疫苗中的应用，过程如下：

(一)、重组杆状病毒Ac-cap-24B嵌合VLPs亚单位疫苗的制备

以实施例1获得的重组杆状病毒Ac-cap-24B，按照1.0m.o.i的剂量接种悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM(购自Invitrogen公司)，84h后收集细胞及上清，通过细胞破碎仪处理后离心除去细胞碎片，通过定量SDS-PAGE配体胶计算出cap-24B的蛋白表达量为52微克每毫升，进而与ISA-206油佐剂(购自SEPPIC公司)乳化制备成亚疫苗，使其每毫升中cap-24B蛋白含量为40微克，存储于4℃备用，用于以下实施例。

(1)物理形状

外观本品为乳白色均匀乳剂。

剂型为双向剂型(水包油包水)，取一清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，水面和水内都有。

粘度用出口内径为1.2mm吸管吸取疫苗1mL在25℃左右的室温下，令其垂直流出，在8秒钟内流出0.5mL，是合格的。

(2)无菌检验

按照《中国兽药典》附录169-171页进行，结果表明没有细菌生长。

(二)、本发明的重组杆状病毒Ac-cap-24B制备的嵌合VLPs亚单位疫苗的安全性试验

(1)新生仔猪安全性试验

将实验室制备的嵌合VLPs亚单位疫苗4批，每批随即取3瓶，混合均匀后，选择健康1日龄初生仔猪，每批疫苗接种10头猪，各肌肉注射2倍剂量4mL嵌合VLPs亚单位疫苗，另设4头猪为空白对照。所有仔猪在注射疫苗前以及注射疫苗后1周，每天测量2次体温并观察猪的生长状况、精神和食欲，连续观察14天。疫苗接种当天体温，精神和食欲正常，无不良反应，表明疫苗对新生仔猪是安全的。

(2)断奶仔猪安全性试验

将实验室制备的嵌合VLPs亚单位疫苗4批，每批随即取3瓶，混合均匀后，选择健康30日龄断奶仔猪，每批疫苗接种10头猪，各肌肉注射2倍剂量4mL嵌合VLPs亚单位疫苗，另设4头猪为空白对照，同上观察14天。疫苗接种当天体温，精神和食欲正常，无不良反应，表明疫苗对断奶仔猪是安全的。

(3)妊娠母猪安全性试验

将实验室制备的嵌合VLPs亚单位疫苗4批，每批随即取3瓶，混合均匀后，选择健康80日龄妊娠母猪，每批疫苗接种10头猪，各肌肉注射2倍剂量4mL嵌合VLPs亚单位疫苗，另设2头猪为空白对照。相同条件下饲养至产仔，观察疫苗对妊娠母猪繁殖性能产生的影响和新生仔猪发育情况，疫苗接种后体温、精神和食欲正常，无流产、死胎、木乃伊等现象，表明疫苗对妊娠母猪是安全的。

(三)、重组杆状病毒Ac-cap-24B嵌合VLP亚单位疫苗在小鼠中的免疫原性实验

为了评价上述制备的嵌合VLPs亚单位疫苗针对猪圆环病毒和猪瘟病毒的免疫原性，购买6周龄雌性Ba/bc小鼠18只，随机分成2组，每组6只。PBS为阴性，Ac-cap-24B组。免疫剂量为Ac-cap-24B组每只小鼠免疫200ul，使cap-24B蛋白量为40微克每只小鼠。免疫途径为后腿肌肉注射，3周后以同样剂量加强免疫一次。首免后0，14，28，40天进行尾静脉采血，评价其免疫效果。

(1)机体产生针对PCV2 cap蛋白的抗体水平

以0.1微克的PCV2 cap蛋白原核表达产物包被酶联反应板，通过间接ELISA方法检测小鼠血清中抗cap的抗体水平。结果表明重组杆状病毒Ac-cap-24B嵌合VLP亚单位疫苗免疫小鼠组在一免后14天，均能产生特性的针对PCV2 cap蛋白的ELISA抗体。免疫后抗体水平持续上升，40天时ELISA抗体达到最高，抗体分别为达到0.953,0.968，两组间产生抗cap的ELISA抗体水平没有明显的差异(P<0.05)，而阴性对照组没有产生特性型的抗PCV2的抗体(如图7所示)。

(2)机体产生针对CSFV的免疫原性

利用CSFV的B细胞表位多肽(CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT)(上海生工公司合成)偶联KLH蛋白载体，以2微克蛋白包被酶联反应板，通过间接ELISA方法检测小鼠血清中分别抗CSFV B细胞表位的IgG含量。结果显示Ac-cap-24B免疫组小鼠在免疫后14天能检测到产生针对B细胞表位的IgG产生，免疫后40天时达到最高水平；而阴性对照组均检测不到针对B细胞表位的IgG产生(如图8所示)。

上述动物试验结果表明Ac-cap-24B制备的嵌合VLPs亚单位疫苗能有效的诱导机体产生针对PCV2和CSFV免疫应答反应。

(四)、重组杆状病毒Ac-cap-24B嵌合VLP亚单位疫苗在猪体内的免疫效力实验

选择猪圆环病毒和猪瘟病毒血清学阴性3月龄猪，随机分4组：PBS阴性组，Ac-cap-24B嵌合VLP亚单位疫苗组，猪圆环病毒2型灭活疫苗和猪瘟病毒兔化弱毒疫苗组，Ac-cap-24B嵌合VLP亚单位疫苗组以40μg/只蛋白剂量免疫猪颈部肌肉，共免疫2次，间隔4周。猪体免疫后第8周用100RID50猪瘟病毒C株或10⁷ TCID₅₀的猪圆环病毒2型WH株(严伟东，硕士学位论文，猪圆环病毒2型(PCV2)的分离鉴定及灭活疫苗的研究与应用)攻毒，每种病毒攻毒5头猪，进而观察攻毒后猪的临床症状和检测体温变化等。

各免疫组猪在攻入100个RID50的猪瘟病毒C株后，猪瘟病毒商品疫苗免疫组5头猪均无明显体温变化，Ac-cap-24B嵌合VLP亚单位疫苗免疫组有3头猪没有体温变化，而阴性组组和猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫组猪的体温均升高并呈现定型热反应。以上结果表明Ac-cap-24B嵌合VLP亚单位疫苗对猪瘟病毒的攻击有60％的保护(如表2所示)。

表2：猪瘟病毒C株攻毒后的体温变化

猪圆环病毒2型WH株攻毒后(攻毒剂量为1×10⁷ TCID₅₀猪圆环病毒2型WH株/头)，PBS阴性组和猪瘟病毒兔化弱毒疫苗免疫组开始各有1头猪精神较沉郁，第8天时恢复正常，均无体温升高情况。Ac-cap-24B嵌合VLP亚单位疫苗免疫组和猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫组在攻毒后这段时间内都没有出现异常情况，采食、精神状态以及体温等都正常。攻毒前和试验结束时分别称重，平均相对日增重结果显示Ac-cap-24B嵌合VLP亚单位疫苗免疫组平均相对日增重与猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫组相当，均明显高于阴性对照组和猪瘟病毒兔化弱毒疫苗免疫组。另外，将所有猪处死后剖检观察猪的病变情况，结果显示Ac-cap-24B嵌合VLP亚单位疫苗免疫组和猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫组猪的***、肾脏和脾脏均较正常；而阴性对照组和猪瘟病毒兔化弱毒疫苗免疫组猪肺部呈现实变、出血点，腹股沟***边缘出血，肺门***出血十分严重。表明该Ac-cap-24B嵌合VLP亚单位疫苗免疫组能完全保护猪圆环病毒强度的攻击。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种猪圆环病毒cap蛋白嵌合猪瘟病毒B细胞表位的重组病毒及应用

<130> 一种猪圆环病毒cap蛋白嵌合猪瘟病毒B细胞表位的重组病毒及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtgcaagg aggactacag gtacgccatc tcctccacca acgagatcgg cctgctgggc 60

gccggcggcc tgacctggcg tagaaagaac ggtatcttca acacaagatt gtctcgtaca 120

atcggttaca ctgtcaagaa gaccaccgtc agaaccccat cttggaacgt tgacatgatg 180

agattcaaca tcaacgactt cctgccacct ggtggtggta gcaacccact caccgtccct 240

ttcgagtact acagaatccg taaggttaag gttgagttct ggccatgctc tcctatcacc 300

caaggagaca gaggtgtcgg tagcactgct gtcatcctgg acgacaactt cgttactaag 360

gccaacgctc tgacctacga cccttacgtc aactacagct ctagacacac cattactcaa 420

ccattcagtt accactcccg ttacttcacc ccaaagcctg tcctggaccg tactattgac 480

tacttccaac caaacaacaa gcgtaaccag ctgtggctga gactgcaaac tacaggaaac 540

gtcgaccacg ttggtctggg aaccgccttc gagaactcca tctacgacca ggactacaac 600

atcagaatca caatgtacgt ccagttcaga gagttcaacc tgaaggaccc tccactgaac 660

ccaaag 666

<210> 2

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile

1 5 10 15

Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile

20 25 30

Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr

35 40 45

Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile

50 55 60

Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro

65 70 75 80

Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys

85 90 95

Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile

100 105 110

Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro

115 120 125

Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr

130 135 140

His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp

145 150 155 160

Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln

165 170 175

Thr Thr Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn

180 185 190

Ser Ile Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln

195 200 205

Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

210 215 220

Claims (4)

1.一种人工修饰合成的基因序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.包含权利要求1所述基因序列的杆状病毒转移载体。

3.一种表达猪圆环病毒与猪瘟病毒嵌合基因Cap-24B基因重组病毒，其特征在于：重组杆状病毒Recominant Autographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus Ac-Cap-24B，CCTCC NO:V201432。

4.权利要求3所述的重组病毒在制备亚单位疫苗中的应用。