发明内容
本发明的目的之一在于解决现有技术的不足,提供一种人间充质干细胞体外培养的无血清完全培养基,克服含血清培养基的血清批次间不稳定、有细胞毒性和大量异源蛋白等缺陷。
本发明另一目的在于在体外对间充质干细胞进行大量扩增。
为达到上述目的,本发明采取了如下技术方案:
一种间充质干细胞的无血清完全培养基,由基础培养基和添加成份构成,所述的基础培养基为DMEM/F12,所述的添加成份由重组人胰岛素、人血清白蛋白、人转铁蛋白、胆固醇、***钠、硝酸铁和葡聚糖组成。
进一步的技术方案是,所述添加成份中重组人胰岛素2~10mg/L,人血清白蛋白1~30g/L,人转铁蛋白1~10mg/L,胆固醇10~50mg/L,***钠0.05~0.2mg/L,硝酸铁1~10mg/L,葡聚糖10~100mg/L。
进一步的技术方案是,所述的基础培养基DMEM/F12型号包括12400-024、Gibco 884400。
更进一步的技术方案是,所述的无血清完全培养基用于体外培养间充质干细胞,所述的间充质干细胞包含骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明的培养基不含有血清,大大避免了含血清培养基的血清批次间不稳定、有细胞毒性和大量异源蛋白等缺陷,为间充质干细胞的基础研究和临床治疗提供了很好的工具。
(2)本发明在促进细胞增值方面达到了与含血清培养基及其他无血清培养基接近或相当的效果,可支持细胞的长期传代培养。
具体实施方式
实施例一
1L间充质干细胞无血清完全培养基的配制:将产品型号为12400-024的DMEM/F12干粉(包装:10袋*1L/盒)1袋,重组人胰岛素7mg,人血清白蛋白12g,人转铁蛋白1mg,胆固醇25mg,***钠0.185mg,硝酸铁4mg,葡聚糖50mg混合,加注射用水800ml,搅拌溶解,并用0.5mol/L的盐酸调节pH至7.1,定容至1L,混匀后用0.22um滤膜过滤除菌,4℃存放。
BMSCs(骨髓间充质干细胞)体外培养:由医院抽取志愿者骨髓10ml,等体积铺于1.073g/ml的淋巴细胞分离液上,2250rpm离心30min,取云雾状单个核细胞层,用生理盐水洗3次;再依次以2000rpm、1800rpm、1600rpm离心去上清液,每次离心五分钟;将去上清液后获得的细胞以上述配制的间充质干细胞无血清培养基重悬并调整密度至5×106cells/ml接种于6孔板中,置37℃5%C02饱和湿度培养箱中培养,每隔两天去上清液更换新鲜的上述配制的间充质干细胞无血清培养基并调整密度至5×106cells/ml,培养10天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。
UCMSCs(脐带间充质干细胞)体外培养:将无菌取得的足月妊娠分娩胎儿脐带充分洗涤去血渍后,剔除脐带动静脉,解剖刮取Wharton’s Jelly(间质组织),剪碎成约1mm3大小的组织块,生理盐水冲洗,用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基重悬,接种于培养瓶中,14天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。
将上述体外培养的BMSCs和UCMSCs用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基分别重悬并调整密度1×106cells/ml分别接种于培养瓶中,3天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞,为细胞周期检测和集落形成检测备用。
细胞周期检测:
将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后,以0.5×104cells/mL的密度接种于100mm培养皿中,分别培养6d后收获细胞,以-20℃预冷的70%乙醇固定,50μg/mL碘化丙锭(PI)染色,流式细胞仪(BD公司)检测10000个细胞,结果如图:骨髓间充质干细胞G0/G1期48.9%,G2/M期14.5%,S期36.6%,脐带间充质干细胞G0/G1期49.8%,G2/M期15.8%,S期34.4%,高比例的G0/G1期细胞显示这两种来源的间充质干细胞具有高度的分化潜能。
集落形成检测:
将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后,以200cells/well的密度接种于预铺了0.2%明胶的6孔板中,每3d换液,7d后结晶紫染色集落,相差显微镜下计集落数,超过50个细胞计为一个集落,每组设3个平行。
按下面公式计算集落形成率:
集落形成率(Colony-forming efficiency,CFE)(%)=(集落数/接种细胞数)×100%
结果显示:无血清扩增后的骨髓BMSCs和脐带UCMSCs的集落形成率分别为(13.67%±4.04%)和(15.00%±2.00%),细胞的集落形成能力无明显差异。等渗结晶紫染色细胞集落,见两组细胞的集落尺寸也无明显差异。
实施例2
1L间充质干细胞无血清完全培养基的配制:将产品型号为Gibco 884400的DMEM/F12干粉(包装:10袋*1L/盒)1袋,重组人胰岛素2mg,人血清白蛋白30g,人转铁蛋白10mg,胆固醇10mg,***钠0.05mg,硝酸铁10mg,葡聚糖10mg混合,加注射用水800ml,搅拌溶解,并用0.5mol/L的盐酸调节pH至7.1±0.1,定容至1L,混匀后用0.22um滤膜过滤除菌,4℃存放。
BMSCs(骨髓间充质干细胞)体外培养:由医院抽取志愿者骨髓10ml,等体积铺于1.073g/ml的淋巴细胞分离液上,2250rpm离心30min,取云雾状单个核细胞层,用生理盐水洗3次;再依次以2000rpm、1800rpm、1600rpm离心去上清液,每次五分钟,将去上清液后获得的细胞以上述配制的间充质干细胞无血清培养基重悬并调整密度至5×106cells/ml接种于6孔板中,置37℃5%CO2饱和湿度培养箱中培养,每隔两天去上清液更换新鲜的上述配制的间充质干细胞无血清培养基并调整密度至5×106cells/ml,培养10天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。
