CN103820398B - 一种水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗及其制备方法。本发明涉及疫苗的生产毒株是重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCC No.8051，该毒株系采用的表达载体为分泌表达，且含有6个组氨酸标签，易于蛋白检测分析用；用其生产水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗，该疫苗不含病毒基因组，无动物安全危害和潜在散布性；免疫针对性强，能激发免疫动物产生足量的免疫抗体，并产生长久保护力。按照本发明生产MEV病毒样颗粒，1000L生物反应器中收获的病毒液效价达到血凝价1∶4096～1∶32768，成颗粒蛋白表达量约65mg/L，每升病毒液半成品可以制成标准水貂疫苗3000～8000头份；该重组亚单位疫苗为明显优于现有灭活组织疫苗的新疫苗。

Description

一种水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗及其制备方法。该疫苗是一种应用昆虫杆状病毒表达***生产的重组亚单位疫苗，具有抗水貂病毒性肠炎作用的疫苗，属于兽用生物制品及生物技术领域。

背景技术

水貂病毒性肠炎(Mink Viral Enteritis，MVE)是由水貂肠炎病毒(MinkEnteritis Virus，MEV)引起的一种急性、高度接触性传染疾病，该病以腹泻为主要特征，具有较高的发病率和死亡率。

MEV在分类上隶属于细小病毒科(Parvoviridae)，细小病毒属(Parvovirus)。MEV感染水貂后，可引起水貂的肠黏膜炎症、坏死，继而引发水貂的剧烈腹泻，该病的发病急、致死率高(闫喜军，柴秀丽，吴威，等.水貂肠炎细小病毒分离鉴定.畜牧与兽医.2007,39(3):52-53.)。MEV可感染各年龄段的水貂，对幼貂的感染性极强。1949年，Schofield于加拿大最早报道了该病。Wills于1952年分离鉴定了该病原，并为该病毒命名。随后该病陆续在世界其它养貂国暴发，美国、丹麦、法国、英国、日本等国相继有该病暴发的报道(廖国安.水貂病毒性肠炎.中国畜禽传染病.1990,2:53-56.)。该病是世界公认的危害水貂饲养业较大的病毒性传染病之一，给养貂业带来了巨大的经济损失(闫喜军，张海玲，柴秀丽，等.水貂肠炎细小病毒结构蛋白VP2基因的克隆和序列分析.特产研究.2008,47(4):1-6.)。同其他病毒病一样，水貂病毒性肠炎的防治也主要以预防为主。目前用于水貂病毒性肠炎的疫苗主要是灭活疫苗。

目前防治MEV的常规疫苗主要为灭活疫苗。常用的是MEV铝胶甲醛灭活苗。取猫肾原代细胞(CRFK)或猫肾细胞(F81)用胰蛋白酶消化。培养液为含10％牛血清的乳蛋白。这种疫苗的优点是安全性较好，副作用较小，但因其灭活使用的甲醛对抗原蛋白具有一定的破坏作用及灭活后的MEV病毒不能够在水貂体内增殖，因此免疫期短，需要多次免疫；为达到好的免疫效果常选用强毒株，因此需严格的灭活操作，假若灭活效果不理想，存在散毒的风险；灭活疫苗不能诱导产生局部IgA，粘膜免疫防御能力较弱。

基因工程亚单位疫苗是利用基因工程技术，构建连有保护性抗原编码基因的表达载体，在细胞或菌体中表达目的蛋白，经提纯加工抗原蛋白制成的疫苗(J A Lopez deTurisod,S E Corte,C Martinez,et al.Recombinant Vaccine for Canine Parvovirusin Dogs.Journal of Virology.1992,66(5):2748-2753.)。

理想的MEV疫苗的一个重要标准就是成本低。使用杆状病毒表达***在昆虫细胞系获得高产率的重组VP2为MEV疫苗提供了一种新的选择。众所周知，应用生物反应器大规模培养昆虫细胞系既困难又昂贵，只有解决相关技术难题，如培养基成本、高密度高表达、生物反应器放大技术，才能够使该疫苗的商业化成为可能。

MEV粒子为直径20～24nm的轴对称的二十面体结构，无囊膜，粒子内含有单股负链DNA。MEV的基因组大约为5kb，分子量约为1.5～2.0×10⁶kD(T Kariatsumari,M Horiuchl,E Hama,et al.Construction and nucleotide sequence analysis of an infectionsDNA clone of the autonomous pavovirus,mink enteritis virus.Journal of GeneralVirology,1991,72:867-875.)。在其基因组中有两个主要的开放阅读框架，它们分别编码结构蛋白(VP1和VP2)和非结构蛋白(NSl和NS2)。MEV无囊膜，不含糖类和脂质，结构坚实紧密。MEV对温度不敏感，65℃保温30min，病毒仍然可以感染水貂。

