CN104211781A - 金黄色葡萄球菌裂解蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过筛选潜在编码金黄色葡萄球菌裂解蛋白基因，成功得到3个可纯化金黄色葡萄球菌裂解蛋白，并且都有活性，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示，其对应名称分别为SAly100、SAly102、SAly110。本发明制备的金黄色葡萄球菌裂解蛋白可以高效、特异裂解宿主细菌，不易产生耐药菌株，并且无毒无害，是抗生素的最佳替代品之一，可以用于治疗金黄色葡萄球菌感染引起的疾病，并可用作医疗消毒剂和添加剂。

Description

金黄色葡萄球菌裂解蛋白的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一系列新型的金黄色葡萄球菌裂解蛋白的制备，该系列蛋白可以用于治疗金黄色葡萄球菌感染引起的一系列疾病，还可以作为医疗外用消毒剂及添加剂使用，属于医学、兽医学及医疗器械类生物制剂领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性球菌，在环境中广泛存在，是医院内感染的重要病原菌之一，也是引起奶牛乳腺炎等的主要致病菌之一。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，在临床治疗中发现，金黄葡萄球菌对青霉素、金霉素、红霉素和庆大霉素高度敏感，但易产生耐药性；对链霉素中度敏感；但对磺胺、氯霉素敏感性差。

目前临床上普遍发现多种耐药菌株，对多种抗生素药物耐药，新出现的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)几乎可以抵抗所有的抗生素，被称为超级细菌，已成为医院内感染最常见的致病菌。耐药菌株导致感染治疗困难，病死率较高，已成为全球公共卫生体系的重大危害。畜牧业中，耐药金黄葡萄球菌引起的牛乳腺炎给奶牛养殖业造成的极大的损失，现在依然没有很有效的解决方法。因此，发展新的抗菌分子已刻不容缓。

噬菌体是以细菌为宿主的病毒，噬菌体有严格的宿主特异性，可以高效、特异性裂解宿主细菌，高效安全，对哺乳动物不具备侵染性。目前，临床上已经应用噬菌体治疗某些疾病。噬菌体裂解细菌的机制是噬菌体侵染宿主细菌，释放遗传信息，控制宿主细胞代谢，合成噬菌体自身的遗传信息和蛋白，在宿主体内组装成新的噬菌体。通过合成的裂解蛋白将宿主细胞壁裂解，细菌渗透压改变，细胞破碎，噬菌体释放。细菌噬菌体裂解蛋白具有高效、特异及不产生耐药菌株等特点。

细菌裂解蛋白序列和结构具有保守性，主要有两部分组成：一部分为催化结构域，另一部分为细胞壁结合结构域。细菌裂解蛋白通过细胞壁结合结构域特异性结合到细菌的细胞壁上，催化结构域特异性的识别细胞壁肽聚糖的切割位点裂解细胞壁，细菌由于细胞壁破裂，导致细菌内部渗透压过大，细胞膜破裂，细菌死亡。细菌裂解蛋白具有高效、特异，不易产生耐药菌株等特点，并且作用完毕后最终代谢成氨基酸，无毒无害，是替代抗生素的最佳候选之一，因此具有很重要的临床应用价值。

目前原核***表达细菌裂解蛋白具有表达量低、可溶性差及活性弱等缺点，不利用大规模的工业化生产。经过大量的筛选，本发明涉及的金黄色葡萄球菌裂解蛋白克服了以上缺点，更加利于大规模的工业生产和临床应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一系列金黄色葡萄球菌裂解蛋白的制备，检测以及该系列蛋白的应用。

发明概述

本发明通过筛选潜在编码金黄色葡萄球菌裂解蛋白基因，成功得到3个可纯化金黄色葡萄球菌裂解蛋白，并且都有活性，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示，其对应的名称分别为SAly100、SAly102、SAly110。本发明制备的金黄色葡萄球菌裂解蛋白可以高效、特异裂解宿主细菌，不易产生耐药菌株，并且无毒无害，是抗生素的最佳替代品之一，可以用于治疗金黄色葡萄球菌感染引起的疾病，并可用作医疗消毒剂和添加剂。

发明详述

本发明的技术方案如下：

一、金黄色葡萄球菌裂解蛋白

一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白，其序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白，其序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

二、金黄色葡萄球菌裂解蛋白的制备方法

本发明还提供了金黄色葡萄球菌裂解蛋白的制备方法，通过基因工程的方法获得，其步骤包括：

(1)首先进行人工基因合成，同时根据基因序列设计合成一对引物，在引物中引入酶切位点NdeI和XhoI，以合成的基因为模板，用合成的引物进行基因扩增，扩增程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，32个循环，72℃延伸5min，得到的基因扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过百泰克胶回收试剂盒回收基因扩增产物；

