CN106282044B - 一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法。本发明的高产吡咯喹啉醌的菌株生丝微菌1112‑NTG‑2318(Hyphomicrobium sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10709。本发明的吡咯喹啉醌的制备方法为将生丝微菌CGMCC No.10709在发酵培养基中发酵，从发酵液中获得吡咯喹啉醌，该制备方法在80m3罐上发酵效价能达到1783mg/L，有利于吡咯喹啉醌的产业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种生丝微菌及其发酵生产吡咯喹啉醌的方法。
背景技术
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone)，简称PQQ，是第14种B族维生素。
吡咯喹啉醌的化学结构如下：
日本学者于2003年证实吡咯喹啉醌完全符合维生素特征，是一种新型的水溶性维生素，其研究成果发表于国际权威杂志《nature》上，这是55年来首次发现的最新的维生素。吡咯喹啉醌是一种新辅基，是继黄素核苷酸(FMN，FAD)和烟酰胺核苷酸(MAD，NADP)之后，在膜束缚的细菌脱氢酶中发现的第三种辅基。
吡咯喹啉醌化合物最先是从细菌中分出来的，随后在动、植物体内也被发现了。已知能够产生吡咯喹啉醌的生物包括有乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、鞭毛甲基菌(Methylobacteriu flagellatum)、扭脱甲基杆菌(MethylobacteriumExtorquens)、生丝微菌(Hyphomicrobium sp.)、食甲基菌(Methylovorus sp.)等，本发明人所获得的吡咯喹啉醌产生菌为生丝微菌(Hyphomicrobium sp.)。现有技术中使用生丝微菌生产吡咯喹啉醌的发酵效价普遍偏低，US5344768(授权日1993年7月14日)报道用生丝微菌进行发酵生产吡咯喹啉醌，其发酵效价仅为7mg/L，远远无法达到产业化的需求。
吡咯喹啉醌具有预防和治疗某些疾病等生物学功能。在原核生物、植物和哺乳动物中，都广泛存在着吡咯喹啉醌，它不仅是许多酶的辅基，在酶促反应中担负着传递电子、质子和化学基团的功能，也能刺激微生物的生长，植物花粉的萌发，促进植物的生长。
近年来,对于吡咯喹啉醌的分布状况、产生机理、结构、功能和生物学性质研究以及以吡咯喹啉醌作为新药的研究工作在国际上非常很活跃。吡咯喹啉醌在食品、轻工、农业和医药等方面的应用也具有重要实践意义。
日本东京农工大学研究人员报道吡咯喹啉醌能够抑制帕金森氏症致病蛋白的凝集。研究人员根据这个基本原理利用帕金森氏症模型动物开展深入研究，开发了改善该疾病症状的药物。
科学家们还发现吡咯喹啉醌作为人类发育的必要因子，刺激人体细胞生长，如人体B细胞、T细胞，使之产生抗体，从而提高人体免疫功能。
吡咯喹啉醌能显著降低血清胆红素，谷丙转氨酶水平，保持肝功能正常，并能有效防治肝损伤，如治疗铅中毒和脂肪肝。
吡咯喹啉醌具有很强的自由基清除能力，其清除O2·和·OH能力较抗坏血酸高50～100倍，能防治自由基过多造成的机体损害并引发各种疾病，如心脏病、癌症以及各类炎症。
NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)为微生物育种中常用的烷化剂，有超级诱变剂之称。烷化剂带有活性烷基，此基团能够转移到其它电子密度高的分子上去，使碱基许多位置上增加了烷基，从而在多方面改变氢键的能力。依靠NTG诱发的突变主要是GC—AT转换以及小范围切除、移码突变及GC对的缺失。
通过对吡咯喹啉醌菌种的诱变及甲醇耐受筛选，提高了其产生目标产物的能力，为该产品的商业化奠定了基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对目前吡咯喹啉醌生产上发酵效价普遍偏低，达不到工业化生产需求的缺陷，提供一种生丝微菌1112-NTG-2318及其发酵获得吡咯喹啉醌的方法，所述的生丝微菌1112-NTG-2318在配套的发酵工艺下产吡咯喹啉醌的能力强，菌种性能稳定，具有很好的商业价值；所述的方法可以简便地获得大量的吡咯喹啉醌，有利于产业化生产。
本发明的技术方案之一是：一种生丝微菌(Hyphomicrobium sp.)1112-NTG-2318，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.10709。
所述的生丝微菌CGMCC No.10709，是以生丝微菌1112-NTG-1953(Hyphomicrobiumsp.)为出发菌株，该出发菌种为从荷兰(Netherlands)的土壤样品中分离获得的菌种1112-O-36经筛选后得到。对1112-NTG-1953进行NTG诱变，并在高甲醇浓度平板上进行筛选，获得具有高产吡咯喹啉醌特性的菌株CGMCC No.10709，对该菌株进行鉴定，为生丝微菌(Hyphomicrobium sp.)，命名为1112-NTG-2318。该菌株已于2015年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并收到保藏中心登记入册编号CGMCCNo.10709，其具有以下的微生物学特性：
1、形态学的特性
在显微镜下观察在固体培养基中培养的菌株时，细胞呈杆状，大小为(0.5-1.0)μm×(1-3)μm，不产生芽孢，革兰氏染色呈阴性。
2、培养学的特性
当在14～28℃、pH6.0～7.5下，菌体生长良好，超过该范围会出现生长差或不生长的情况。
3、生理特性
可以很好的利用D-葡萄糖、D-山梨醇、甘油、D-蔗糖、木聚糖；可以有效的利用D-棉籽糖、D-木糖、L-***糖、麦芽糖、D-果糖、D-乳糖、半乳糖、肌醇、甘氨酸和鼠李糖；能有效的利用铵盐类无机氮源，无法利用硝酸盐类无机氮源；能进行明胶液化及硝酸盐还原；无过氧化氢酶、氧化酶活性；对NaCl不耐受；
本发明的技术方案之二是：一种制备吡咯喹啉醌的方法，将所述的生丝微菌CGMCCNo.10709在发酵培养基中发酵，即从发酵液中获得吡咯喹啉醌。
该方法所述的发酵培养周期为本领域常规的时间，较佳地，发酵培养周期为144-240h，更佳地为192-240h。本发明所述的发酵温度为本领域常规的温度，较佳地为26-30℃。
所述发酵在小试发酵罐中进行，所述小试发酵罐的体积为本领域常规的体积。搅拌转速为本领域常规的转速，较佳地为200～600rpm。溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为大于5％，所述的百分比为发酵罐中发酵液的含氧量占该温度下饱和含氧量的百分比。空气流量为本领域常规的空气流量，较佳地为0.5～1.5vvm。
所述发酵在中试发酵罐中进行，所述中试发酵罐的质量为本领域常规的质量。搅拌转速为本领域常规的转速，较佳地为50～180rpm。溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为大于5％，所述的百分比为发酵罐中发酵液的含氧量占该温度下饱和含氧量的百分比。空气流量为本领域常规的空气流量，较佳地为0.3～1.0vvm。
所述发酵在产业化发酵罐中进行，所述产业化发酵罐的质量为本领域常规的质量。搅拌转速为本领域常规的转速，较佳地为30～120rpm。溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为大于5％，所述的百分比为发酵罐中发酵液的含氧量占该温度下饱和含氧量的百分比。空气流量为本领域常规的空气流量，较佳地为0.2～0.8vvm。
所述发酵培养基中，种子液的移种量为本领域常规的移种量，较佳地为10～12％，所述的百分比为体积百分比。
其还包括如下的步骤：在发酵过程中补加甲醇的发酵工艺。
其中，所述甲醇占所述发酵培养基的含量为本领域常规的含量，较佳地为12～35％，更佳地为15～32％，最佳地为20～27％，所述百分比为重量百分比。
本发明的技术方案之三是：一种用于发酵所述的生丝微菌CGMCC No.10709获得吡咯喹啉醌的发酵培养基，包括碳源、氮源、无机盐及微量元素；其中，碳源为甲醇、盐酸甲胺、葡萄糖、甘油、山梨醇中的一种或多种；所述的氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素、蛋白胨、酵母抽提粉中的一种或多种；所述的无机盐及微量元素为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、七水硫酸镁、四水硫酸锰、七水硫酸锌、柠檬酸铁的一种或多种。和/或，所述的发酵培养基的pH为本领域常规的pH，较佳地为6.7～7.6。较佳地，所述的发酵培养基还包括消泡剂，较佳地为SAG622。