病毒样颗粒(VLPs)是亚单位疫苗半成品的功能性成分，它模仿病毒粒子的整体结构，却不含有传染性遗传物质。事实上，许多病毒样颗粒完全缺乏DNA或RNA病毒的基因组，只拥有和灭活、减毒病毒疫苗所含病毒衣壳蛋白相近的构想。通常情况下，仅较低剂量的病毒样颗粒模仿的病毒粒子结构做为抗原免疫宿主，便足以引起和病毒性疫苗所产生的类似的保护性反应。除了它们能激发B细胞介导的免疫反应，也已被证明是非常有效的刺激CD4增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)响应的抗原物质。

杆状病毒是有囊膜的DNA病毒，特异性感染昆虫，利用高效的多角体或P10启动子，被广泛用于依托昆虫细胞表达蛋白。杆状病毒表达***的优点包括高水平表达，易于表达重组蛋白，能够表达大片段的外源基因，正确的翻译后修饰，以及良好的生物安全性等(T AKost,J P Condreay,D L Jarvis.Baculovirus as versatile vectors for proteinexpression in insect and mammalian cells.Nature biotechnology.2005,23:567-575)。然而，通常情况下外源蛋白的表达水平仍远低于野生型病毒所表达的多角体蛋白。通过对昆虫细胞基因组进行分子水平上的改进等努力，将有利于显著提高外源基因的表达量。

MEV主要编码两种结构蛋白：VPl和VP2，VP2位于VPl的C端，VP2蛋白的N端氨基酸序列和VPl蛋白C端氨基酸序列相互重叠，且二者终止于同一密码子(Parrish CR，1999)。VP1蛋白包含727个氨基酸，其中含有584个氨基酸的VP2蛋白和143个氨基酸的独特区。

细小病毒的衣壳蛋白的三级结构是相似的，其病毒粒子表面由60个结构蛋白亚单位装配而成，其中VPl占5～6个；VP2占54～55个，是构成衣壳蛋白的主要结构蛋白。经研究证实，在细小病毒上至少有三个抗原表位区：1.Loopl和Loop3近区域；2.二折叠下陷和三折叠突起区之间；3.临近三折叠中心区。这些抗原表位区可诱导机体产生中和抗体，区域中的氨基酸变化使得细小病毒可以逃避机体预先免疫产生的抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的水貂肠炎病毒疫苗，用于生产安全、高效的水貂病毒性肠炎(MVE)疫苗。提供了一种可以替代传统的组织疫苗产品的选择途径，能够避免组织疫苗产品的诸多不利方面。这种新疫苗含有重组MEV衣壳蛋白，而不含有MEV病毒基因组成分，从而避免了病毒扩散和基因组释放的风险；为此首先是构建一株能表达MEV衣壳蛋白的构建一株重组病毒作为该亚单位疫苗的生产毒株。

技术路线为：

本发明涉及的技术方案包括：

1.本发明所涉及的一种重组杆状病毒，其转移载体包括：在pVL1393转移载体PolyA后的SnaBⅠ酶切位点***HS4序列，在多克隆位点之前***蜂毒素信号肽；在多克隆位点中***一个拷贝的MEV结构蛋白VP2基因；在外源基因的C端含有6个组氨酸的标签序列,该重组杆状病毒命名为重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP2。

2.本发明所涉及的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCC No.8051能够感染昆虫细胞系，并高效分泌表达重组蛋白VP2，上述重组VP2蛋白质在功能上等同于水貂肠炎病毒VP2蛋白质并能够进一步自组装成水貂肠炎病毒衣壳蛋白。

3.以上所述的水貂肠炎病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中表达量比常规商业化pVL1393系列载体的表达量更高，且被分泌到胞外，稳定存在于表达的上清液中，此培养上清液不需要经纯化即能使用。

4.该重组水貂肠炎病毒衣壳蛋白在抗原性和免疫源性上与天然的水貂肠炎病毒一样，并且是一种能够诱导水貂产生针对水貂肠炎病毒感染的免疫应答的蛋白。

5.本发明所涉及用于预防水貂病毒性肠炎的重组亚单位疫苗包含了以上所述的重组水貂肠炎病毒衣壳蛋白和表达上清液。

6.本发明所述的预防水貂肠炎病的重组亚单位疫苗为肌肉注射剂型时，含有佐剂。

7.本发明所述一种水貂肠炎病毒亚单位疫苗的大规模制备方法，包括如下步骤：

(1)利用三角摇瓶无血清全悬浮培养Sf9细胞制备种子细胞；

(2)利用三角摇瓶无血清全悬浮制备重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCCNo.8051；

(3)将种子细胞直接接种入搅拌式生物反应器全悬浮培养Sf9细胞，将生物反应器的培养规模放大至1吨细胞罐，并通过流加培养工艺将细胞密度培养至2.0×10⁶cells/ml～4.0×10⁶cells/ml；

(4)以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0.5～5.0接种病毒CGMCCNo.8051，培养72～140h；

