CN108192861A - 一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法：步骤1、分离；步骤2、初处理；步骤3、过滤；步骤4、接种和培养；步骤5、传代；步骤6、细胞冻存；步骤7；细胞复苏。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行统一、***监控，从胎盘组织采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控。

Description

一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法。
背景技术
干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stemcell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell，TSC)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)(专能干细胞)。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝***与分化来***成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括胎盘、脐带、脐带血与骨髓等。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能、低免疫原性的成体干细胞，具粘附性，呈纺锤型、成纤维细胞样形态，在胚胎发育中来源于中胚层，具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌腱细胞等。MSCs广泛地存在于人体的骨髓、脂肪、牙周膜、新生儿的脐带、胎盘、羊膜、羊水等组织中，来源广泛且没有伦理限制，易于分离和体外扩增，在经过多次***传代后仍保持多向分化潜能，至今为止的临床试验研究未发现MSCs有严重副作用，是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细胞。
卵巢功能早衰是指女性曾有自然的***，而在40岁之前出现卵巢萎缩性持续闭经。病因可能为感染、医源性卵巢早衰、特发性卵巢早衰和免疫因素等。
同时，临床上表现***退缩，出现颜面烘热、心烦、易怒等更年期症状；平时易感冒，血***水平升高，达40单位以上，相当于绝经后妇女水平；而血***水平显著低落。妇科检查***明显萎缩，***粘膜薄而充血。剖腹作卵巢活组织检查，可见卵巢萎缩，显微镜下见卵巢皮质内均为纤维组织，无始基滤泡等各级滤泡可见。
卵巢早衰一般认为是自身免疫性疾病，可能是病毒感染引起的机体对自身卵巢组织的免疫性***。凡免疫性疾病引起的都并见自身免疫现象，或同时存在一种以上的疾病，表现于多腺体衰竭综合征。由于卵巢自身免疫者的血清中存在一种抗卵巢抗体，因而卵巢活检可见淋巴细胞浸润。有因手术、放疗影响卵巢血运而致的。有因卵泡先天性过少或促性腺素过度刺激加速卵泡闭锁而致的。卵巢早衰治疗比较困难，西医临床上采用激素替代疗法，需要在大夫的指导下使用雌孕激素；研究表明该***和孕激素治疗的时候，有一定的作用，可以改善症状，但对卵巢功能的恢复并不理想，同时停药之后症状重新出现，使卵巢处于依赖状态，有导致卵巢功能更差的可能，也就是说激素替代疗法仅仅起到了治标的作用，而且这种方法副作用大，长期使用外源性激素有导致子宫内膜癌变的危险，并增加冠心病以及胆囊病的发病率。因此，该激素治疗的效果不理想，同时存在安全隐患。
围绝经期综合征出现的根本的原因是由于生理性或病理性或手术而引起的卵巢功能衰竭。卵巢功能一旦衰竭或被切除和破坏，卵巢分泌的***就会减少。女性全身有400多种***受体，分布在几乎女性全身所有的组织和器官，接受***的控制和支配，一旦***减少，就会引发器官和组织的退行性变化，出现一系列的症状。
近年来，随着基因治疗和干细胞技术的发展，采用干细胞技术来代替激素的疗法愈来愈被关注；目前，存在有采用静脉回输间充质干细胞/细胞因子，或采用经腹部有创介入腹腔镜下卵巢原位注射间充质干细胞/细胞因子的方法治疗卵巢早衰，取得一定的疗效，但是该疗效不是很理想，有效率低，具体表现在：
首先，静脉回输间充质干细胞容易粘附成团，未经过滤输入易造成肺静脉栓塞，表现为呼吸急促、紫绀、躁动和惊厥等，也有造成心脑血管卒中偏瘫的案例；
其次，虽然间充质干细胞是低免疫原性，不表达或低表达II类抗原，但多次静脉输入间充质干细胞，仍有一定比例产生白细胞抗体，与输入细胞的量/次成正比，抗原抗体反应可导致低热、疲乏、呼吸窘迫等反应，静脉输入细胞或因子，归巢的量有限，也一定程度影响了疗效。
介入疗法一般要在腹部开口，腹腔镜下介入导管到血管或病变局部，一次性介入疗效有限，多次介入反复给患者带来医源性创伤，不能接受，不易普及。
因此，到目前为止，还没有确切有效的方法能恢复卵巢的功能，所以卵巢早衰病因复杂、治疗难度较大，现代医学迄今尚未取得突破进展。。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法。
本申请采用了以下技术方案：
本发明提供一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1：分离：取合格的胎盘，将胎盘用无菌盐水冲洗后，小心分离胎盘和羊膜，加入华尔通胶，剪碎成组织小块。
步骤2：初处理：洗去组织小块中的血液成分，剔除组织小块上的血管组织和滋养层组织，再加入胶原酶，置于37℃恒温振荡培养箱振荡消化。
步骤3：过滤和离心：将消化后得到的混合液体经过滤网过滤掉不溶物质，将滤过的细胞悬液离心洗涤。
步骤4：接种和培养：加入UltraCULTURE无血清培养液用以混合细胞，以1.0×105/cm2将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含胎牛血清的DF12培养液于37℃、3～8％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