(2)用NdeI和XhoI分别酶切回收的基因扩增产物和原核表达载体pET28a，37℃酶切2h，然后用百泰克胶回收试剂盒回收酶切产物；酶切后的基因片段和表达载体用NEB T4连接酶16℃连接2h，连接产物全量转化DH5α感受态细胞，并涂布到含有卡那青霉素的LB平板上37℃倒置过夜培养；挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，将鉴定正确的单克隆提取质粒进行酶切鉴定，将酶切鉴定正确的单克隆进行DNA测序，对测序结果进行比对，结果显示与我们所需的DNA完全一致；

(3)将构建成功的重组表达载体转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆至LB培养基中做表达检测，通过SDS-PAGE胶鉴定表达量高的单克隆菌株保存甘油菌；

(4)将表达菌株甘油菌以1:1000的比例接种至50ml含有50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃210rpm过夜培养，5000rpm 10min离心收集菌体，用5ml LB液体培养基重悬，然后加入到含有50μg/ml Kan的1L LB液体培养基中37℃210rpm培养至OD600达0.6，加入终浓度0.5mM IPTG 20℃195rpm过夜诱导表达；5000rpm 10min离心收集菌体，收集的菌体用50mM PB 500mM NaCl 5mM咪唑pH 7.4重悬备用；

(5)将菌悬液加入蛋白酶抑制剂，在冰浴条件下超声破碎，超声破碎的溶液4℃18000rpm 30min离心去除沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤备用；

(6)蛋白纯化所用Ni亲和柱为预装柱，首先用Buffer A平衡柱子，然后通过蠕动泵将蛋白溶液上样至镍柱，将柱子连接至AKTA Primer机器上，用Buffer A洗脱柱子，直至基线洗平，依次换用10％Buffer A、20％Buffer A洗脱杂蛋白，最后用洗脱目的蛋白，收集目的蛋白，通过SDS-PAGE胶检测得到纯度达90％以上蛋白；

(7)将收集的目的蛋白过夜透析换液成0.01M PBS(pH 7.4)，浓缩贮存于液氮备用。

进一步，所述的Buffer A为50mM PB 500mM NaCl 5mM咪唑pH 7.4。

进一步，所述的Buffer B为50mM PB 500mM NaCl 500mM咪唑pH 7.4。

三、金黄色葡萄球菌裂解蛋白体外抑菌活性检测

所述金黄色葡萄球菌裂解蛋白采用微孔板法进行裂解蛋白活性检测，其具体步骤如下：

(1)采用的金黄色葡萄球菌菌株包括标准菌株CMCC26112，临床分离菌株共9株和临床分离耐药菌株MRSA；将37℃24h培养的金黄色葡萄球菌5000rpm离心10min收集菌体，用0.01M无菌PBS重悬菌体，然后在微孔板分别加入50μl重悬的菌液，实验组每孔加入5μl(1mg/ml)金黄色葡萄球菌裂解蛋白，对照组加入5μl 0.01MPBS，37℃培养箱中孵育，每隔15min用分光光度计检测OD600，记录实验数据；

(2)采用二倍稀释法检测所得金黄色葡萄球菌裂解蛋白的最小抑菌浓度(MIC)，取10支无菌试管排成一列，每支试管中加入1ml营养肉汤培养基，然后往第一支试管中加入1ml(1mg/ml)金黄色葡萄球菌裂解蛋白混匀，然后从第一管中吸取1ml加入到第二管中混匀，再从第二管中吸取1ml加入第三管中，依此类推，直至加到第八管，此时各管金黄色葡萄球菌裂解蛋白的浓度依次为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/ml，每管加入适量的金黄色葡萄球菌菌液，第九管作为阳性对照，只加菌液不加金黄色葡萄球菌裂解蛋白；第十管作为阴性对照不加菌液；将上述各管依次放入37℃培养箱培养20h，观察培养基的浑浊度，根据浑浊度判断金黄色葡萄球菌裂解蛋白的MIC。

本发明制备的金黄色葡萄球菌裂解蛋白可以高效、特异裂解宿主细菌，不易产生耐药菌株，并且无毒无害，是抗生素的最佳替代品之一，可以用于制备治疗金黄色葡萄球菌感染引起的一系列疾病的药物中的应用，并还可用作医疗消毒剂和添加剂等。