更佳地，所述的发酵培养基包括如下的组分(g/L)：甲醇2.0-20.0，硫酸铵2.0-10.0，酵母抽提粉2.0-10.0，磷酸二氢钾1.0-8.0，磷酸氢二钠1.0-8.0，七水硫酸镁0.5-1.5，二水氯化钙0.02-0.10，四水硫酸锰0.02-0.10，七水硫酸锌0.02-0.10，消泡剂0-0.8，pH6.7-7.6；最佳地，包括如下的组分(g/L)：甲醇12.0，硫酸铵5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氢钾2.0，磷酸氢二钠5.0，七水硫酸镁0.6，二水氯化钙0.06，四水硫酸锰0.08，七水硫酸锌0.1，SAG6220.6，pH7.2。
本发明的技术方案之四是：一种获得所述的生丝微菌CGMCC No.10709的方法，其包括以下的步骤，在培养基中培养所述的生丝微菌CGMCC No.10709即可。
其中，所述的培养基为本领域常规的培养基，能够生长所述的生丝微菌CGMCCNo.10709即可，较佳地，所述的培养基为上述的发酵培养基。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的NTG诱变的吡咯喹啉醌高产菌株生丝微菌CGMCC No.10709，遗传性状稳定，重现性好，放大易于实现，具有优良的商业应用价值。本发明所述的发酵制造吡咯喹啉醌的方法，综合调整了发酵配方、发酵控制工艺，并且针对甲醇进行补加和残留量控制，在80m3罐上发酵效价达到1783mg/L，在规模上和技术水平上高于现有文献报道，有利于吡咯喹啉醌的产业化生产。
生物材料保藏信息
本发明的生丝微菌CGMCC No.10709，已于2015年4月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10709，生物材料(株)为1112-NTG-2318，分类命名是生丝微菌Hyphomicrobium sp.。
附图说明
图1为实施例1生丝微菌CGMCC No.10709产生的吡咯喹啉醌HPLC图谱。
图2为实施例1生丝微菌CGMCC No.10709产生的吡咯喹啉醌ESI-MS图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1、高产菌株生丝微菌CGMCC No.10709(Hyphomicrobium sp.)的制备
取试验菌种1112-NTG-1953，该菌种为从荷兰(Netherlands)的土壤样品中分离获得TK0415T(赋予编号1112-O-36)经过自然筛选及UV诱变筛选得到。(菌种TK 0415T参见Teizi Urakami,Junko Sasaki,Ken-Ichiro Suzuki,etc.,Characterization andDescription of Hyphomicrobium denitrificans sp.nov.,International Journal OfSystematic Bacteriology,Vol.45,No.3,p.528-532,July 1995)
吸取甘油管菌悬液涂布于试管斜面上，斜面培养基为(g/L)：硫酸铵1.00、七水硫酸镁0.20、磷酸二氢钠0.50、磷酸氢二钾1.55、甲醇1.20、琼脂15.00，pH7.2，26-30℃培养4d。刮取斜面菌体，制备试验菌种菌悬液，用于诱变处理。
精确称取10.0mg的NTG溶于lmL丙酮，加入菌悬液使NTG终浓度达到1.0mg/L。4℃缓慢震荡处理15min，离心弃上清，用无菌生理盐水打散，重复洗涤2次，使其终止反应。
吸取含有诱变过的液体培养基至含有15g/L甲醇的培养皿上进行涂布培养。培养温度26-30℃，培养周期为4d。计算结果显示致死率达到82％。
从培养皿上挑取单菌落，分别进种子瓶，种子培养基为(g/L)，硫酸铵2.0，磷酸二氢钾1.6，磷酸氢二钠2.8，七水硫酸镁0.3，甲醇1.2，pH7.0。培养温度28℃，摇床转速250rpm，培养2d后；逐一进250ml发酵摇瓶培养4d，并以前一代的菌株作为对照同时培养。
其中，发酵培养基为(g/L)：甲醇12.0，硫酸铵5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氢钾2.0，磷酸氢二钠5.0，七水硫酸镁0.6，二水氯化钙0.06，四水硫酸锰0.08，七水硫酸锌0.1，pH6.7。
摇瓶发酵工艺：发酵摇瓶装量20ml/250ml，移种量为10％，培养温度为26-30℃，培养湿度为40-60％，摇床振幅为5cm，摇床转速为200rpm，培养周期为120h。发酵结束后HPLC检测吡咯喹啉醌含量。