步骤5：传代：等到细胞贴壁后，每隔3～5d换液。待细胞生长至80～90％融合时，加入胰酶消化细胞，进行传代。
步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×107/ml/管放入细胞冻存管，加入冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；
步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得间充质干细胞，按照需求使用即可。
所述的由胎盘制备出的间充质干细胞具有强大的免疫调节作用，能应用在制备治疗自身免疫性疾病药物中。
所述的自身免疫性疾病是指包括***性红斑狼疮、***性硬化、多发性肌炎和皮肌炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖尿病等在内的一大类疾病。
所述自身免疫性疾病尤其指***性红斑狼疮、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎。
所述制备的方法还可以包括之后的检测步骤。比如细胞表面分子标志检测。收集107个培养3～4 d的第3、4代成纤维样细胞制成细胞悬液，分别加入抗人CD34-PE、CD45-FITC、CD105-PE、CD90-FITC、CD73-PE、CD29-PE、CD44-FITC、CD14-PE、CD19-FITC、HLA-Drpercp-A等各5μl，鼠IgG1为阴性对照。4℃反应30 min，使用流式细胞仪检测。
还有细胞增殖能力的检测，分别取原代、2、4、6代成纤维样细胞，加入UItraCULTURE无血清培养液制成细胞悬液，以1×105/ml的密度接种于6孔板内。第3d起，每隔1d消化并细胞计数，根据细胞数量绘制曲线。
优选地，步骤1中，剪碎成组织小块的大小为0.6～1.0mm3。
优选地，步骤2中，所述加入的胶原酶为Ⅳ型，浓度为0.8～1.2g/L。
优选地，步骤2中，放入恒温振荡培养箱振荡消化的时间为2～4h，更优选地，为3h。
优选地，步骤3中的滤网为80目滤网。
优选地，步骤3中的离心的条件为800～1500r/min,3～10min,更优选地为1000r/min,5min。
优选地，步骤4中，胎牛血清的含量为6～15％，更优选地为10％。
优选地，步骤4中，CO2的浓度为4～6％，更优选地为5％。
优选地，步骤5中，加入胰酶的时机是细胞生产至80～90％，更优选地为85％。
优选地，步骤5中，进行传代的比例为1:3或者1:2。
优选地，步骤6中，冷冻保存所用的细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度8％。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1.全过程全面质量监控，从胎盘采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控。
2.通过此法收集得到间充质干细胞的耗时短、成本低，并且有效的利用了胎盘组织。
3.无血清培养基，不使用抗生素，避免异源蛋白及抗生素可能引起的疾病或过敏风险。
4.低浓度冻存保护剂，保持细胞的活性及干细胞的干性，使复苏后的细胞尽可能地保证各种生物学特性不受损伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1：分离：取合格的胎盘，将胎盘用无菌盐水冲洗后，小心分离胎盘和羊膜，加入华尔通胶，剪碎成0.6～1.0mm3组织小块。
步骤2：初处理：洗去组织小块中的血液成分，剔除组织小块上的血管组织和滋养层组织，再加入Ⅳ型胶原酶(浓度为1.0g/L)，置于37℃恒温振荡培养箱振荡消化3h。
步骤3：过滤和离心：将消化后得到的混合液体经过80目滤网过滤掉不溶物质，将滤过的细胞悬液离心洗涤，离心条件为1000r/min,5min。
步骤4：接种和培养：加入UltraCULTURE无血清培养液用以混合细胞，以1.0×105/cm2将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含10％胎牛血清的DF12培养液于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
步骤5：传代：等到细胞贴壁后，每隔3～5d换液。待细胞生长至80～90％融合时，加入胰酶消化细胞，按照1:3的比例进行传代。
步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×107/ml/管放入细胞冻存管，加入由完全培养基和二甲基亚砜配制冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；
步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得间充质干细胞，按照需求使用即可。
实施例2
本实施例一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1：分离：取合格的胎盘，将胎盘用无菌盐水冲洗后，小心分离胎盘和羊膜，加入华尔通胶，剪碎成0.6～1.0mm3组织小块。
步骤2：初处理：洗去组织小块中的血液成分，剔除组织小块上的血管组织和滋养层组织，再加入Ⅳ型胶原酶(浓度为1.2g/L)，置于37℃恒温振荡培养箱振荡消化4h。
步骤3：过滤和离心：将消化后得到的混合液体经过80目滤网过滤掉不溶物质，将滤过的细胞悬液离心洗涤，离心条件为1200r/min,5min。
步骤4：接种和培养：加入UltraCULTURE无血清培养液用以混合细胞，以1.0×105/cm2将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含12％胎牛血清的DF12培养液于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
步骤5：传代：等到细胞贴壁后，每隔3～5d换液。待细胞生长至80～90％融合时，加入胰酶消化细胞，按照1:2的比例进行传代。
步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×107/ml/管放入细胞冻存管，加入由完全培养基和二甲基亚砜配制冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；
步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得间充质干细胞，按照需求使用即可。
实施例3
本实施例一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1：分离：取合格的胎盘，将胎盘用无菌盐水冲洗后，小心分离胎盘和羊膜，加入华尔通胶，剪碎成0.6～1.0mm3组织小块。
步骤2：初处理：洗去组织小块中的血液成分，剔除组织小块上的血管组织和滋养层组织，再加入Ⅳ型胶原酶(浓度为0.9g/L)，置于37℃恒温振荡培养箱振荡消化4h。
步骤3：过滤和离心：将消化后得到的混合液体经过80目滤网过滤掉不溶物质，将滤过的细胞悬液离心洗涤，离心条件为900r/min,6min。
步骤4：接种和培养：加入UltraCULTURE无血清培养液用以混合细胞，以1.0×105/cm2将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含10％胎牛血清的DF12培养液于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
步骤5：传代：等到细胞贴壁后，每隔3～5d换液。待细胞生长至80～90％融合时，加入胰酶消化细胞，按照1:3的比例进行传代。
步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×107/ml/管放入细胞冻存管，加入由完全培养基和二甲基亚砜配制冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；
步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得间充质干细胞，按照需求使用即可。
性能测试
对实施例1～3制备的间充质干细胞进行临床标准检测，检测结果如表1和表2所述：
表1冷冻前检测结果
表2冷冻复苏后的检测结果

Claims (10)

1.一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1：分离：取合格的胎盘，将胎盘用无菌盐水冲洗后，小心分离胎盘和羊膜，加入华尔通胶，剪碎成组织小块。
步骤2：初处理：洗去组织小块中的血液成分，剔除组织小块上的血管组织和滋养层组织，再加入胶原酶，置于37℃恒温振荡培养箱振荡消化。
步骤3：过滤和离心：将消化后得到的混合液体经过滤网过滤掉不溶物质，将滤过的细胞悬液离心洗涤。
步骤4：接种和培养：加入UltraCULTURE无血清培养液用以混合细胞，以1.0×105/cm2将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含胎牛血清的DF12培养液于37℃、3～8％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
步骤5：传代：等到细胞贴壁后，每隔3～5d换液。待细胞生长至80～90％融合时，加入胰酶消化细胞，进行传代。
步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×107/ml/管放入细胞冻存管，加入冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；
步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得间充质干细胞，按照需求使用即可。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中剪碎成组织小块的大小为0.6～1.0mm3。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述加入的胶原酶为Ⅳ型，浓度为0.8～1.2g/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中放入恒温振荡培养箱振荡消化的时间3h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中的滤网为80目滤网。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中的离心的条件为800～1500r/min,3～10min。
7.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤4中胎牛血清的含量为6～15％。
8.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤5中加入胰酶的时机是细胞生产至85％。
9.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤5中，进行传代的比例为1:3或者1:2。
10.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤6中，冷冻保存所用的细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度8％。
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