(5)收获上述培养液上清，经灭活、加入氢氧化铝胶混合后制成疫苗。

8.以上所述的制备方法，在于全部培养过程包括细胞冻存和复苏，均为单细胞全悬浮的、无血清、无蛋白的培养环境，还使用机械搅拌式生物反应器全悬浮培养Sf9细胞，并且放大培养规模达到1吨细胞罐。

本发明详细描述

一、重组病毒的构建及其特性

1.水貂肠炎病毒(MEV)结构蛋白VP2基因的获得

GENBANK公布的从中国吉林分离出的一株MEV病毒VP2蛋白序列http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/340764648。另外，对本公司所拥有的水貂肠炎病毒疫苗生产毒株RC1株的VP2蛋白序列(序列1)进行测序，两者比对后，发现有99％的同源性，以后者的基因序列为模板，设计合成VP2基因上下游引物(由上海生工合成)VP2-F(序列2)/VP2-R(序列3)。然后使用RT-PCR的方法扩增VP2基因(见图1)，将该基因克隆入pMD19-T载体中(pMD19-VP60)，以质粒的形式保存在E.coli中。

2.构建含有绝缘子顺式作用元件和蜂毒素信号肽的转移载体

绝缘子是一段DNA序列，可以将目标基因与其周围的调控元件隔离，以确保其表达(J A Wallace,G Felsenfeld,We gather together:insulators and genomeorganization.Current Opinion in Genetics and Development.2007(17)400–407)。已经确定了两类绝缘子：增强-阻断绝缘子和隔断绝缘体。增强-阻断绝缘子可以阻断末端增强作用并防止不适当的激活在增强子和启动子之间的基因表达。阻断绝缘子可以阻止异染色质的扩展和保护转录活性区域。许多在酵母，果蝇，人类和其它真核生物基因组中的绝缘子已经被鉴定出来。他们通常定位在基因附近的区域，而且通常包含DNA酶-I敏感位点。鸡β-肌球蛋白绝缘子(HS4)长约1.2kb，是最常见的研究脊椎动物的绝缘体。它具有增强-阻断绝缘子和隔断绝缘子双重功能，同时还能够阻断沉默子的效果(S Yao,C S Osborne,R RBharadwaj,P Pasceri,T Sukonnik,D Pannell,F Recillas-Targa,A G West,JEllis.Retrovirus silencer blocking by the cHS4insulator is CTCFindependent.Nucleic Acid Research.2003(31)5317–5323)

我们实验室的前期工作发现，HS4绝缘子置于杆状病毒表达载体的目的基因表达盒的下游，能够大幅提高兔出血热病毒VP2的表达量。进一步，我们尝试将HS4绝缘子置于MEV主要结构蛋白(VP2)表达盒的下游，发现VP2的表达量在72h、96h有大幅提高，其中72h的表达量大约是对照组的3倍。结果暗示VP2蛋白表达受到异染色质效应的影响而降低其表达水平，HS4能够降低这种影响的水平。

我们前期的实验发现，Sf9细胞表达VP2蛋白，在组装成病毒样颗粒后，基本不能够被分泌到胞外环境中的，也就是说在没有信号肽的情况下，胞内表达形成的病毒样颗粒缺少一套分泌机制。只有通过对收获的细胞病毒悬液进行反复冻融，才能够使胞内的大量的病毒样颗粒释放出来。所以我们考虑通过在VP2上增加信号肽来促进病毒样颗粒的分泌。

多数哺乳动物基因的信号肽往往不能被昆虫细胞识别,若将包含信号肽的全基因克隆到重组杆状病毒,常常不能实现分泌型表达。蜂素信号肽(Honeybee melittin signalpeptide)能够介导外源蛋白通过分泌表达的形式存在于培养上清中,并能够使外源蛋白的表达量增加5倍。所以我们通过在多角体启动子的上游添加蜂毒信号肽的方法来提高病毒样颗粒的分泌比例。

通过将绝缘子和蜂素信号肽***重组病毒构建常用载体pVL1393中，以方便外源基因快速整合到载体中，与两种作用原件连接，具体见图3。

具体步骤如下：

(1)含有蜂毒素信号肽的载体构建：

蜂毒素信号肽序列根据参考文献(Van der Geld Y M,Smo ok M L,H uit ema MG,et al.Expr essio n o f recombinant pro teinase 3,the autoant-I gen inWegener's g ranulomato sis,in insect cells.J Immuno l Methods,2002,264(1/2):195-205)。

人工合成含有蜂毒素信号肽序列(HBM)的DNA片段(序列4，该DNA片段包括蜂毒素信号肽、6个组氨酸标签(6×His Tag)、多克隆位点等由上海生工生物工程有限公司完成)，合成的DNA片段已经克隆入pMD19-T载体(宝生物工程(上海)有限公司)中(pMD19-HBM)，以质粒的形式保存在E.coli中,然后PCR扩增该片段，使用BamHⅠ，PstⅠ双酶切pVL1393载体和PCR产物，然后将双酶切的PCR产物与载体相连，合成的含有蜂毒素信号肽的DNA片段就替换了pVL1393上的相应的一段序列。

(2)在含有蜂毒素信号肽的载体***HS4绝缘子基因序列

根据Gene Bank公布序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U78775.2登陆号：U78775.2)人工合成全长的HS4绝缘子序列(序列5，由上海生工生物工程有限公司完成)DNA片段，见图2。合成的DNA片段已经克隆入pMD19-T载体(宝生物工程(上海)有限公司)中(pMD19-HBM)，以质粒的形式保存在E.coli中,通过PCR扩增该片段，然后将其通过单酶切连接的方法***到上述构建好的含有蜂毒素信号肽的pVL-HBM位于基因表达盒下游的SnaBI酶切位点。新的载体命名为pVL-HBM-HS4。

3.构建含有VP2基因的昆虫杆状病毒表达质粒并制备重组昆虫细胞杆状病毒

昆虫细胞表达质粒pVL-HBM-HS4经限制性内切酶EcoR I/Kpn I 37℃过夜消化水解后，用凝胶电泳及过滤柱抽提纯化。在T4DNA连接酶的作用下，与使用EcoR I/Kpn I酶切pMD19-VP2质粒回收的VP2基因片段于16℃连接过夜，然后采用热休克方法将连接产物转导入E.coli DH5α感受态细胞。

具体操作如下：将50μl DH5α感受态细胞移入到一小塑料离心管中，加入5μl的连接反应液，混匀后将小管置于冰上30min，转入42℃水浴中热休克90s，迅速放回冰上，2min后加入950μl LB培养基，37℃培养1h。取1mL菌液浓缩成100μl涂布于LB固体培养基(含有100μg/ml氨苄西林)上，37℃培养16h，使用VP2-F(序列2)/VP2-R(序列3)引物进行菌落PCR，鉴定长出的阳性克隆。

具体操作：挑取长出的单菌落接种于2ml LB培养液(含有100μg/ml氨苄西林)中，37℃，转速250r/min，震荡培养2h，然后取1μl菌液作为模板PCR，然后琼脂糖凝胶电泳，鉴定出阳性克隆。然后送测序。保存测序正确克隆，获得转移载体pVL-HBM-HS4-VP2，见图3。将pVL-HBM-HS4-VP2载体与BD BaculoGold Linearized Baculovirus DNA(美国TRANSLAB产品)共感染Sf9细胞获得重组杆状病毒。

在6cm的组织培养皿中接种2×10⁶个Sf9细胞，细胞汇合度为50％～70％。待细胞贴壁后(大约15min)，从培养皿中移除培养基，然后加1mL的转染缓冲液A。将0.5μg的BDBaculoGold Linearized Baculovirus DNA和2μg的pVL-HBM-HS4-VP2质粒在无菌EP管中混匀放置5min，然后再加入1mL转染试剂B。再混合均匀。然后吸取1mL的转染试剂B/DNA混合物一滴一滴的滴加到组织培养皿中。然后将培养皿在27℃孵育4h。4h后，移除转染复合物，使用细胞培养基洗三次，然后加入3mL新鲜培养基在27℃培养4～5天。使用封口膜将培养皿封口，同时在培养箱中放入湿纸巾。4天后收获上清，获得重组病毒。然后通过蚀斑实验获得单克隆杆状病毒。

具体操作如下：

1)在6mm的组织培养皿中接种2～2.5×10⁶个Sf9细胞，室温下放置5min。梯度稀释(10^-4～10^-7)收获的共转染病毒上清。在每一个培养皿中加入1mL稀释的病毒。在室温下放置1h，每过15min摇晃一下，让病毒充分感染。

2)同时使用无菌水配置2％的低浓度琼脂糖，使用微波加热到60℃充分融化。然后放入42℃水浴锅中保温，然后加入等体积的Grace培养基(GIBCO，2倍浓缩)，混合均匀。

3)吸走培养皿中上清，使用枪头小心的在细胞表面覆盖4mL的1％琼脂糖，同时吸走所有的气泡。大约10～15min后琼脂糖凝固。

4)然后将培养皿在湿润的环境中27℃培养7天就可以看到噬斑。在培养皿上画一个点标记噬斑，然后使用枪头挑取数个噬斑，放入700μl SF-SFM培养基(苏州市沃美生物技术有限公司)中与4℃摇晃过夜。获得病毒悬液(P0代)，-80℃冷冻保存作为种子库。

将收获重组杆状病毒命名为重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP2，该病毒于2013年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8051。

4.重组杆状病毒滴度的测定

采用空斑计数法，准备20ml细胞悬液，调整细胞密度为5×10⁵cells/ml，于6孔板中每孔铺2ml细胞。待低熔点琼脂液化后，马上将低熔点琼脂、昆虫培养基(苏州市沃美生物技术有限公司产品)放入超净台。吸取13ml 4％低熔点琼脂加入装有39ml培养基(浓度为常规培养基的1.3倍)试剂瓶中，温和混匀。准备好后，放于40℃水浴中。用昆虫培养基将病毒稀释7个浓度梯度(10^-1～10^-7)，方法：取0.5ml病毒液放入4.5ml培养基中(用10ml无菌离心管)，稀释为10^-1，其余依此类推。P1代病毒测10^-4、10^-5、10^-6三个滴度，P2代病毒测10^-5、10^-6、10^-7，P3代病毒测10^-6、10^-7、10^-8三个滴度，每个滴度4个孔。细胞贴壁后将6孔板中的培养基移去，马上加入1ml病毒稀释液。在27℃培养箱中吸附1h后，将病毒液吸出，马上将放在40℃水浴的平板培养基(低熔点琼脂糖培养基)放入超净台，将2ml的平板培养基放入。将孔板用封口膜包好，并放于自封袋内，于27℃培养箱中培养。在转染后第7～10天时，配制1mg/ml的中性红溶液(用灭菌蒸馏水配制)。每孔加入0.5ml的1mg/ml的中性红溶液，室温孵育1～2h。观察到重组病毒形成的近似透明的小点即为空斑。计算统计观察病毒蚀斑形成单位(plaque forming units，PFU)。利用公式―滴度＝蚀斑数×稀释倍数×(1/接种体积ml/孔)‖，计算病毒滴度，优化范围是6孔板上每个孔计算3～20个斑。

5.重组杆状病毒侵染Sf9细胞生产MEV病毒样颗粒的检测和鉴定

(1)重组杆状病毒侵染Sf9细胞生产MEV病毒样颗粒

200ml Sf9细胞悬液培养于1L螺口三角摇瓶中，细胞培养基为无血清培养基SF-SFM(苏州市沃美生物技术有限公司)，摇床转速为110r/min，温度恒定于27℃。当细胞密度达到2×10⁶cells/ml时，用杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP2以MOI＝0.5接种。培养96h后，收集上清，4℃3000r/min离心10min，收集上清液，-20℃冷冻保存。由于上清中病毒样颗粒具有蛋白特性，能够被SDS凝胶电泳(见图4)检测和Western blot检测(见图5)。

(2)凝胶蛋白电泳检测VP2蛋白的表达

取上述培养重组杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP2的细胞悬液，4℃离心(9000r/min)5min，收集上清液，进行SDS凝胶电泳。设置电泳条件为恒定电压100V，时间为2h。结束后，凝胶置于0.1％R型考马斯亮蓝染色液中，水平摇摆染色1h，然后用脱色液脱色，并拍照，见图6。

(3)Western blot检测分析VP2蛋白的表达

取上述培养重组杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP2的细胞悬液，4℃离心(9000r/min)5min，收集上清液，取10μl上清液与10μl的2倍浓缩的SDS上样缓冲液混合，99℃处理5min后，将样品加入12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的点样孔中，进行电泳。转膜时，恒定电流300mA，4℃下转移1.5h，取出硝酸纤维素膜放于5％脱脂奶粉中封闭3h。孵育时，一抗采用抗6个组氨酸的兔源抗体(1∶500)，二抗采用的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(1∶1000)。

(4)MEV病毒样颗粒的HA滴度检测

将96孔血凝板的连续18个孔标记，每孔加入25μl生理盐水，再向第一个孔加入25μl的重组杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP2的细胞上清，将样品依次进行1：2的倍比稀释，设置6～8个孔的空白对照，只添加生理盐水。向每一孔加入25μl 1％的猪红血球，混匀后37℃放置40min后查看并记录血凝结果，见图7。

(5)MEV病毒样颗粒的纯化

采用蔗糖梯度离心，将收获的病毒悬液(约150ml)分装至50ml离心管中，用高速冷冻离心机离心(500g)10min，弃去上清。用密度梯度离心裂解液约10ml，将4个离心管中的细胞沉淀重悬，再加入蛋白酶抑制剂(上海生工生物工程有限公司，Protease InhibitorCocktall，1mL用于10⁹cells)及PMSF蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟,100X，终浓度0.1mM)。将裂解好的悬液放至冰上，用超声波细胞粉碎机超声超声10min，显微镜下看超声效果。超声完毕后将混合液分装至2ml EP管中，用高速冷冻离心机，12000r/min，4℃离心15min，将上清转入新的EP管中，再离心15min。将离心后的上清转移至新EP管中，每个样品6个EP管，1.5ml/个，准备做蔗糖梯度离心。转头可以放置6个离心管，将6个离心管加满40％的蔗糖(Sigma Sucrose，BCBH5304V)，根据样品的量吸出适量的蔗糖，将样品慢慢加到蔗糖上面。安装不锈钢套管编号。离心速度：200000g(39900r/min)，离心2h，温度4℃。将离心好的样品取出，用400μl TAE溶液重悬样品沉淀(留样检测)。在2个离心管中依次加入30％,45％,60％(W/W)的蔗糖,加的时候用长针头从底部往上加。在两个超速离心管中各加入200μl含病毒样品的溶解液。150000g，4℃离心2h。离心完毕后，发现60％蔗糖层内有一条明亮的条带，即为目标蛋白，将蛋白吸出。