从菌株1112-O-36开始计算，共筛选了2318株菌株，得到一株高产突变株1112-NTG-2318，其摇瓶发酵效价为122mg/L，复筛(即按照相同的条件再进行一次摇瓶，进行发酵培养)后摇瓶发酵效价113mg/L，其HPLC图谱如图1所示。将发酵得到的发酵液进行分离提纯(分离提纯的步骤参见：Minoru Ameyama,Masaharu Hayashi,etc.,Microbial Productionof Pyrroloquinoline Quinone,Agric.Biol Chem.,48(2),561-565,1984)，提纯后的吡咯喹啉醌的ESI/MS图谱如图2所示。筛选前的菌株1112-O-36的效价为7mg/L，从发酵结果上看，该菌株1112-NTG-2318比筛选前的菌株1112-O-36发酵单位提高约15倍。
实施例2：生丝微菌CGMCC No.10709在50L罐上的发酵小试工艺研究
以250ml摇瓶获得的工艺参数为基础，参考该突变菌株CGMCC No.10709的特性，设计50L罐发酵工艺并进行优化。考察突变株生长代谢情况和吡咯喹啉醌的最佳产素能力。
种子培养基(g/L)，即硫酸铵2.0，磷酸二氢钾1.6，磷酸氢二钠2.8，七水硫酸镁0.3，甲醇1.2，pH7.0。
种子罐工艺控制：种子培养基装量为10/15L，培养温度26-30℃，搅拌转速200-500rpm，溶氧大于15％，空气流量0.5-2.0，培养周期3天。
发酵培养基(g/L)，即甲醇12.0，硫酸铵5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氢钾2.0，磷酸氢二钠5.0，七水硫酸镁0.6，二水氯化钙0.06，四水硫酸锰0.08，七水硫酸锌0.1，SAG6220.6，pH7.2。
发酵罐工艺控制：发酵培养基的装量为30/50L，移种量为12％，培养温度26-30℃，搅拌转速200-600rpm，溶氧大于5％，空气流量0.5-1.5vvm，培养周期144h。
发酵补料控制：流加甲醇及控制pH7.2，累计补入甲醇12％，其中百分比是指重量百分比。
发酵过程中同时进行溶氨、甲醇、OD、pH及发酵效价等的检测。发酵结果放罐效价达到1351mg/L。
实施例3：生丝微菌CGMCC No.10709在50L罐上的发酵小试工艺研究
以实施例2的工艺参数为基础，设计50L罐发酵工艺并进行优化。考察突变株生长代谢情况和吡咯喹啉醌的最佳产素能力。
种子培养基(g/L)，即硫酸铵2.0，磷酸二氢钾1.6，磷酸氢二钠2.8，七水硫酸镁0.3，甲醇1.2，pH7.0。
种子罐工艺控制：种子培养基装量为10/15L，培养温度26-30℃，搅拌转速200-500rpm，溶氧大于15％，空气流量0.5-2.0，培养周期3天。
发酵培养基(g/L)，即甲醇12.0，硫酸铵5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氢钾2.0，磷酸氢二钠5.0，七水硫酸镁0.6，二水氯化钙0.06，四水硫酸锰0.08，七水硫酸锌0.1，SAG6220.6，pH7.6。
发酵罐工艺控制：发酵培养基的装量为30/50L，移种量为10％，培养温度26-30℃，搅拌转速200-600rpm，溶氧大于5％，空气流量0.5-1.5vvm，培养周期240h。
发酵补料控制：流加甲醇及控制pH7.6，累计补入甲醇15％，其中百分比是指重量百分比。
发酵过程中同时进行溶氨、甲醇、OD、pH及发酵效价等的检测。发酵结果放罐效价达到1532mg/L。
实施例4：菌株CGMCC No.10709的形态学和培养学特征
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌***鉴定手册》、《分子克隆实验指南》及《中国药典》(2010版XIH)等书中的有关内容进行实验。
培养特征：采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、高氏一号、苹果酸钙、营养琼脂、YMS和查氏培养基10种培养基(从浙江海正药业股份有限公司处获得)，28℃培养7～10天后，观察菌丝体的颜色及色素情况(见表1)。
表1 菌株CGMCC No.10709在10种培养基上的培养特征
表一的结果说明：该菌种在营养琼脂上生长良好，在ISP3上不生长，在不同的培养基上，基本上表现相同的外观、色素。
实施例5：菌株CGMCC No.10709的生理生化特征
除温度实验外，均为28℃培养5～7天。
a)碳源的利用：采用ISP9作为基础培养基，各种碳源的终浓度均为1.0％，所述的百分比为质量百分比，其结果见表2，结果说明：菌种CGMCC No.10709可以很好的利用D-葡萄糖、D-山梨醇、甘油、D-蔗糖、木聚糖；可以有效的利用D-棉籽糖、D-木糖、L-***糖、麦芽糖、D-果糖、D-乳糖、半乳糖、肌醇、甘氨酸和鼠李糖