附图说明

图1为金黄色葡萄球菌裂解蛋白重组质粒构建流程图

图2SDS-PAGE胶检测重组金黄色葡萄球菌裂解蛋白纯化效果

1.SAly100 2.SAly102 3.SAly110

图3重组金黄色葡萄球菌裂解蛋白SAly100抑菌效果图

1-9为临床分离菌株 10为标准菌株CMCC26112

图4重组金黄色葡萄球菌裂解蛋白SAly102抑菌效果图

1-9为临床分离菌株 10为标准菌株CMCC26112

图5重组金黄色葡萄球菌裂解蛋白SAly110抑菌效果图

1-9为临床分离菌株10为标准菌株CMCC26112

图6重组金黄色葡萄球菌裂解蛋白对临床分离MRSA抑菌效果图

其中X轴为孵育培养时间，Y轴为Treated/Untreated OD600值，随着时间增长OD值降低，表明黄色葡萄球菌裂解蛋白对实验菌株有明显抑制效果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

1)金黄色葡萄球菌裂解蛋白基因克隆及表达载体构建

首先进行人工基因合成，同时根据基因序列设计合成一对引物，在引物中引入酶切位点NdeI和XhoI，设计的引物序列如下：

SAly100引物序列：

上游引物：GGAATTC CATATG GCTACTGTAAACGAA

下游引物：CCG CTCGAG TTACTTGAAAGTACCCCAAGCAT

SAly102引物序列：

上游引物：GGAATTC CATATG GCTACTTTAAACGAT

下游引物：CCG CTCGAG TTAAGAGAATGAACCAAAGC

SAly110引物序列：

上游引物：GGAATTC CATATG GCTACTTTAAACGAT

下游引物：CCG CTCGAG TTACTTGAATGAACCAAAATC

以合成的基因为模板，用合成的引物进行基因扩增，扩增程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，32个循环，72℃延伸5min。得到的基因扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过百泰克胶回收试剂盒回收基因扩增产物。用NEB公司的NdeI和XhoI分别酶切回收的基因扩增产物和原核表达载体pET28a，37℃酶切2h，然后用百泰克胶回收试剂盒回收酶切产物。酶切后的基因片段和表达载体用NEB T4连接酶16℃连接2h，连接产物全量转化DH5α感受态细胞，并涂布到含有卡那青霉素的LB平板上37℃倒置过夜培养。挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，将鉴定正确的单克隆提取质粒进行酶切鉴定，将酶切鉴定正确的单克隆进行DNA测序，对测序结果进行比对，结果显示与我们所需的DNA完全一致。

2)金黄色葡萄球菌裂解蛋白的诱导表达

将构建成功的重组表达载体转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆至LB培养基中做表达检测，通过SDS-PAGE胶鉴定表达量高的单克隆菌株保存甘油菌。将表达菌株甘油菌以1:1000的比例接种至50ml含有50μg/mlKan的LB液体培养基中，37℃210rpm过夜培养，5000rpm 10min离心收集菌体，用5ml LB液体培养基重悬，然后加入到含有50μg/ml Kan的1L LB液体培养基中37℃210rpm培养至OD600达0.6，加入终浓度0.5mM IPTG 20℃195rpm过夜诱导表达。5000rpm 10min离心收集菌体，收集的菌体用50mM PB 500mM NaCl 5mM咪唑pH7.4重悬备用。

3)金黄色葡萄球菌裂解蛋白纯化

将菌悬液加入蛋白酶抑制剂，在冰浴条件下超声破碎，超声破碎的溶液4℃18000rpm 30min离心去除沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤备用。

蛋白纯化所用Ni亲和柱为GE公司预装柱，首先用Buffer A(50mM PB 500mMNaCl 5mM咪唑pH 7.4)平衡柱子，然后通过蠕动泵将蛋白溶液上样至镍柱，将柱子连接至AKTA Primer机器上，用Buffer A(50mM PB 500mM NaCl 5mM咪唑pH 7.4)洗脱柱子，直至基线洗平，依次换用10％Buffer A、20％Buffer A洗脱杂蛋白，最后用Buffer B(50mM PB 500mM NaCl 500mM咪唑pH 7.4)洗脱目的蛋白，收集目的蛋白，通过SDS-PAGE胶检测得到纯度达90％以上蛋白。

