CN104328155A - 利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法及应用 - Google Patents

利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104328155A
CN104328155A CN201410664021.3A CN201410664021A CN104328155A CN 104328155 A CN104328155 A CN 104328155A CN 201410664021 A CN201410664021 A CN 201410664021A CN 104328155 A CN104328155 A CN 104328155A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pyrroloquinoline quinone
bacillus
oxidizing glucose
pqq
rich
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410664021.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104328155B (zh
Inventor
杨雪鹏
马科
胡仙妹
钟桂芳
叶建斌
刘寅
马歌丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University of Light Industry
Original Assignee
Zhengzhou University of Light Industry
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University of Light Industry filed Critical Zhengzhou University of Light Industry
Priority to CN201410664021.3A priority Critical patent/CN104328155B/zh
Publication of CN104328155A publication Critical patent/CN104328155A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104328155B publication Critical patent/CN104328155B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法，它的步骤如下：（1）将氧化葡萄糖杆菌DSM2003发酵，得到发酵液；（2）发酵液经高速离心，取上清液，经HP-20型大孔树脂色谱柱进行富集，得到富含吡咯喹啉醌的洗脱流份；（3）将富含吡咯喹啉醌的洗脱流份减压浓缩，经聚酰胺柱色谱纯化，得到吡咯喹啉醌纯品。本发明提供的氧化葡萄糖杆菌菌株在常规培养基和培养条件下，PQQ产量可达125mg/L，而且利用上述生产制备方法，条件简单，过程快捷，便于大规模工业化生产，对促进PQQ的产业化有重要意义。

Description

利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种微生物菌株的应用，具体的说是利用氧化葡萄糖菌DSM 2003生产制备吡咯喹啉醌的工艺。
背景技术
吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinine，PQQ）是一种水溶性醌类化合物，是葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的辅酶，被认为是新的B族维生素（Nature 2003；422:832）。PQQ分子量为330，最早是在微生物中发现，随后研究表明其也存在于动植物体内。 PQQ作为多种重要酶类的辅基，参与呼吸链中的电子传递，并能调节体内自由基水平。具有重要的生理功能，已知PQQ与神经***相关的功能有如下四种：(1)抗氧化，清除自由基；(2)影响呼吸链功能， 维护线粒体能量代谢；(3)刺激神经生长因子的分泌，修复和促进神经生长；(4)延缓α-synuclein蛋白的沉积，防止神经细胞纤维化。因此，有关研究人员认为 PQQ 对帕金森病和老年性痴呆等多种神经变性性疾病具有潜在的治疗价值。所以，寻找简单易行的获得PQQ的方法，进行产业化生产，对促进人类的身体健康具有重大的意义。
化学合成PQQ步骤多，产率低，异构体和副产品的去除需要多步纯化，并需用多种有毒试剂而污染环境（JACS，1981；103：5599-2600）。因此，一般认为生物学合成方法更具产业化意义。PQQ 广泛存在于革兰阴性菌中，但合成量却有所不同，有些菌只产生痕量 PQQ，供正常的生理代谢需求，如恶臭假单胞菌；还有些菌却能产生过量的 PQQ，并分泌到胞外。 迄今发现的能产生过量 PQQ 的野生菌包括无色杆菌属（Achromobacter）、交替单胞菌属（Alteromonas）、弯杆菌属（Ancylobacter）、生丝微菌属（Hy-phomicrobium）、甲烷单胞菌属（Methanomonas）、甲基菌属（Methy-lobacillus）、甲基单胞菌属（Methylomonas）、嗜甲基菌属（Methy-lophilus）、 甲基杆菌属 （Methylobacterium）、 微环菌属（Microcy-clus）、枝动菌属（Mycoplana）、假单胞菌属（Pseudomonas）、精朊杆菌属 （Protaminobacter）、 原单胞菌属 （Protomonas）、 硫杆菌属（Thiobacillus）及黄色杆菌属（Xanthobacter）等。目前，也有采用微生物发酵的方法生产PQQ，使用的原始菌种PQQ产量在0.07-7mg/L，发酵时间为2-5天左右（US Pat49943）。根据文献调研，目前并没有发现简单易行的从微生物发酵液中获取PQQ的方法，而实现PQQ的工业规模生产。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种可能大规模工业化生产制备吡咯喹啉醌的方法。
本发明的技术方案是：利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法，它的步骤如下：
（1）将氧化葡萄糖杆菌DSM 2003发酵，得到发酵液；
（2）发酵液经高速离心，取上清液，经HP-20型大孔树脂色谱柱进行富集，得到富含吡咯喹啉醌的洗脱流份；
（3）将富含吡咯喹啉醌的洗脱流份减压浓缩，经聚酰胺柱色谱纯化，得到吡咯喹啉醌纯品。
所述步骤（1）中将氧化葡萄糖杆菌发酵的操作如下：将氧化葡萄糖杆菌菌种按照5%的比例接入发酵培养基中，所述培养基每升含有45-55 g山梨醇、15-25 g酵母提取物、3-6 g (NH4)2SO4、3-5 g KH2PO4、4-6 g MgSO4·H2O，在28摄氏度下震荡培养3d。
所述步骤（2）中HP-20型大孔树脂色谱柱的条件是甲醇-水梯度洗脱，甲醇与水的体积比为0:1、1:9、7:34。
所述步骤（3）中聚酰胺柱色谱的条件是甲醇-水梯度洗脱，每100ml甲醇中含1ml氨水，甲醇与水的体积比为0:1、1:9。
氧化葡萄糖杆菌菌株在生产吡咯喹啉醌中的应用。
本发明提供的氧化葡萄糖杆菌菌株在常规培养基和培养条件下，PQQ产量可达125mg/L，而且利用上述生产制备方法，条件简单，过程快捷，便于大规模工业化生产，对促进PQQ的产业化有重要意义。
附图说明
图1 HP-20大孔树脂柱色谱富含PQQ流份HPLC检测，其中，A为对照品，B为样品；
图2 聚酰胺柱色谱各个流份TLC检测；
图3 产物的HPLC分析结果；
图4为PQQ产物的紫外光谱，其中，A为对照品，B为样品；
图5为PQQ产物的质谱。
具体实施方式
利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法，它的步骤如下：
（1）氧化葡萄糖菌发酵培养
将菌种按照5%的比例接入发酵培养基（每升含有40 g山梨醇、20 g酵母提取物、5 g (NH4)2SO4、2 g KH2PO4、5 g MgSO4·H2O）中，在28℃下震荡培养3d。发酵罐培养时按照10%接种，培养基浓度为正常2倍。将菌种接种至富集培养基，28℃下震荡培养5d，培养物5℃9000r/min离心15分钟，得到含有PQQ的上清液。
（2） PQQ的富集纯化
上清液上HP-20型大孔树脂色谱柱，用甲醇-水梯度洗脱（0%，10%，70%，v/v），每个梯度洗脱10个柱体积，经HPLC检测，发现70%洗脱部位富含PQQ，将其减压浓缩至无醇味。
（3） PQQ的富集纯化
得到上述富含PQQ浓缩液后，上聚酰胺色谱柱，甲醇-水梯度洗脱（95%， 0%，水含1%氢氧化钠），经TLC检测，得到目标产物PQQ。
（4）产物分析
①产物的HPLC检测，采用Waters Symmetry 300 C18反向色谱柱，以乙腈：水（乙腈和水均含2%甲酸）为流动相，流速1ml/min，梯度洗脱（30-90%，30min），检测波长254nm，可以得到较好的色谱分析结果。结果表明，产物为纯度达到99%以上的PQQ样品。
② 产物氢谱数据，通过文献报道PQQ氢谱数据对比，结果表明，样品与其完全一致。

