CN104257715B - 万年蒿提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种万年蒿提取物，其中含有总黄酮化合物。总黄酮化合物包括以下一种或几种：6‑甲氧基‑槲皮万寿菊素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、槲皮素‑3‑O‑β‑D葡萄糖苷、异鼠李素、万寿菊素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、金合欢素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、芦丁、5，7，4′‑三羟基黄酮、3，3’，4’，5，7‑五羟基黄酮、5，7，4′‑三羟基‑3′‑甲氧基黄酮、山奈酚、3，5，7，4′‑四羟基‑6‑甲氧基黄酮、3’，4’，5，7‑四羟基黄酮、5，7，4′‑三羟基‑6，3′‑二甲氧基黄酮、5，7，4′‑三羟基‑6‑甲氧基黄酮、槲皮苷、7，3′，4′‑三甲基槲皮素、5‑羟基‑7，4′‑二甲氧基黄酮、5，4′‑二羟基‑7‑甲氧基黄酮芜花素、5，7‑二羟基‑4′‑甲氧基黄酮、5，7，3′‑二羟基‑4‑甲氧基黄酮及衍生物。本发明的万年蒿提取物对肝损伤具有显著的预防和治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及万年蒿提取物及其制备方法和用途。
背景技术
菊科蒿属植物约350种以上，广布于北半球的温带地区，欧、亚、北美，少数种分布到非洲、南亚及中美洲等热带地区，中国(不包括分出的绢篙属Seriphidium(Bess.)Poljak.)有170种以上，各地均产，其中如黄花蒿A.annua L，青蒿A.apiacea Hance，茵陈蒿A.capillaris Thunb.和A.argyi Levl.etVant.等均入药，尤以艾的用途最广，黄花蒿可治疟疾，还可制酒饼。
万年蒿，草本、亚灌木或小灌木，揉之常有香味；叶互生，常***；头状花序小，异性，盘状，常弯垂，排成圆锥花序、穗状花序或总状花序；花全部管状；缘花雌性，1列，纤细，2-3齿裂；盘花两性，结实或***；花序托裸露或有托毛；瘦果小，有沟纹，无冠毛。头状花序含同性花的种类已分出另立为绢蒿属。
肝损伤是多种肝脏疾病共有的一种特点突出的病理状态，严重威胁着人类健康。各种有害因素诸如药物、病毒、酒精、生物等可能致使肝功能有不同程度的损害，从而使肝脏的解毒、***功能及贮备和再生能力降低，肝血流量减少，代谢负荷加重，从而发生内环境紊乱，肝细胞坏死和凋亡，进而造成肝损伤。各种有害因素导致的肝损伤主要有药物性肝损伤、病毒性肝损伤、酒精性肝损伤、免疫性肝损伤等类型，全世界有数十亿人曾经或正忍受着肝损伤的痛苦。以病毒性肝损伤病因中的乙型肝炎病毒为例，全世界有20亿人感染过乙型肝炎病毒(HBV)，其中3.78亿人转化成慢性感染，0.5-1.2亿人死于肝硬化、肝衰竭、肝癌等。药物性肝损伤、酒精性肝损伤患者也同样不计其数。肝损伤的长期存在往往会导致肝纤维化，是进而诱发肝硬化，肝功能衰竭，甚至肝癌的重要始动因素。因此预防和治疗肝细胞损伤是临床上肝病治疗的重要环节之一，是抑制肝纤维化、肝坏死、脂肪肝、胆汁郁积、肝硬化以及肝癌等疾病发生和发展的基础。
治疗和预防肝损伤，在临床上没有特别好的办法。因此目前临床上对疗效明确、副作用低的抗肝损伤药物的需求十分强烈。万年蒿是在吉林省延边地区有着广泛应用基础的具有鲜明特点的一个朝药。万年蒿为菊科蒿属植物万年蒿Artemisia sacrorum Ledeb.的干燥地上部分，在长白山地区应用万年蒿膏剂，预防和治疗各种肝损伤疾病，有悠久的民间应用历史。在治疗胁痛等肝炎症状时，老百姓愿意选用万年蒿作为首选药物。
发明内容
本发明提供了一种万年蒿提取物及其制备方法和用途。
本发明采用如下技术方案：
本发明的万年蒿提取物中包含总黄酮化合物。万年蒿提取物中总黄酮化合物含量大于50％(重量百分比含量)。
所述的总黄酮化合物包括下列化合物的一种或几种：6-甲氧基-槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷、异鼠李素、万寿菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷、金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁、5，7，4′-三羟基黄酮、3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮、5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、山奈酚、3，5，7，4′-四羟基-6-甲氧基黄酮、3’，4’，5，7-四羟基黄酮、5，7，4′-三羟基-6，3′-二甲氧基黄酮、5，7，4′-三羟基-6-甲氧基黄酮、槲皮苷、7，3′，4′-三甲基槲皮素、5-羟基-7，4′-二甲氧基黄酮、5，4′-二羟基-7-甲氧基黄酮芜花素、5，7-二羟基-4′-甲氧基黄酮、5，7，3′-二羟基-4-甲氧基黄酮及其衍生物。
本发明的万年蒿提取物的制备方法如下：以万年蒿干品或者新鲜采集的万年蒿的地上部分为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、聚酰胺柱层析法、正相柱层析法、反相柱层析法，凝胶工艺中的一种或多种工艺，并结合浓缩干燥、冷冻干燥、喷雾干燥制备成万年蒿提取物。
在溶剂提取法和溶剂萃取法中，选用水、甲醇、乙醇、正丁醇、或其它低级脂肪醇中的一种或几种做溶媒，在室温浸提或超声提取，或加热下浸提或者回流提取，提取次数是一次或者多次。
大孔吸附树脂法中，选用常压或加压柱层析，树脂采用HPD-100、HPD-300、D-101、X-5、H103、AB-8，DA-201、HPD-400、NKA-9、S-8、HPD-500型号的树脂，洗脱溶剂采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时进行固定浓度的洗脱或梯度洗脱。
聚酰胺柱层析法中，选用常压或加压柱层析，所用柱填料为聚酰胺，洗脱溶剂采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时进行固定浓度的洗脱或梯度洗脱。
反相柱层析法中，选用常压或加压柱层析，洗脱溶剂采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时进行固定浓度的洗脱或梯度洗脱。
正相柱层析法中，选用常压或加压柱层析，洗脱溶剂采用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、二氯甲烷、氯仿中的一种或多种，洗脱时进行固定浓度的洗脱或梯度洗脱。
本发明的万年蒿提取物具有预防和治疗脂肪肝、药物性肝损伤、病毒性肝损伤、酒精性肝损伤和/或免疫性肝损伤疾病的功效。
本发明的万年蒿提取物可以制成用于治疗肝损伤的保健品或药物，所述的药物是将所述的化合物以及药学上可接受的药物制成液体、固体、半固体，口服或非口服，胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、口服液、注射剂等药学上可接受的任何剂型。
本发明的药物能够抑制肝纤维化、肝坏死、脂肪肝、胆汁郁积、肝硬化以及肝癌等疾病的发生和发展。
本发明得到的药物的活性成分是从万年蒿提取得到，其来源广泛，对肝损伤具有显著的疗效。
附图说明
图1是95％EE(万年蒿提取物一部分)细胞增殖和脂质蓄积的影响的示意图。
HepG2细胞以不同浓度(0，25，50，100μg/ml)的95％EE处理24h。细胞增殖以MTS法进行测试(A)。HepG2细胞以不同浓度(0，25，50，100μg/ml)的95％EE处理24h，然后用OilRed O染色。HepG2细胞以不同浓度(0，25，50，100μg/ml)的95％EE处理24h，甘油三酯含量以分光光度法进行测试并表达成μg甘油三酯/mg蛋白质(C)。数据表达成平均值±S.E。**，***分别代表和未处理的对照组相比p＜0.01和p＜0.001。
图2是50％EE，95％EE和WE(各为万年蒿提取物一部分)对HepG2细胞中AMPK和ACC磷酸化的影响的示意图。
细胞以50％EE，95％EE和WE以标示浓度分别处理24h。提取蛋白质并用pAMPK，AMPK，pACC，ACC，和β-actin抗体进行蛋白质印迹分析。β-actin蛋白水平用做internalcontrol。
图3是95％EE对HepG2细胞中AMPK和ACC磷酸化的影响的示意图。
细胞以100μg/ml 95％EE在不同的标示时间里进行处理(A)。细胞以不同的标示浓度的95％EE处理24h(B)。细胞以compound C预处理2h，然后用95％EE处理24h(C，D)。提取蛋白质并以pAMPK，AMPK，pACC，ACC和β-actin进行蛋白质印迹分析。β-actin蛋白质水平用做internal control。数据表达成平均值±S.E(n＝3)，**代表和未经处理的对照组相比，p＜0.01。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例1.万年蒿提取物的制备方法
取500g干品万年蒿加入水浸泡0.5-3h后加热0.5-3h，过滤得到滤液I，残渣中加水再加热0.5-3h，得到滤液II，合并滤液I和II，得到万年蒿水提液。将万年蒿水提液上样于预处理过的大孔吸附树脂柱中，依次用水和10％-95％乙醇洗脱。10％-95％乙醇洗脱液浓缩后冷冻干燥至干，即得到万年蒿提取物。
实施例2.万年蒿提取物中总黄酮含量测定
黄酮标准曲线：
试剂：芦丁，甲醇
芦丁对照品溶液配制
精密称取5.0mg芦丁，加甲醇，溶解并定容至100ml，即得50μg/ml。
吸取芦丁对照品溶液0，1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，7.0ml，于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，测定波长：360nm。结果如下：
y＝0.1371x+0.0093 R2＝0.9999
供试品(万年蒿50％乙醇洗脱物)溶液的制备：
取样品溶液1ml于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于恒温干燥箱中，50℃挥干溶剂，转入层析柱中，用30ml石油醚洗脱，弃去石油醚，再用100ml甲醇洗脱总黄酮，收集洗脱液，加压蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至25ml容量瓶中，即得。
供试品吸光度测定：
取1ml供试品聚酰胺粉洗脱物，放入25ml容量瓶中，加甲醇定容至25ml，再从25ml中取出1ml，加甲醇稀释10倍，测吸光度为0.316，计算得到总黄酮含量为28.115mg/ml。
换算结果：
总黄酮成分含量为68.2％。
实施例3.万年蒿提取物中化学成分的分离和结构鉴定
万年蒿提取物采用二氯甲烷、乙酸乙酯等溶液进行萃取，萃取液分别通过反相硅胶柱、SephadexLH-20凝胶柱、制备型HPLC、ODS低压柱等各种分离方法，经甲醇-水等***梯度洗脱，分离得到20个黄酮类化合物。通过波谱解析和文献对照，确定其化学结构分别为：1)6-甲氧基-槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷、2)槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷、3)异鼠李素、4)万寿菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷、5)金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷、6)芦丁、7)5，7，4′-三羟基黄酮、8)3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮、9)5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、10)山奈酚、11)3，5，7，4′-四羟基-6-甲氧基黄酮、12)3’，4’，5，7-四羟基黄酮、13)5，7，4′-三羟基-6，3′-二甲氧基黄酮、14)5，7，4′-三羟基-6-甲氧基黄酮、15)槲皮苷、16)7，3′，4′-三甲基槲皮素、17)5-羟基-7，4′-二甲氧基黄酮、18)5，4′-二羟基-7-甲氧基黄酮芜花素、19)5，7-二羟基-4′-甲氧基黄酮、20)5，7，3′-二羟基-4-甲氧基黄酮及其衍生物等。
万年蒿提取物中黄酮类化合物的波谱数据分别如下：
化合物1：6-甲氧基-槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷
1H-NMR(300MHz，(CD3)2CO)δppm：12.42(1H，s，5-OH)，7.89(1H，d，J＝2.01Hz，H-2’)，7.46(1H，dd，J＝2.04，8.34Hz，H-6’)，6.82(1H，d，J＝8.46Hz，H-5’)，6.47(1H，s，H-8)，5.12(1H，d，J＝7.26Hz，H-1”)，3.75(3H，s，6-OCH3).