UCMSCs(脐带间充质干细胞)体外培养:将无菌取得的足月妊娠分娩胎儿脐带充分洗涤去血渍后,剔除脐带动静脉,解剖刮取Wharton’s Jelly(间质组织),剪碎成约1mm3大小的组织块,生理盐水冲洗,用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基重悬,接种于培养瓶中,14天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。
将上述体外培养的BMSCs和UCMSCs用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基分别重悬并调整密度1×106cells/m1分别接种于培养瓶中,3天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞,为细胞周期检测和集落形成检测备用。
细胞周期检测:
将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后,以0.5×104cells/mL的密度接种于100mm培养皿中,分别培养6d后收获细胞,以-20℃预冷的70%乙醇固定,50μg/mL碘化丙锭(PI)染色,流式细胞仪(BD公司)检测10000个细胞,结果如图:骨髓间充质干细胞G0/G1期44.6%,G2/M期16.4%,S期38.9%,脐带间充质干细胞G0/G1期36.4%,G2/M期14.0%,S期49.6%,高比例的G0/G1期细胞显示这两种来源的间充质干细胞具有高度的分化潜能。
集落形成检测:
将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后,以200cells/well的密度接种于预铺了0.2%明胶的6孔板中,每3d换液,7d后结晶紫染色集落,相差显微镜下计集落数,超过50个细胞计为一个集落,每组设3个平行。
按下面公式计算集落形成率:
集落形成率(Colony-forming efficiency,CFE)(%)=(集落数/接种细胞数)×100%
结果显示:无血清扩增后的骨髓BMSCs和脐带UCMSCs的集落形成率分别为(17.67%±2.04%)和(16.00%±2.00%),细胞的集落形成能力无明显差异。等渗结晶紫染色细胞集落,见两组细胞的集落尺寸也无明显差异。
实施例3
1L间充质干细胞无血清完全培养基的配制:将产品型号为12400-024的DMEM/F12干粉(包装:10袋*1L/盒)1袋,重组人胰岛素10mg,人血清白蛋白1g,人转铁蛋白1mg,胆固醇50mg,***钠0.2mg,硝酸铁1mg,葡聚糖100mg混合,加注射用水800ml,搅拌溶解,并用0.5mol/L的盐酸调节pH至7.1±0.1,定容至1L,混匀后用0.22um滤膜过滤除菌,4℃存放。
BMSCs(骨髓间充质干细胞)体外培养:由医院抽取志愿者骨髓10ml,等体积铺于1.073g/ml的淋巴细胞分离液上,2250rpm离心30min,取云雾状单个核细胞层,用生理盐水洗3次,再依次以2000rpm、1800rpm、1600rpm离心去上清液,每次五分钟;将去上清液的细胞以上述配制的间充质干细胞无血清培养基重悬并调整密度至5×106cells/ml接种于6孔板中,置37℃5%C02饱和湿度培养箱中培养,每隔两天去上清液更换新鲜的上述配制的间充质干细胞无血清培养基并调整密度至5×106cells/ml,培养10天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。
UCMSCs(脐带间充质干细胞)体外培养:将无菌取得的足月妊娠分娩胎儿脐带充分洗涤去血渍后,剔除脐带动静脉,解剖刮取Wharton’s Jelly(间质组织),剪碎成约1mm3大小的组织块,生理盐水冲洗,用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基重悬,接种于培养瓶中,14天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。
将上述体外培养的BMSCs和UCMSCs用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基分别重悬并调整密度1×106cells/ml分别接种于培养瓶中,3天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞,为细胞周期检测和集落形成检测备用。
细胞周期检测:
将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后,以0.5×104cells/mL的密度接种于100mm培养皿中,分别培养6d后收获细胞,以-20℃预冷的70%乙醇固定,50μg/mL碘化丙锭(PI)染色,流式细胞仪(BD公司)检测10000个细胞,结果如图:骨髓间充质干细胞G0/G1期45.4%,G2/M期7.58%,S期46.9%,脐带间充质干细胞G0/G1期44.9%,G2/M期19.6%,S期35.5%,高比例的G0/G1期细胞显示这两种来源的间充质干细胞具有高度的分化潜能。
集落形成检测:
将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后,以200cells/well的密度接种于预铺了0.2%明胶的6孔板中,每3d换液,7d后结晶紫染色集落,相差显微镜下计集落数,超过50个细胞计为一个集落,每组设3个平行。
按下面公式计算集落形成率:
集落形成率(Colony-forming efficiency,CFE)(%)=(集落数/接种细胞数)×100%
结果显示:无血清扩增后的骨髓BMSCs和脐带UCMSCs的集落形成率分别为(14.00%±1.64%)和(11.67%±3.00%),细胞的集落形成能力无明显差异。等渗结晶紫染色细胞集落,见两组细胞的集落尺寸也无明显差异。