Claims (5)

1.利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，它的步骤如下：
（1）将氧化葡萄糖杆菌DSM 2003发酵，得到发酵液；
（2）发酵液经高速离心，取上清液，经HP-20型大孔树脂色谱柱进行富集，得到富含吡咯喹啉醌的洗脱流份；
（3）将富含吡咯喹啉醌的洗脱流份减压浓缩，经聚酰胺柱色谱纯化，得到吡咯喹啉醌纯品。
2.根据权利要求1所述的利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法，其特征在于：所述步骤（1）中将氧化葡萄糖杆菌发酵的操作如下：将氧化葡萄糖杆菌菌种按照5%的比例接入发酵培养基中，所述培养基每升含有45-55 g山梨醇、15-25 g酵母提取物、3-6 g (NH4)2SO4、3-5 g KH2PO4、4-6 g MgSO4·H2O，在28摄氏度下震荡培养3d。
3.根据权利要求1所述的利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法，其特征在于：所述步骤（2）中HP-20型大孔树脂色谱柱的条件是甲醇-水梯度洗脱，甲醇与水的体积比为0:1、1:9、7:34。
4.根据权利要求1所述的利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法，其特征在于：所述步骤（3）中聚酰胺柱色谱的条件是甲醇-水梯度洗脱，每100ml甲醇中含1ml氨水，甲醇与水的体积比为0:1、1:9。
5.氧化葡萄糖杆菌菌株在生产吡咯喹啉醌中的应用。
CN201410664021.3A 2014-11-20 2014-11-20 利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法及应用 Active CN104328155B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410664021.3A CN104328155B (zh) 2014-11-20 2014-11-20 利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410664021.3A CN104328155B (zh) 2014-11-20 2014-11-20 利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104328155A true CN104328155A (zh) 2015-02-04
CN104328155B CN104328155B (zh) 2019-06-28