13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm：145.26(C-2)，133.43(C-3)，178.11(C-4)，156.72(C-5)，131.70(C-6)，152.84(C-7)，94.22(C-8)，151.98(C-9)，104.76(C-10)，122.06(C-1′)，116.64(C-2′)，157.95(C-3′)，148.91(C-4′)，115.65(C-5′)，121.67(C-6′)，101.31(C-1″)，74.55(C-2″)，76.96(C-3″)，70.41(C-4″)，78.02(C-5″)，61.45(C-6″)，60.43(6-OCH3).
化合物2：槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷
1H-NMR(300MHz，CD3OD)δppm：7.68(1H，dd，J＝2.10Hz，H-2’)，7.56(1H，dd，J＝2.1，9.00Hz，H-6’)，6.83(1H，d，J＝8.40Hz，H-5’)，6.36(1H，d，J＝2.10Hz，H-8)，6.17(1H，d，J＝2.10Hz，H-6)，5.23(1H，d，J＝7.20Hz，3-O-glu)，3.30-3.71(m-sugar-H).
13C-NMR(75MHz，CD3OD)δppm：58.46(C-2)，135.60(C-3)，179.50(C-4)，163.06(C-5)，99.87(C-6)，166.02(C-7)，94.69(C-8)，159.00(C-9)，105.68(C-10)，123.06(C-1′)，115.99(C-2′)，145.91(C-3′)，149.85(C-4′)，117.54(C-5′)，123.19(C-6′)，104.20(C-1″)，75.72(C-2″)，78.10(C-3″)，71.20(C-4″)，78.39(C-5″)，62.53(C-6″).
化合物3：异鼠李素
1H-NMR(300MHz，CD3OD)δppm：7.73(1H，d，J＝2.10Hz，H-2′)，7.63(1H，dd，J＝2.10，8.70Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J＝8.70Hz，H-5′)，6.38(1H，d，J＝2.10Hz，H-8)，6.18(1H，d，J＝2.10Hz，H-6)，3.59(3H，s，-OCH3).
13C-NMR(75MHz，CD3OD)：148.78(C-2)，137.23(C-3)，177.34(C-4)，162.52(C-5)，99.28(C-6)，165.72(C-7)，94.43(C-8)，158.25(C-9)，104.49(C-10)，124.15(C-1’)，116.22(C-2’)，147.99(C-3’)，146.24(C-4’)，115.98(C-5’)，121.66(C-6’)，65.10(3’-OCH3)。
化合物4：万寿菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷
1H-NMR(500MHz，CD3OD)δppm：6.49(1H，s)，3.87(3H，s)，7.70(1H，d，J＝2.00Hz)，7.58(1H，dd，J＝2.00，2.00Hz)，6.86(1H，d，J＝8.50Hz)，5.27(1H，d，J＝7.50Hz)，5.27(1H，d，J＝7.50Hz)，3.26～3.57(m，suger-H)。
13C-NMR(125MHz，CD3OD)：159.19(C-2)，135.34(C-3)，179.76(C-4)，153.87(C-5)，132.80(C-6)，159.07(C-7)，95.03(C-8)，153.87(C-9)，106.12(C-10)，123.22(C-1’)，117.60(C-2’)，145.92(C-3’)，149.66(C-4’)，116.03(C-5’)，123.15(C-6’)，104.37(C-1″)，75.75(C-2″)，78.39(C-3″)，71.29(C-4″)，78.14(C-5″)，62.62(C-6″)，60.96(6-OCH3)。
化合物5：金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷
1H-NMR(500MHz，CD3OD)δppm：8.04(2H，d，J＝8.00Hz)，7.11(2H，d，J＝8.00Hz)，5.08(1H，d，J＝7.50Hz)，3.87(3H，s，OCH3)，3.22～3.81(m，sugar-H)。
13C-NMR(125MHz，CD3OD)：158.94(C-2)，104.83(C-3)，179.14(C-4)，149.12(C-5)，103.58(C-6)，153.82(C-7)，77.57(C-8)，144.87(C-9)，1005.30(C-10)，123.00(C-1’)，134.77(C-2’)，117.49(C-3’)，145.19(C-4’)，116.41(C-5’)，123.40(C-6’)，104.73(C-1″)，70.51(C-2″)，75.05(C-3″)，61.82(C-4″)，77.14(C-5″)，61.40(C-6″)，49.83(4’-OCH3)。