(6)电镜拍片检测

将少量的纯化浓缩后的MEV病毒样颗粒样品固定处理后，置于新制备的无负荷塑胶/碳包被网格上，用数滴蒸馏水轻轻冲洗几次后，加上2％磷钨酸钠溶液进行负染色。电子显微镜下观察并拍片(见图8)。

二、生产种毒批的制备和保存

重组杆状病毒制备工艺主要包含重组pVL1393质粒(保存在宿主菌中)和同源重组成功并通过噬斑实验纯化的重组杆状病毒(第一代毒)。前者加入甘油保存在-80℃中，生产用种毒是在第一代毒中加入3％胎牛血清分装保存在-80℃中，种毒的长期实验室保存是通过抽提重组病毒基因组保存在-80℃中。制备生产用病毒批通常是将分装保存的种毒P1(第一代)病毒感染Sf9细胞制备P2(第二代)病毒、依次类推制备P3(第三代)病毒。

生产种毒批的制备和保存具体方法如下：

1.将收获的同源重组成功的病毒通过噬斑实验，筛选几个噬斑制备出纯的重组病毒。此为P0病毒。

2.然后将P0病毒感染Sf9细胞，收获P1病毒。

3.然后将P1病毒添加20％血清后按照每细胞冻存管1ml进行分装，然后放于-80℃冰箱保存。次作为生产用的种毒库。依次扩增P1种毒获得P2，P3病毒，P3病毒作为生产用病毒。

按照这种方法制备一个批次的种毒可以供一个生产周期的使用，且种毒性质均一。种毒批用完之前，不需要重新制备种毒。

三、疫苗生产

(1)复苏冻存Sf9细胞的种子细胞1ml于100ml无血清培养基中，置于500ml螺口玻璃三角摇瓶中培养，摇床温度27℃，转速110r/min。培养48h后补加200ml无血清培养基，稀释传代于3000ml螺口玻璃三角摇瓶中。培养48h后补加400ml无血清培养基。按照每48h，1∶2稀释比例传代至3000ml种子细胞，细胞密度达到3.0×10⁶cells/ml；

(2)上述3000ml种子细胞接种入30L搅拌式生物反应器(工作体积20L)。培养72～96h后，通过流加培养添加营养浓缩液，继续培养72h，细胞密度达到4.0～8.0×10⁶cells/m；

(3)将上述30L搅拌式生物反应器中的20L种子细胞直接接种入1000L生物反应器，逐步补加新鲜培养基至总培养体积750L，并通过流加培养工艺将细胞密度培养至2.0×10⁶cells/ml～4.0×10⁶cells/ml；

(4)利用三角摇瓶无血清全悬浮培养重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCCNo.8051，将其以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0.5～5.0接种入以上1000L生物反应器的培养的细胞中；

(5)收获上述培养液上清，经灭活、加入氢氧化铝胶混合后制成疫苗。

四、水貂病毒性肠炎病毒杆状病毒载体灭活疫苗检测方法

1.性状检验：静置后，上层为澄清液体，下层为白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2.无菌检验；按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

3.装量检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，100ml/瓶应不少于100ml。

4.安全检测：将肠炎VLP灭活疫苗皮下免疫健康易感水貂(抗MEV-HI值≤1：4)5只，3ml/只，连续观察10日，所有水貂应全部健活。

5.效力检测：下列方法任选其一。

血清学检测方法：将肠炎VLP灭活疫苗皮下免疫2～12月龄健康易感水貂(抗MEV-HI值≤1:4)5只，1ml/只，同时设置不接种对照水貂5只。免疫后14天采血，分离血清，分别测定抗MEV-HI抗体值。免疫水貂HI抗体效价均应不低于1:32，对照水貂HI抗体效价均应不高于1:4。

免疫攻毒法：将肠炎VLP灭活疫苗皮下免疫2～12月龄健康易感水貂(抗MEV-HI值≤1:4)5只，1ml/只，同时设置不接种对照水貂5只。免疫后14天，对所有水貂分别口服水貂肠炎病毒MEV-RC1株病毒液15ml(含15×107.0TCID50)，连续观察10日。免疫水貂应全部健活，对照组水貂应全部发病。