b)无机氮源的利用：采用ISP9作为基础培养基，硝酸钾和硫酸铵的浓度均为0.1％，所述的百分比为质量百分比，其结果见表2，结果说明：菌种CGMCC No.10709可以有效的利用铵盐类无机氮源，无法利用硝酸盐类无机氮源。
c)降解试验和NaCl耐受实验采用基础培养基为GYEA(pH6.8)，各种降解物的浓度见表3，结果说明：除腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤外，在其他供试降解物上生长良好；在降解方面，CGMCC No.10709对供试降解物都无降解作用。相关降解物的百分比为质量百分比。NaCl耐受的结果见表7，结果说明：菌种CGMCC No.10709对NaCl不耐受。
d)氧化酶和过氧化氢酶试验、pH试验和温度试验均采用营养琼脂培养基。氧化酶和过氧化氢酶试验试验结果见表4，结果说明：CGMCC No.10709无过氧化氢酶、氧化酶活性。pH试验结果见表5，结果说明：生长较适pH为6.0-7.5；温度试验见表6，结果说明：14-28℃生长良好。
e)M.R、V-P和脲酶实验采用《常见细菌***鉴定手册》方法。M.R、V-P和脲酶实验实验结果见表4，结果说明：菌种CGMCC No.10709能进行明胶液化及硝酸盐还原。
表2 菌株CGMCC No.10709的碳源和氮源的利用情况
表3 菌株CGMCC No.10709的降解试验结果
表4 菌株CGMCC No.10709主要的生理生化特征
表5 菌株CGMCC No.10709生长的pH试验
表6 菌株CGMCC No.10709生长的温度试验
表7 菌株CGMCC No.10709对NaCl的耐受性
*注：0，无生长；1，生长很弱；2，能生长，有少量孢子；3，生长良好，有大量孢子；4，生长最好，有丰富孢子；+，阳性；-，阴性。
由实施例4～5的数据说明，所述生丝微菌CGMCC No.10709具有以下的微生物学特性：
1、形态学的特性
在显微镜下观察在固体培养基中培养的菌株时，细胞呈杆状，大小为(0.5-1.0)μm×(1.0-3.0)μm，不产生芽孢，革兰氏染色呈阴性。
2、培养学的特性
当在14～28℃、pH6.0～7.5下，菌体生长良好，超过该范围会出现生长差或不生长的情况。在ISP1、ISP2、ISP4、ISP5、高氏一号、苹果酸钙、营养琼脂、YMS和查氏培养基等不同的培养基上，基本上表现相同的外观、色素。
3、生理特性
可以很好的利用D-葡萄糖、D-山梨醇、甘油、D-蔗糖、木聚糖；可以有效的利用D-棉籽糖、D-木糖、L-***糖、麦芽糖、D-果糖、D-乳糖、半乳糖、肌醇、甘氨酸和鼠李糖；能有效的利用铵盐类无机氮源，无法利用硝酸盐类无机氮源；能进行明胶液化及硝酸盐还原；无过氧化氢酶、氧化酶活性；对NaCl不耐受；
实施例6：菌株CGMCC No.10709的16S rDNA序列分析
16S rDNA序列分析：菌株CGMCC No.10709的16S rDNA序列与GenBank中相关序列进行BLAST比较的结果见表8(表中只列出同源性较高的菌株)。
表8 菌株CGMCC No.10709和相关菌株的同源性
对菌株CGMCC No.10709进行16S rDNA测序，测序结果如序列表SEQ ID No.1所示。将如序列表SEQ ID No.1所示的菌株CGMCC No.10709的16S rDNA序列与生丝微菌属(Hyphomicrobium sp.)的16S rDNA序列进行比对，比对结果发现，菌株CGMCC No.10709和生丝微菌属(Hyphomicrobium sp.)有很高同源性，最高的达99.7％。同时通过菌株CGMCCNo.10709的表观特征试验，发现该菌株和生丝微菌属(Hyphomicrobium sp.)分类相关参数非常接近，故将CGMCC No.10709菌株鉴定为生丝微菌属(Hyphomicrobium sp.)的菌株。
实施例7：菌株CGMCC No.10709在15m3罐上的发酵放大
根据50L发酵罐获得的工艺参数及该突变菌株CGMCC No.10709的特性，设计15m3罐发酵工艺并进行优化。考察突变株在中试规模下的生长代谢情况和吡咯喹啉醌的最佳产素能力。
种子培养基(g/L)，即硫酸铵2.0，磷酸二氢钾1.6，磷酸氢二钠2.8，七水硫酸镁0.3，甲醇1.2，pH7.0。
种子罐工艺控制：种子培养基装量为1.3/3.0m3，培养温度26-30℃，搅拌转速50-200rpm，溶氧大于15％，空气流量0.2-1.0vvm，培养周期3天。