化合物6：芦丁
1H-NMR(500MHz，CD3OD)δppm：8.03(1H，d，J＝9.00Hz)，7.58(1H，dd，J＝1.00，1.00Hz)，6.95(1H，d，J＝8.50Hz)，4.98(1H，d，J＝8.00Hz)，4.54(1H，br s)，1.08(3H，d，J＝6.0Hz，OCH3)，3.35～4.52(m，sugar-H)。
13C-NMR(125MHz，CD3OD)：149.40(C-2)，133.30(C-3)，178.87(C-4)，154.01(C-5)，101.88(C-6)，158.90(C-7)，77.18(C-8)，152.56(C-9)，106.89(C-10)，123.59(C-1’)，116.40(C-2’)，134.54(C-3’)，145.07(C-4’)，117.60(C-5’)，123.10(C-6’)，104.78(C-1″)，73.19(C-2″)，76.31(C-3″)，71.42(C-4″)，75.00(C-5″)，61.37(C-6″)，103.65(C-1′″)，69.60(C-2′″)，70.84(C-3′″)，71.57(C-4′″)，68.29(C-5′″)，17.54(C-6′″)。
化合物7：5，7，4′-三羟基黄酮
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm：6.19(1H，d，J＝2.1Hz，H-6)，6.48(1H，d，J＝2.1Hz，H-8)，6.74(1H，s，H-3)，6.92(2H，d，J＝8.8Hz，H-3′，H-5′)，，7.90(2H，d，J＝8.8Hz，H-2′，H-6′).
13C-NMR(125MHz，DMSO-d6)δppm：164.17(C-2)，103.04(C-3)，181.77(C-4)，157.48(C-5)，98.90(C-6)，163.88(C-7)，94.16(C-8)，161.22(C-9)，103.77(C-10)，121.38(C-1′)，128.56(C-2′)，116.05(C-3′)，161.06(C-4′)，116.05(C-5′)，128.56(C-6′).
化合物8：3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮
1H-NMR(300MHz，CD3OD)δppm：6.18(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.38(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，7.73(1H，d，J＝2.1Hz，H-2′)，6.88(1H，d，J＝8.52Hz，H-5′)，7.63(1H，dd，J＝2.19，8.52Hz，H-6′).
13C-NMR(75MHz，CD3OD)δppm：147.99(C-2)，137.24(C-3)，177.34(C-4)，158.23(C-5)，99.22(C-6)，162.52(C-7)，94.39(C-8)，165.58(C-9)，104.52(C-10)，148.77(C-1′)，115.98(C-2′)，124.14(C-3′)，146.22(C-4′)，116.22(C-5′)，121.67(C-6′).
化合物9：5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮
1H-NMR(500MHz，CD3OD)δppm：3.97(3H，s，-OCH3)，6.19(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.44(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.61(1H，s，H-3)，6.90(1H，d，J＝8.5Hz，H-5′)，7.48(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，7.52(1H，dd，J＝8.5，2.0Hz，H-6′).
13C-NMR(125MHz，CD3OD)δppm：160.89(C-2)，104.15(C-3)，183.79(C-4)，163.13(C-5)，123.75(C-6)，166.09(C-7)，95.31(C-8)，156.19(C-9)，105.39(C-10)，124.69(C-1′)，110.70(C-2′)，149.58(C-3′)，152.52(C-4′)，116.86(C-5′)，121.77(C-6′)，56.72(-OCH3).
化合物10：山奈酚
1H-NMR(500MHz，CD3OD)δppm：6.18(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.40(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.90(2H，d，J＝9.0Hz，H-3′，H-5′)，8.09(2H，d，J＝9.0Hz，H-2′，H-6′).