Family

ID=52402959

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410664021.3A Active CN104328155B (zh) 2014-11-20 2014-11-20 利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104328155B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104745513A (zh) * 2015-04-01 2015-07-01 福建师范大学 一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用
CN105294687A (zh) * 2015-12-02 2016-02-03 郑州轻工业学院 离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法
CN106282044A (zh) * 2015-05-20 2017-01-04 浙江海正药业股份有限公司 一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法
CN107056782A (zh) * 2017-06-13 2017-08-18 福建师范大学 一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用
CN108949846A (zh) * 2018-08-01 2018-12-07 安徽新熙盟生物科技有限公司 一种高密度发酵提高pqq产率的方法
CN109943601A (zh) * 2019-03-29 2019-06-28 马科 利用2-酮基-l古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法
CN110698472A (zh) * 2019-09-11 2020-01-17 北大方正集团有限公司 一种吡咯喹啉醌的纯化方法
CN112194658A (zh) * 2020-10-23 2021-01-08 内蒙古拜克生物有限公司 一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1329004A (zh) * 2000-06-20 2002-01-02 武汉大学 吡咯喹啉醌的提取方法
CN102146123A (zh) * 2010-12-07 2011-08-10 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 氧化葡糖杆菌吡咯喹啉醌合成蛋白***及其编码的基因簇

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1329004A (zh) * 2000-06-20 2002-01-02 武汉大学 吡咯喹啉醌的提取方法
CN102146123A (zh) * 2010-12-07 2011-08-10 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 氧化葡糖杆菌吡咯喹啉醌合成蛋白***及其编码的基因簇

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FELDER M: "The pyrroloquinoline quinone synthesis genes of Gluconobacter oxydans.", 《FEMS MICROBIOL LETT》 *
HOLSCHER T: "Knockout and overexpression of pyrroloquinoline quinone biosynthetic genes in Gluconobacter oxydans 621H.", 《J BACTERIOL》 *
张晓玲: "一株产吡咯喹啉醌南极海洋细菌的分离鉴定及生物活性", 《海洋渔业》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104745513A (zh) * 2015-04-01 2015-07-01 福建师范大学 一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用
CN104745513B (zh) * 2015-04-01 2017-09-22 福建师范大学 一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用
CN106282044A (zh) * 2015-05-20 2017-01-04 浙江海正药业股份有限公司 一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法
CN106282044B (zh) * 2015-05-20 2019-10-29 浙江海正药业股份有限公司 一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法
CN105294687A (zh) * 2015-12-02 2016-02-03 郑州轻工业学院 离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法
CN107056782A (zh) * 2017-06-13 2017-08-18 福建师范大学 一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用
CN107056782B (zh) * 2017-06-13 2019-05-14 福建师范大学 一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用
CN108949846A (zh) * 2018-08-01 2018-12-07 安徽新熙盟生物科技有限公司 一种高密度发酵提高pqq产率的方法
CN109943601A (zh) * 2019-03-29 2019-06-28 马科 利用2-酮基-l古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法
CN109943601B (zh) * 2019-03-29 2022-09-09 新拓洋生物工程有限公司 利用2-酮基-l古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法
CN110698472A (zh) * 2019-09-11 2020-01-17 北大方正集团有限公司 一种吡咯喹啉醌的纯化方法
CN112194658A (zh) * 2020-10-23 2021-01-08 内蒙古拜克生物有限公司 一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104328155B (zh) 2019-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104328155A (zh) 利用氧化葡萄糖杆菌生产吡咯喹啉醌的方法及应用
CN111304106B (zh) 一株克劳氏芽孢杆菌及使用其生产四氢嘧啶的方法
CN104342390B (zh) 一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用
CN103409485A (zh) 一种通过流加有机氮源提高腺苷发酵产量的方法
CN103224965B (zh) 一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法及所用的发酵培养基
CN103320362B (zh) 一株产谷氨酸脱羧酶的菌株及用其生产γ-氨基丁酸的方法
CN103898011B (zh) 一种甲基营养菌及其发酵生产吡咯喹啉醌的方法
CN104892597A (zh) 络合萃取法分离纯化发酵液中的吡咯喹啉醌
CN102719378B (zh) 一种微生物催化不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法
US20160160250A1 (en) Hyphomicrobium sp. microorganism and method of producing pyrroloquinoline quinone using the same
CN103224963B (zh) 一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法
EP3904524A1 (en) Method for biosynthesizing monoethanolamine
Hernandez et al. Potential of solid state fermentation for production of ergot alkaloids
CN104531810B (zh) 一种高效微生物转化制备麦芽糖酸的方法
CN103045504A (zh) 微生物催化制备(2s, 3r)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯及菌株
CN103146595B (zh) 一种枯草芽孢杆菌及用于发酵生产d-核糖的方法
CN110257451B (zh) 一种促进青蒿酸积累的方法
CN103409486A (zh) 一种通过流加次黄嘌呤提高腺苷发酵产量的方法
CN108611383A (zh) 一种提高青蒿酸发酵产量的方法
CN100547067C (zh) 表皮短杆菌zjb-07021及其在制备(s)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用
CN110195032B (zh) 生丝微菌lxl-pq-409及其应用
CN105567756A (zh) 一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法
CN104630188A (zh) 海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法
KR101808429B1 (ko) 미생물 분리배양 장치 및 미생물 배양 폐배지 재사용 방법
WO2017076273A1 (zh) 添加人工合成的前体物制备吡咯喹啉醌的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant