CN104232573A - 一种生长培养基及其用途和培养脐带间充质干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于培养干细胞的生长培养基，该生长培养基含有基础培养基和添加剂，所述添加剂含有抗人血管内皮生长因子的抗体、抗人类表皮生长因子受体1的抗体、抗人类表皮生长因子受体2的抗体和鸟苷-5-三磷酸三钠盐。本发明还提供了所述的生长培养基在培养脐带间充质干细胞中的用途。本发明还提供了一种培养脐带间充质干细胞的方法，该方法包括：将脐带间充质干细胞接种于如上所述的生长培养基中进行培养。通过上述技术方案，本发明能够大幅度地提升脐带间充质干细胞在体外的扩增能力。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，具体地，涉及一种用于培养干细胞的生长培养基、该生长培养基的用途和培养脐带间充质干细胞的方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力及多向分化潜能的未分化或低分化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。
间充质干细胞以一种多能干细胞，是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，具有较高的临床应用价值。
脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多能干细胞。从人脐带中分离出的脐带间充质干细胞，其细胞含量和增殖能力均优于骨髓间充质干细胞，并且免疫原性比骨髓间充质干细胞低，此外还具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此在间充质干细胞中具有更高的临床应用价值。
在实际临床应用中，脐带间充质干细胞的足够数量是保证干细胞治疗的必要因素。在体外对脐带间充质干细胞进行扩增是增加脐带间充质干细胞的数量的必要途径。但是，目前脐带间充质干细胞只能在体外传代15-20代，并且传代后3天以上才能达到80％以上的融合度，此外在传代15代以后还会出现丢失分化潜能的现象。因此，现有的培养脐带间充质干细胞的方法存在扩增能力差的缺陷。
发明内容
本发明的目的是克服现有的培养脐带间充质干细胞的方法存在扩增能力差的缺陷，提供一种用于培养干细胞的生长培养基、该生长培养基的用途和培养脐带间充质干细胞的方法。
本发明的发明人发现，通过在基础培养基中添加特定的抗体和ATP，能够大幅度地提高脐带间充质干细胞的扩增能力，由此得到了本发明。
一方面，本发明提供了一种用于培养干细胞的生长培养基，该生长培养基含有基础培养基和添加剂，所述添加剂含有抗人血管内皮生长因子的抗体、抗人类表皮生长因子受体1的抗体、抗人类表皮生长因子受体2的抗体和鸟苷-5-三磷酸三钠盐。
另一方面，本发明还提供了一种培养脐带间充质干细胞的方法，该方法包括：将脐带间充质干细胞接种于如上所述的生长培养基中进行培养。
再一方面，本发明还提供了所述的生长培养基在培养脐带间充质干细胞中的用途。
通过上述技术方案，本发明能够大幅度地提升脐带间充质干细胞在体外的扩增能力。例如，本发明能够将脐带间充质干细胞的体外传代数提高到25-40代，并且传代后40-60小时内能达到80％以上的融合度，此外在传代20代以后也不会出现丢失分化潜能的现象。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是测试实施例1中不同的生长培养基中生长的脐带间充质干细胞的生长曲线图。图1中，1和2表示制备实施例1和2，3-6分别表示制备对比例1-4，横坐标表示生长时间，纵坐标表示550nm处测定各孔吸光光度值(D值)。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的液体的体积数值为20℃下的数值。
本发明提供了一种用于培养干细胞的生长培养基，该培养基含有基础培养基和添加剂，所述添加剂含有抗人血管内皮生长因子的抗体、抗人类表皮生长因子受体1的抗体、抗人类表皮生长因子受体2的抗体和鸟苷-5-三磷酸三钠盐。
其中，人血管内皮生长因子(human vascular endothelial growth factor，hVEGF)是指NCBI中基因登记号(NCBI Gene ID)为7422的基因的翻译产物，其官方全称(Official Full Name)为血管内皮生长因子A(vascularendothelial growth factor A，VEGFA)，其常见的别称还包括VPF、VEGF或MVCD1。
其中，人类表皮生长因子受体1(human epidermal growth factor receptor1，HER1)是指NCBI中基因登记号(NCBI Gene ID)为1956的基因的翻译产物，其官方全称(Official Full Name)为表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor，EGFR)，其常见的别称还包括EGFR、ERBB、mENA、ERBB1或PIG61。
其中，人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor2，HER2)是指NCBI中基因登记号(NCBI Gene ID)为2064的基因的翻译产物，其官方全称(Official Full Name)为v-erb-b2鸟成红细胞白血病病毒癌基因同源体2(v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogenehomolog 2)，其常见的别称还包括NEU、NGL、TKR1、CD340、HER-2、MLN 19或HER-2/neu。
其中，鸟苷-5-三磷酸三钠盐(guanosine-5′-triphosphate trisodium salt)是指式(1)所示的化合物，其CAS号为36051-31-7。
其中，所述抗人血管内皮生长因子的抗体的含量可以为0.01-0.2ng/mL，所述抗人类表皮生长因子受体1的抗体的含量可以为0.01-0.1ng/mL，所述抗人类表皮生长因子受体2的抗体的含量可以为0.05-0.4ng/mL；鸟苷-5-三磷酸三钠盐的含量可以为0.2-4ng/mL。
其中，根据本发明的优选实施方式，抗人血管内皮生长因子的抗体的含量为0.05-0.1ng/mL，抗人类表皮生长因子受体1的抗体的含量为0.03-0.08ng/mL，抗人类表皮生长因子受体2的抗体的含量为0.1-0.2ng/mL；鸟苷-5-三磷酸三钠盐的含量为0.5-2ng/mL。在该优选实施方式中，本发明的生长培养基能够进一步增强对脐带间充质干细胞的扩增效果。
其中，所述抗人血管内皮生长因子的抗体只要能特异性地与人血管内皮生长因子结合并阻碍其生物学功能的行使即可；所述抗人类表皮生长因子受体1的抗体只要能特异性地与人类表皮生长因子受体1结合并阻碍其生物学功能的行使即可；所述抗人类表皮生长因子受体2的抗体只要能特异性地与人类表皮生长因子受体2结合并阻碍其生物学功能的行使即可。上述抗体可通过商购得到。根据本发明的优选实施方式，所述抗人血管内皮生长因子的抗体为贝伐单抗；所述抗人类表皮生长因子受体1的抗体为西妥昔单抗，所述抗人类表皮生长因子受体2的抗体为曲妥珠单抗。
其中，所述贝伐单抗的英文名为Bevacizumab，商品名为阿瓦斯汀(Avastin)；所述西妥昔单抗的英文名为Cetuximab，商品名为爱必妥(Erbitux)；所述曲妥珠单抗英文名为Trastuzumab，商品名为赫赛汀(Herceptin)。
其中，所述基础培养基没有特别的要求，可以为常规使用的各种能够培养哺乳动物的培养基，例如，所述基础培养基包括但不限于DMEM培养基、MEM培养基、IMEM培养基和RPMI1640培养基中的至少一种。上述基础培养基可以通过商购得到，例如可以从Gibco或Hyclone公司购买得到。例如，根据Gibco的商品目录，DMEM培养基的商品号为11965，MEM培养基的商品号为11095，IMEM培养基的商品号为21700，RPMI1640培养基的商品号为11875。
其中，本发明的生长培养基可以为含血清的培养基，也可以为不含血清的培养基。为了加速脐带间充质干细胞的贴壁，优选地，所述生长培养基还含有5-20体积％的血清。其中，所述血清可以包括胎牛血清、新生牛血清和小牛血清中的至少一种，更优选为胎牛血清。
其中，本发明的上述生长培养基的制备方法可以包括：将基础培养基与所述添加剂混合。
本发明还提供了如上所述的生长培养基在培养脐带间充质干细胞中的用途。
本发明还提供了一种培养脐带间充质干细胞的方法，该方法包括：将脐带间充质干细胞接种于如上所述的生长培养基中进行培养。
其中，培养的温度和CO2浓度可以为脐带间充质干细胞领域常规的选择；例如，培养的温度可以为36-38℃；培养的CO2浓度可以为4-6体积％。
其中，本发明如上所述的生长培养基能够促进脐带间充质干细胞较快地进行扩增，相应地缩短传代周期，因此优选情况下，培养的传代周期为40-60小时。
其中，本发明如上所述的生长培养基能够促进脐带间充质干细胞延长传代次数，优选情况下，优选地，培养的传代的代数为25-40代。
其中，所述脐带间充质干细胞可以通过组织块贴壁培养法或匀浆胶原酶消化法得到。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。
制备实施例1
在DMEM培养基(购自Gibco，商品号为11965)中添加胎牛血清(购自Gibco)、贝伐单抗(购自罗氏公司)、西妥昔单抗(购自默克公司)、曲妥珠单抗(购自罗氏公司)和鸟苷-5-三磷酸三钠盐(购自Sigma，以下相同)；添加的量使得终浓度为：胎牛血清10体积％、贝伐单抗0.08ng/mL、西妥昔单抗0.06ng/mL、曲妥珠单抗0.15ng/mL和鸟苷-5-三磷酸三钠盐1ng/mL；得到本制备实施例的生长培养基。
制备实施例2
在DMEM培养基(购自Gibco，商品号为11965)中添加胎牛血清(购自Gibco)、贝伐单抗(购自罗氏公司)、西妥昔单抗(购自默克公司)、曲妥珠单抗(购自罗氏公司)和鸟苷-5-三磷酸三钠盐；添加的量使得终浓度为：胎牛血清10体积％、贝伐单抗0.01ng/mL、西妥昔单抗0.1ng/mL、曲妥珠单抗0.05ng/mL和鸟苷-5-三磷酸三钠盐300μg/mL；得到本制备实施例的生长培养基。
制备对比例1
在DMEM培养基(购自Gibco，商品号为11965)中添加胎牛血清(购自Gibco)、西妥昔单抗(购自默克公司)、曲妥珠单抗(购自罗氏公司)和鸟苷-5-三磷酸三钠盐(购自Sigma，以下相同)；添加的量使得终浓度为：胎牛血清10体积％、西妥昔单抗0.06ng/mL、曲妥珠单抗0.15ng/mL和鸟苷-5-三磷酸三钠盐1ng/mL；得到本制备对比例的生长培养基。
制备对比例2
在DMEM培养基(购自Gibco，商品号为11965)中添加胎牛血清(购自Gibco)、贝伐单抗(购自罗氏公司)、曲妥珠单抗(购自罗氏公司)和鸟苷-5-三磷酸三钠盐(购自Sigma，以下相同)；添加的量使得终浓度为：胎牛血清10体积％、贝伐单抗0.08ng/mL、曲妥珠单抗0.15ng/mL和鸟苷-5-三磷酸三钠盐1ng/mL；得到本制备对比例的生长培养基。
制备对比例3
在DMEM培养基(购自Gibco，商品号为11965)中添加胎牛血清(购自Gibco)、贝伐单抗(购自罗氏公司)、西妥昔单抗(购自默克公司)和鸟苷-5-三磷酸三钠盐(购自Sigma，以下相同)；添加的量使得终浓度为：胎牛血清10体积％、贝伐单抗0.08ng/mL、西妥昔单抗0.06ng/mL和鸟苷-5-三磷酸三钠盐1ng/mL；得到本制备对比例的生长培养基。
制备对比例4
在DMEM培养基(购自Gibco，商品号为11965)中添加胎牛血清(购自Gibco)、贝伐单抗(购自罗氏公司)、西妥昔单抗(购自默克公司)、曲妥珠单抗(购自罗氏公司)和鸟苷-5-三磷酸三钠盐(购自Sigma，以下相同)；添加的量使得终浓度为：胎牛血清10体积％、贝伐单抗0.08ng/mL、西妥昔单抗0.06ng/mL和曲妥珠单抗0.15ng/mL；得到本制备对比例的生长培养基。
测试实施例1
在剖腹产胎儿出生后，截取脐带，剥去羊膜，剥离华尔通氏胶(Wharton′sjelly)，剪碎成0.5-1.5mm3的组织块，加入IV型胶原酶(10g/L)，置37℃恒温振荡培养箱振荡消化3h后，用80目滤网过滤，将滤过的细胞悬液离心洗涤。用无血清培养基(购自Cambrex，UItraCULTURE)混匀细胞，以1.0×106/cm2的接种密度接种于T-75cm2培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5体积％的CO2培养箱中培养至80％的融合度，得到第1代脐带间充质干细胞。
将上述得到的贴壁培养有第1代脐带间充质干细胞的培养瓶中加入2.5g/L胰酶消化，并按1∶3的比例传代至细胞培养板中，传代使用的生长培养基为制备实施例1-2和制备对比例1-4得到的生长培养基。传至第3代时，使用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性并绘制细胞的生长曲线，具体操作包括：将生长至80％融合度的第3代脐带间充质干细胞酶解悬浮，调整细胞浓度至1×104个/mL，加入24孔板，每孔800μL，置于37℃、饱和湿度、5体积％的CO2培养箱中培养，5天内，每隔8小时取出一份24孔板，每孔加入80μL的MTT溶液(5g/L)后，37℃下放置4h，在每孔加入600μL的二甲基亚砜(DMSO)，用酶标仪在550nm处测定各孔吸光光度值(D值)，以D值代表细胞的相对数量，绘制生长曲线，结果如图1所示，图1中，1和2表示制备实施例1和2，3-6分别表示制备对比例1-4，横坐标表示生长时间，纵坐标表示550nm处测定各孔吸光光度值(D值)。
根据生长曲线可以看出，在制备实施例1和2得到的生长培养基中的脐带间充质干细胞在56小时前能够生长至平台期。但是制备对比例1-4得到的生长培养基中的脐带间充质干细胞只能在72小时后才能够生长至平台期。由此可以看出，本发明的生长培养基能够有效地加速脐带间充质干细胞的生长速度。
测试实施例2
在剖腹产胎儿出生后，截取脐带，剥去羊膜，剥离华尔通氏胶(Wharton′sjelly)，剪碎成0.5-1.5mm3的组织块，加入IV型胶原酶(10g/L)，置37℃恒温振荡培养箱振荡消化3h后，用80目滤网过滤，将滤过的细胞悬液离心洗涤。用无血清培养基(购自Cambrex，UItraCULTURE)混匀细胞，以1.0×105/cm2的接种密度接种于T-75cm2培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5体积％的CO2培养箱中培养至80％的融合度，得到第1代脐带间充质干细胞。
将上述得到的贴壁培养有第1代脐带间充质干细胞的培养瓶中加入2.5g/L胰酶消化，并按1∶3的比例传代至细胞培养板中，传代使用的生长培养基为制备实施例1-2得到的生长培养基，培养至80％的融合度时，按1∶3的比例传代，传代使用的生长培养基为制备实施例1-2得到的生长培养基，如此往复进行传代至得到第30代脐带间充质干细胞后，对第30代脐带间充质干细胞进行干细胞表面标志测定、向成骨细胞分化潜能的检测、向脂肪细胞分化潜能的检测、向类肝细胞分化潜能的检测、向成肌细胞分化潜能的检测、向神经细胞分化潜能的检测和向造血细胞分化潜能的检测。具体的检测方法包括：干细胞表面标志测定、向成骨细胞分化潜能的检测和向脂肪细胞分化潜能的检测按照文献(王娟等，人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定，暨南大学学报，第30卷，2009)中的方法进行；向类肝细胞分化潜能的检测按照文献(熊中华等，冻存人脐血间充质干细胞向类肝细胞的诱导分化，中国组织工程研究与临床康复，2007年第7期)进行；向成肌细胞分化潜能的检测按照文献(刘岱，人脐带血间充质干细胞向成肌细胞分化的体外研究，硕士学位论文，2009)进行；向神经细胞分化潜能的检测按照文献(孙洪涛等，脐带间充质干细胞分离、鉴定与神经分化，中华神经外科疾病研究杂志，2008年4月)进行；向造血细胞分化潜能的检测按照文献(胡凯猛等，人脐带间充质干细胞向造血细胞方向分化的研究，博士学位论文，2012年)进行。
上述检测的结果表明，分离培养的人脐血间充质干细胞使用制备实施例1-2得到的生长培养基进行培养传代，在进行30代传代的情况下，还具有干细胞的特异性表面标志、向成骨细胞分化潜能、向脂肪细胞分化潜能、向类肝细胞分化潜能、向成肌细胞分化潜能、向神经细胞分化潜能和向造血细胞分化潜能。
由此可见，本发明能够将脐带间充质干细胞的体外传代数提高，并且传代后的生长速度加快，此外在多次传代以后也不会出现丢失分化潜能的现象。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种用于培养干细胞的生长培养基，该生长培养基含有基础培养基和添加剂，其特征在于：所述添加剂含有抗人血管内皮生长因子的抗体、抗人类表皮生长因子受体1的抗体、抗人类表皮生长因子受体2的抗体和鸟苷-5-三磷酸三钠盐。
2.根据权利要求1所述的生长培养基，其特征在于：抗人血管内皮生长因子的抗体的含量为0.01-0.2ng/mL，抗人类表皮生长因子受体1的抗体的含量为0.01-0.1ng/mL，抗人类表皮生长因子受体2的抗体的含量为0.05-0.4ng/mL；鸟苷-5-三磷酸三钠盐的含量为0.2-4ng/mL。
3.根据权利要求2所述的生长培养基，其特征在于：抗人血管内皮生长因子的抗体的含量为0.05-0.1ng/mL，抗人类表皮生长因子受体1的抗体的含量为0.03-0.08ng/mL，抗人类表皮生长因子受体2的抗体的含量为0.1-0.2ng/mL；鸟苷-5-三磷酸三钠盐的含量为0.5-2ng/mL。
4.根据权利要求1-3中任意一所述的生长培养基，其特征在于：所述抗人血管内皮生长因子的抗体为贝伐单抗；所述抗人类表皮生长因子受体1的抗体为西妥昔单抗，所述抗人类表皮生长因子受体2的抗体为曲妥珠单抗。
5.据权利要求1所述的生长培养基，其特征在于：所述基础培养基包括DMEM培养基、MEM培养基、IMEM培养基和RPMI1640培养基中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的生长培养基，其特征在于：所述生长培养基还含有5-20体积％的血清。
7.权利要求1-6中任意一项所述的生长培养基在培养脐带间充质干细胞中的用途。
8.一种培养脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：该方法包括：将脐带间充质干细胞接种于权利要求1-6中任意一项所述的生长培养基中进行培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：培养的传代周期为40-60小时。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：培养的传代的代数为25-40代。
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