13C-NMR(125MHz，CD3OD)δppm：148.15(C-2)，137.17(C-3)，177.44(C-4)，158.35(C-5)，99.38(C-6)，165.77(C-7)，94.55(C-8)，162.53(C-9)，104.56(C-10)，123.81(C-1′)，130.69(C-2′)，116.35(C-3′)，160.57(C-4′)，116.35(C-5′)，130.69(C-6′).
化合物11：3，5，7，4′-四羟基-6-甲氧基黄酮
1H-NMR(500MHz，CD3OD)δppm：3.87(3H，s，-OCH3)，6.48(1H，s，H-8)，6.89(2H，d，J＝8.8Hz，H-3′，H-5′)，8.07(2H，d，J＝8.8Hz，H-2′，H-6′).
13C-NMR(125MHz，CD3OD)δppm：148.39(C-2)，136.85(C-3)，177.64(C-4)，153.67(C-5)，132.27(C-6)，158.50(C-7)，94.80(C-8)，152.98(C-9)，105.01(C-10)，123.77(C-1′)，130.72(C-2′)，116.33(C-3′)，160.60(C-4′)，116.33(C-5′)，130.72(C-6′)，60.99(-OCH3).
化合物12：3’，4’，5，7-四羟基黄酮
1H-NMR(500MHz，CD3OD)δppm：7.42(1H，dd，J＝2.0，8.0Hz，H-6′)，7.39(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，6.94(1H，d，J＝8.5Hz，H-5′)，6.75(1H，s，H-3)，6.44(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.20(1H，d，J＝2.0Hz，H-6).
13C-NMR(125MHz，CD3OD)δppm：164.73(C-2)，104.62(C-3)，183.66(C-4)，162.33(C-5)，99.78(C-6)，165.61(C-7)，94.75(C-8)，158.25(C-9)，103.89(C-10)，122.31(C-1′)，114.22(C-2′)，146.78(C-3′)，150.71(C-4′)，116.01(C-5′)，120.46(C-6′).
化合物13：5，7，4′-三羟基-6，3′-二甲氧基黄酮
1H-NMR(500MHz，CD3OD)δppm：3.96(3H，s，-OCH3)，3.88(3H，s，-OCH3)，6.56(1H，s，H-3)，6.61(1H，s，H-8)，7.45(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，6.92(1H，d，J＝8.35Hz，H-5′)，7.49(1H，dd，J＝2.0，8.35Hz，H-6′).
13C-NMR(125MHz，CD3OD)δppm：166.24(C-2)，103.80(C-3)，184.23(C-4)，154.70(C-5)，132.97(C-6)，158.90(C-7)，95.38(C-8)，154.70(C-9)，105.78(C-10)，123.78(C-1′)，110.75(C-2′)，149.52(C-3′)，152.13(C-4′)，116.81(C-5′)，121.76(C-6′)，56.71(-OCH3)，60.94(-OCH3).
化合物14：5，7，4′-三羟基-6-甲氧基黄酮
1H-NMR(500MHz，CD3OD)δppm：3.89(3H，s，-OCH3)，6.58(1H，s，H-3)，6.67(1H，s，H-8)，6.92(2H，d，J＝8.75Hz，H-3′，H-5′)，7.84(2H，d，J＝8.75Hz，H-2′，H-6′).
13C-NMR(125MHz，CD3OD)δppm：164.46(C-2)，102.46(C-3)，184.31(C-4)，152.69(C-5)，131.70(C-6)，，157.66(C-7)，94.17(C-8)，152.69(C-9)，104.87(C-10)，122.14(C-1′)，128.45(C-2′)，1116.15(C-3′)，161.32(C-4′)，116.15(C-5′)，128.45(C-6′).
化合物15：槲皮苷
1H-NMR(300MHz，Acetone-d6)δppm：6.25(1H，d，J＝2.07Hz，H-6)，6.46(1H，d，J＝2.07Hz，H-8)，7.49(1H，d，J＝2.07Hz，H-2′)，7.39(1H，dd，J＝2.1，8.34Hz，H-6′)，6.98(1H，d，J＝8.34Hz，H-5′)，5.28(1H，d，J＝1.5Hz，H-1″)，3.72(1H，dd，J＝3.4，9.4Hz，H-3″)，3.34-3.43(2H，m，H-4″，H-5″)，0.91((3H，d，J＝5.7Hz，-CH3).
13C-NMR(75MHz，Acetone-d6)δppm：158.15(C-2)，135.63(C-3)，179.18(C-4)，163.06(C-5)，99.35(C-6)，164.77(C-7)，94.35(C-8)，157.63(C-9)，105.75(C-10)，122.43(C-1′)，115.99(C-2′)，145.68(C-3′)，148.85(C-4′)，116.56(C-5′)，122.73(C-6′)，102.57(C-1″)，71.26(C-2″)，71.97(C-3″)，72.86(C-4″)，71.19(C-5″)，17.63(C-6″).
化合物16：7，3′，4′-三甲基槲皮素
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δppm：13.08(1H，s，5-OH)，7.53(1H，dd，J＝8.50，2.00Hz，H-6′)，7.34(1H，d，J＝2.00Hz，H-2′)，6.98(1H，d，J＝8.50Hz，H-5′)，6.61(1H，s，H-8)，6.58(1H，s，H-6)，4.05(3H，s，OCH3)，3.98(3H，s，OCH3)，3.97(3H，s，OCH3).
化合物17：5-羟基-7，4′-二甲氧基黄酮
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δppm：7.87(2H，d，J＝8.85Hz，H-2′，6′)，7.04(2H，d，J＝8.85Hz，H-3′，5′)，6.60(1H，s，H-3)，6.51(1H，d，J＝2.10Hz，H-8)，6.39(1H，d，J＝2.10Hz，H-6)，3.91(3H，s，OCH3)，3.90(3H，s，OCH3).
13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm：164.51(C-2)，104.41(C-3)，182.47(C-4)，162.24(C-5)，98.04(C-6)，165.29(C-7)，92.64(C-8)，157.06(C-9)，104.92(C-10)，123.63(C-1′)，128.06(C-2′)，114.65(C-3′)，162.61(C-4′)，114.52(C-5′)，128.06(C-6′)，55.79(OCH3)，55.54(OCH3).
化合物18：5，4′-二羟基-7-甲氧基黄酮
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δppm：3.86(3H，s，OCH3)，6.37(1H，d，J＝2.08Hz，H-6)，6.76(1H，d，J＝2.08Hz，H-8)，6.86(1H，s，H-3)，7.11(2H，d，J＝8.85Hz，H-3′，5′)，8.02(2H，d，J＝8.85Hz，H-2′，6′)，10.63(1H，br.s，4′-OH)，12.93(1H，s，5-OH).
化合物19：5，7-二羟基-4′-甲氧基黄酮
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δppm：3.87(3H，s，OCH3)，6.20(1H，d，J＝1.80Hz，H-6)，6.50(1H，d，J＝1.80Hz，H-8)，6.84(1H，s，H-3)，6.93(2H，d，J＝8.70Hz，H-3′，5′)，7.95(2H，d，J＝8.70Hz，H-2′，6′)，10.63(1H，br.s，4′-OH)，12.97(1H，s，5-OH).
化合物20：5，7，3′-二羟基-4-甲氧基黄酮
1H-NMR(300M Hz，ACETONE)δppm：6.14(1H，s，6-H)，6.44(1H，s，8-H)，6.50(1H，s，3-H)，7.00(1H，d，J＝8.40Hz，5′-H)，7.37(1H，d，J＝1.80Hz，2′-H)，7.41(1H，m，6′-H)，12.86(1H，s，5-OH)，3.82(3H，s，4′-OCH3).
万年蒿提取物中黄酮类化合物的化学结构式如下：
实施例4.万年蒿提取物的活性检验及对肝损伤的治疗作用
1)万年蒿提取物95％EE部分对脂肪蓄积的影响
为了观察95％EE对脂质积累的影响，用不同浓度的95％EE(0，25，50，100μg/ml)处理HepG2细胞24hr然后用Oil Red O染色。如图1C所示，95％EE抑制脂质蓄积并呈现剂量依赖性。另外，在用不同浓度的95％EE(0，25，50，100μg/ml)处理HepG2细胞24hr后，测试了细胞中的甘油三酯含量。如图1B所示，95％EE明显减低甘油三酯含量并呈现剂量依赖性。和未给药组相比，不同浓度的95％EE(25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)使脂肪储量分别减少了13.2％(p＜0.01)，14.6％(p＜0.01)，19.0％(p＜0.001)。这些结果表明95％EE能够抑制脂质蓄积。
2)万年蒿提取物95％EE部分对AMPK磷酸化的影响
为了筛选出AMPK磷酸化的有效部位，通过蛋白质印迹法测试了WE，50％EE，和95％EE对AMPK活性的影响。95％EE明显促进AMPK和ACC的磷酸化并呈现剂量依赖性(图2)。因此，在本实验中，选用95％EE部分进行进一步的研究。为了探讨95％EE对AMPK磷酸化的影响，用100μg/ml浓度的95％EE分别在不同的标示时间里对HepG2细胞进行处理。每次处理完之后，收集细胞并提取细胞溶解液。AMPKα和ACC的活化状态采用磷酸化了的抗体通过蛋白质印迹法进行测试。结果表明95％EE激活了HepG2细胞中的AMPKα-Thr172并呈现时间依赖性(图3A)。和增加了的AMPK活性相一致，ACC-Ser79磷酸化(AMPK磷酸化最具有特征的位点)也得到了增加并呈现时间依赖性。
然后，HepG2细胞用不同浓度的95％EE处理24hr。如图3B所示，95％EE促进AMPK和ACC的磷酸化并呈现剂量依赖性。因此，为了证实95％EE对AMPK活性的影响，我们试图通过药理方法抑制AMPK和ACC活性。当用一种AMPK抑制剂，compound C(10μM)，对HepG2细胞进行预处理后，95％EE所致AMPK和ACC磷酸化程度被明显减弱(图3C，3D)。这些结果表明95％EE通过激活HepG2细胞的AMPK活性而发挥作用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.万年蒿提取物，其特征在于：所述的万年蒿提取物中含有总黄酮化合物；其中，
万年蒿提取物中总黄酮化合物含量大于50％；
所述的总黄酮化合物包括下列化合物：6- 甲氧基- 槲皮万寿菊素-7-O-β-D- 葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷、异鼠李素、万寿菊素-3-O-β-D- 葡萄糖苷、金合欢素-7-O-β-D- 葡萄糖苷、芦丁、5，7，4′ - 三羟基黄酮、3，3’，4’，5，7- 五羟基黄酮、5，7，4′ - 三羟基-3′ - 甲氧基黄酮、山奈酚、3，5，7，4′ - 四羟基-6- 甲氧基黄酮、3’，4’，5，7- 四羟基黄酮、5，7，4′ - 三羟基-6，3′ - 二甲氧基黄酮、5，7，4′ - 三羟基-6- 甲氧基黄酮、槲皮苷、7，3′，4′ - 三甲基槲皮素、5- 羟基-7，4′ - 二甲氧基黄酮、5，4′ - 二羟基-7- 甲氧基黄酮、5，7- 二羟基-4′ - 甲氧基黄酮、5，7，3′ - 二羟基-4- 甲氧基黄酮。
2.如权利要求1所述的万年蒿提取物的制备方法，其特征在于：
取干品万年蒿加入水浸泡0.5-3h后加热0.5-3h，过滤得到滤液I，残渣中加水再加热0.5-3h，得到滤液II，合并滤液I和II得到万年蒿水提液；
将万年蒿水提液上样于预处理过的大孔吸附树脂柱中，依次用水和10%-95%乙醇洗脱，洗脱液浓缩后冷冻干燥至干得到万年蒿提取物；
万年蒿提取物采用二氯甲烷、乙酸乙酯等溶液进行萃取，萃取液分别通过反相硅胶柱、SephadexLH-20 凝胶柱、制备型HPLC、ODS 低压柱的分离方法，经甲醇- 水***梯度洗脱，分离得到20 个黄酮类化合物。
3.如权利要求1所述的万年蒿提取物在制备预防和治疗脂肪肝、药物性肝损伤、病毒性肝损伤、酒精性肝损伤和/ 或免疫性肝损伤疾病的药物中的用途。
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