6.汞类防腐剂残留量测定：分别按现行《中国兽药典》附录进行测定，汞类防腐剂残留量为0.01％。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及到的重组杆状病毒是利用商业化试剂盒(购自BD公司)中所含载体pVL1393，通过载体改造的方法，将蜂毒素信号肽(HBM)和绝缘子(HS4)***到载体中的适当位置，再将水貂肠炎病毒衣壳蛋白(VP2)基因(该基因以本公司所拥有的商品化水貂肠炎病毒疫苗生产毒株RC1株作为模板制成，该商品化水貂肠炎病毒疫苗批准文号为：兽药生字(2011)150256020)***到上述改造载体的多克隆位点，然后与BaculoGold Linearizedbaculovirus DNA(杆状病毒基因组)共转染Sf9细胞，pVL1393质粒与BaculoGoldLinearized baculovirus DNA发生同源重组，目的基因***到杆状病毒基因组中形成环状的病毒基因组，然后组装成完整的病毒颗粒分泌到细胞外。未发生同源重组的病毒基因组因为其中含有一个致死性缺失突变，不能组装成完整病毒构建含有上述基因的重组杆状病毒基因组Bacmi，从而使得同源重组率在99％以上。然后通过噬斑实验进一步纯化挑选重组杆状病毒。该重组杆状病毒被命名为重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP2，该病毒于2013年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8051。

本发明的积极意义

本发明涉及一种水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗及其制备方法。本发明涉及疫苗的生产毒株是重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCC No.8051，该毒株系采用的表达载体为分泌表达，且含有6个组氨酸标签，易于蛋白检测分析用；用其作为生产毒株生产水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗，该疫苗不含病毒基因组，无动物安全危害和潜在散布性；免疫针对性强，能激发免疫动物产生足量的免疫抗体，并产生长久保护力。按照本发明提供的技术生产MEV病毒样颗粒，1000L生物反应器中收获的病毒液效价达到血凝价1∶4096～1∶32768，成颗粒蛋白表达量约65mg/L，每升病毒液半成品可以制成标准水貂疫苗3000～8000头份；该重组亚单位疫苗添加了佐剂，有效的提高了疫苗的免疫效果和免疫效价该疫苗安全、有效，质量稳定、可控，是一种明显优于现有技术生产的灭活组织疫苗的新疫苗。

附图说明：

图1人工合成的VP2基因经PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳，图中1：空白对照；2：VP2基因PCR扩增产物；M：DL2000DNA分子量标准。

图2人工合成的HS4绝缘子序列DNA片段经PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳。

图3重组转移载体质粒示意图。

图4杆状病毒侵染昆虫细胞(Sf9)表达MEV VP2蛋白表达的SDS凝胶电泳图，图中1：接毒后培养72h上清；2：接毒后培养96h上清；M：Marker；3：未接毒培养72h上清(阴性对照1)。

图5杆状病毒侵染昆虫细胞(Sf9)表达MEV VP2蛋白表达的Western blot分析，图中1：接毒后培养72h细胞悬液；2：接毒后培养72h细胞沉淀；M：Marker；3：接毒后培养72h上清。

图6凝胶法测重组杆状病毒的滴度

图7重组昆虫杆状病毒在昆虫细胞内表达的MEV病毒样颗粒的血凝效价

图8纯化后的病毒样颗粒电镜照片

具体实施方式：

通过下述给出的例子可以进一步清楚的理解本发明。但下述实施例子不是对本发明的限定。

实施例1

——重组杆状病毒种毒批制备

制备rBac-HBM-HS4-VP2P1种毒库(200支，1ml/支)：将纯化的P0代重组病毒，感染对数生长期Sf9细胞250mL，接毒MOI＝0.1～0.01，感染后96h收获上清，获得P1代种毒，具体操作同实施例3。将收集的P1代种毒取适量样品检测病毒滴度，其余分装到1.8ml细胞冻存管，每管加入1ml P1病毒和0.11ml胎牛血清(Invitrogen公司产品)。将上述分装好的冻存管放于超低温冰箱-80℃保存。

实施例2

——生产用种子批毒种的制备

将液氮冻存的Sf9细胞复苏后接种于250ml摇瓶，置27℃恒温摇床上培养，转速为110r/min。待细胞密度达到3.0×10⁶cells/ml以上时，按照1:2比例放大到1L摇瓶中，最终放大至3L摇瓶。3L摇瓶细胞达到2.0×10⁶cells/ml时，按MOI＝0.05～0.1接种rBac-HBM-HS4-VP2重组病毒，27℃悬浮培养96h左右，收获培养液，取样测定HA效价，定量分装，冷冻保存，即为生产用毒种批。注明收获日期、毒种代次等。

实施例3

——疫苗病毒液制备(以按本发明技术方案试生产的1311001批、1311002批、1311003批疫苗为例)

(1)复苏冻存Sf9细胞的种子细胞1ml于100ml无血清培养基中，置于500ml螺口玻璃三角摇瓶中培养，摇床温度27℃，转速110r/min。培养48h后补加200ml无血清培养基，稀释传代于3000ml螺口玻璃三角摇瓶中。培养48h后补加400ml无血清培养基。按照每48h，1∶2稀释比例传代至3000ml种子细胞，细胞密度达到3.0×10⁶cells/ml；