发酵培养基(g/L)，即甲醇12.0，硫酸铵5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氢钾2.0，磷酸氢二钠5.0，七水硫酸镁0.6，二水氯化钙0.06，四水硫酸锰0.08，七水硫酸锌0.1，SAG6220.6，pH7.2。
发酵罐工艺控制：发酵培养基的装量为10/15m3，移种量为12％，培养温度26-30℃，搅拌转速50-180rpm，溶氧大于5％，空气流量0.3-1.0vvm，培养周期192h。
发酵补料控制：流加甲醇及控制pH7.2，累计补入甲醇20％。
发酵过程中同时进行溶氨、甲醇、OD、pH及发酵效价等的检测。发酵结果放罐效价达到1625mg/L。
实施例8：菌株CGMCC No.10709在80m3罐上的发酵放大
根据15m3发酵罐获得的工艺参数及该突变菌株CGMCC No.10709的特性，设计80m3罐发酵工艺并进行优化。考察突变株在产业化规模下的生长代谢情况和吡咯喹啉醌的最佳产素能力。
种子培养基(g/L)，即硫酸铵2.0，磷酸二氢钾1.6，磷酸氢二钠2.8，七水硫酸镁0.3，甲醇1.2，pH7.0。
种子罐工艺控制：种子培养基装量为7/12m3，培养温度26-30℃，搅拌转速30-150rpm，溶氧大于15％，空气流量0.2-0.8vvm，培养周期3天。
发酵培养基(g/L)，即甲醇12.0，硫酸铵5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氢钾2.0，磷酸氢二钠5.0，七水硫酸镁0.6，二水氯化钙0.06，四水硫酸锰0.08，七水硫酸锌0.1，SAG6220.6，pH7.5。
发酵罐工艺控制：发酵培养基的装量为50/80m3，移种量为10％，培养温度26-30℃，搅拌转速30-120rpm，溶氧大于5％，空气流量0.2-0.8vvm，培养周期240h。
发酵补料控制：流加甲醇及控制pH7.2，累计补入甲醇27％。
发酵过程中同时进行溶氨、甲醇、OD、pH及发酵效价等的检测。发酵结果放罐效价达到1783mg/L。
Claims (9)
1.一种生丝微菌(Hyphomicrobium sp.)，其特征在于：其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10709。
2.一种制备吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的生丝微菌CGMCCNo.10709在发酵培养基中发酵，从发酵液中获得吡咯喹啉醌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养周期为144-240h，所述发酵的培养温度为26-30℃。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵在小试发酵罐中进行，搅拌转速为200～600rpm，溶氧量为大于5％，空气流量为0.5～1.5vvm；或，所述发酵在中试发酵罐中进行，搅拌转速为50～180rpm，溶氧量为大于5％，空气流量为0.3～1.0vvm；或，所述发酵在产业化罐中进行，搅拌转速为30～120rpm，溶氧量为大于5％，空气流量为0.2～0.8vvm。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中，种子液的移种量为10～12％。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括在发酵过程中补加甲醇的发酵工艺。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述甲醇占所述发酵培养基的含量为12～35％。
8.根据权利要求2所述的一种制备吡咯喹啉醌的方法，其特征在于所述的发酵培养基包括如下的组分(g/L)：甲醇2.0-20.0，硫酸铵2.0-10.0，酵母抽提粉2.0-10.0，磷酸二氢钾1.0-8.0，磷酸氢二钠1.0-8.0，七水硫酸镁0.5-1.5，二水氯化钙0.02-0.10，四水硫酸锰0.02-0.10，七水硫酸锌0.02-0.10，消泡剂0-0.8，pH6.7-7.6。
9.根据权利要求8所述的一种制备吡咯喹啉醌的方法，其特征在于所述的发酵培养基包括如下的组分(g/L)：甲醇12.0，硫酸铵5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氢钾2.0，磷酸氢二钠5.0，七水硫酸镁0.6，二水氯化钙0.06，四水硫酸锰0.08，七水硫酸锌0.1，SAG622 0.6，pH7.2。
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