(2)上述3000ml种子细胞接种入30L搅拌式生物反应器(工作体积20L)培养条件设定为：接种密度：1.5×10⁶cells/ml，温度：27℃，pH：6.2，转速：60r/min，DO：45％。培养72～96h后，通过流加培养添加营养浓缩液，继续培养72h，细胞密度达到4.0～8.0×10⁶cells/m；

(3)将上述30L搅拌式生物反应器中的20L种子细胞直接接种入1000L生物反应器，逐步补加新鲜培养基至总培养体积750L，并通过流加培养工艺将细胞密度培养至2.0×10⁶cells/ml～4.0×10⁶cells/ml；

(4)利用三角摇瓶无血清全悬浮培养重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCCNo.8051，将其以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0.5～5.0接种入以上1000L生物反应器的培养的细胞中，培养72～140h；取样测定HA效价，猪红细胞凝集价为1:32765。

实施例4

——灭活及配苗(以按本发明技术方案试生产的1311001批、1311002批、1311003批疫苗为例)

将上述实施例3培养的病毒液置灭活容器中，在搅拌状态下加入浓度为1mol/L的BEI至终浓度为0.005mol/L，边加边搅拌，混合均匀后，保持37℃，灭活40～48h。灭活终止时，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的2mol/L硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)溶液，使其终浓度为0.005mol/L，充分搅拌均匀。灭活后的病毒液和氢氧化铝胶按9∶1的体积比进行配苗，使疫苗中氢氧化铝胶含量以氧化铝表示不超过3.9mg/ml，再加入1％的硫柳汞溶液，使其在疫苗中的终浓度为0.01％，充分搅拌后进行分装。

实施例5

——疫苗检验(以按本发明技术方案试生产的1311001批、1311002批、1311003批疫苗为例)

1.性状检验静置后，上层为澄清液体，下层为白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。

3.安全检测取49日龄健康易感水貂20只，随机分为4组，5只/组，第一组不接种，作为对照，后3组单剂量(4ml/只)分别接种不同批次的水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗疫苗，最后。各组隔离饲养14日，记录其精神、饮食、粪便、体温情况以及接种部位是否出现肿胀、坏死和全身不良反应。14日时剖杀所有水貂进行病理学检测，记录免疫后14天免疫水貂精神、体温、饮食、粪便情况；接种部位是否出现肿胀、坏死等反应；免疫后14日将所有水貂剖杀，观察并记录，是否存在水貂肠炎病毒引起的水貂病毒性肠炎病理变化，结果见表1。

表1水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗安全试验结果

4.效力检测：

(1)血清学检测方法

将肠炎VLP灭活疫苗皮下免疫2～12月龄健康易感水貂(抗MEV-HI值≤1:4)5只，1ml/只，同时设置不接种对照水貂5只。免疫后14天采血，分离血清，分别测定抗MEV抗体值。结果见表2。

表2水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗免疫后抗MEV抗体检测结果

(2)免疫攻毒法

将肠炎VLP灭活疫苗皮下免疫2～12月龄健康易感水貂(抗MEV-HI值≤1:4)5只，1ml/只，同时设置不接种对照水貂5只。免疫后14天，对所有水貂分别口服水貂肠炎病毒MEV-RC1株病毒液15ml(含1.5×10⁸ _. ⁰TCID₅₀)，连续观察10日，结果见表3。

表3水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗免疫后攻毒保护结果

Claims (3)

1.一种重组杆状病毒，其特征在于所述重组杆状病毒的转移载体包括：在pVL1393转移载体Poly A后的SnaB Ⅰ酶切位点***HS4序列，在多克隆位点之前***蜂毒素信号肽；在多克隆位点中***一个拷贝的MEV结构蛋白VP2基因；在外源基因的C端含有6个组氨酸的标签序列，该重组杆状病毒命名为重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP2，已于2013年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8051。

2.一种水貂病毒性肠炎亚单位疫苗的大规模制备方法，其特征在于该方法是由重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCC No.8051通过昆虫细胞培养表达能够诱导水貂产生针对水貂肠炎病毒感染的免疫应答的蛋白产物，其具体步骤为：

(1)利用三角摇瓶无血清全悬浮培养Sf9细胞制备种子细胞；

(2)利用三角摇瓶无血清全悬浮培养重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCCNo.8051；

(3)将种子细胞直接接种入搅拌式生物反应器全悬浮培养Sf9细胞，将生物反应器的培养规模放大至1吨细胞罐，并通过流加培养工艺将细胞密度培养至2.0×10⁶cells/ml～4.0×10⁶cells/ml；

(4)以感染复数为0.5～5.0接种病毒CGMCC No.8051，培养72～140h；

(5)收获上述培养液上清，经灭活、加入氢氧化铝胶混合后制成疫苗。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于全部培养过程均为单细胞全悬浮的、无血清、无蛋白的培养环境。