将收集的目的蛋白过夜透析换液成0.01M PBS(pH 7.4)，浓缩贮存于液氮备用。

实施例2：金黄色葡萄球菌裂解蛋白体外抑菌活性检测

本发明采用微孔板法进行金黄色葡萄球菌裂解蛋白活性检测，采用的金黄色葡萄球菌菌株包括标准菌株CMCC26112，临床分离菌株共9株和临床分离耐药菌株MRSA。将37℃24h培养的金黄色葡萄球菌5000rpm离心10min收集菌体，用0.01M无菌PBS重悬菌体，然后在微孔板分别加入50μl重悬的菌液，实验组每孔加入5μl(1mg/ml)裂解蛋白，对照组加入5μl 0.01M PBS，37℃培养箱中孵育，每隔15min用分光光度计检测OD600，记录实验数据，实验结果如图4所示。

采用二倍稀释法检测所得金黄色葡萄球菌裂解蛋白的最小抑菌浓度(MIC)。

取10支无菌试管排成一列，每支试管中加入1ml营养肉汤培养基，然后往第一支试管中加入1ml(1mg/ml)金黄色葡萄球菌裂解蛋白混匀，然后从第一管中吸取1ml加入到第二管中混匀，再从第二管中吸取1ml加入第三管中，依此类推，直至加到第八管，此时各管金黄色葡萄球菌裂解蛋白的浓度依次为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、

62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/ml，每管加入适量的金黄色葡萄球菌菌液，第九管作为阳性对照，只加菌液不加金黄色葡萄球菌裂解蛋白；第十管作为阴性对照不加菌液。将上述各管依次放入37℃培养箱培养20h，观察培养基的浑浊度，根据浑浊度判断金黄色葡萄球菌裂解蛋白的MIC为7.8125-62.5μg/ml。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，本发明涉及的材料均为已知材料，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白，其序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白，其序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1-3所述的氨基酸序列，及与其同源性在80％、85％、90％、95％及以上的同源性序列。

5.权利要求1-3所述的一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白的制备方法，其步骤是：

(1)首先进行人工基因合成，并根据基因序列设计合成引物，在其中引入酶切位点NdeI和XhoI，以合成的基因为模板，用合成的引物进行基因扩增，电泳纯化后回收基因扩增产物；

(2)用NdeI和XhoI分别酶切回收的基因扩增产物和原核表达载体pET28a,回收酶切产物；酶切后的基因片段和表达载体用NEBT4连接酶连接,连接产物转化至DH5α感受态细胞，并涂布到含有卡那青霉素的LB平板上37℃倒置过夜培养；挑取单克隆菌落以PCR鉴定，将鉴定正确的单克隆菌株提取质粒酶切鉴定，并DNA测序确认；

(3)将构建成功的重组表达载体转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆至LB培养基中做表达检测，筛选表达量高的单克隆菌株保存甘油菌；

(4)将表达菌株甘油菌扩大培养，诱导表达。收集表达菌体，加入蛋白酶抑制剂，超声破碎后去除沉淀，上清滤膜过滤后以Ni亲和柱纯化，收集纯化的目的蛋白，以SDS-PAGE胶检测纯度。将纯度大于90％的目的蛋白过夜透析浓缩后存于液氮备用。

6.根据权利要求4所述的一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白的制备方法，其特征在于：

制备序列为SEQ ID NO.1金黄色葡萄球菌裂解蛋白步骤(1)中的引物为SAly100引物序列：

上游引物：GGAATTC CATATG GCTACTGTAAACGAA

下游引物：CCG CTCGAG TTACTTGAAAGTACCCCAAGCAT。

7.根据权利要求4所述的一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白的制备方法，其特征在于：

制备序列为SEQ ID NO.2金黄色葡萄球菌裂解蛋白步骤(1)中的引物为SAly102引物序列：

上游引物：GGAATTC CATATG GCTACTTTAAACGAT

下游引物：CCG CTCGAG TTAAGAGAATGAACCAAAGC。

8.根据权利要求4所述的一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白的制备方法，其特征在于：

制备序列为SEQ ID NO.2金黄色葡萄球菌裂解蛋白步骤(1)中的引物为SAly110引物序列：

上游引物：GGAATTC CATATG GCTACTTTAAACGAT

下游引物：CCG CTCGAG TTACTTGAATGAACCAAAATC。

9.权利要求1-3任一所述的一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白体外抑菌活性检测方法，所述金黄色葡萄球菌裂解蛋白采用微孔板法进行裂解蛋白活性检测，其具体步骤如下：

(1)将37℃24h培养的多种金黄色葡萄球菌标准菌株离心，收集菌体，重悬后加入微孔板，每孔分别加入50μl重悬的菌液，每孔2个重复，分别记为实验组和对照组；

(2)实验组每孔加入5μg金黄色葡萄球菌裂解蛋白，对照组加入5μL 0.01MPBS，37℃培养箱中孵育，每隔一定时间用分光光度计测定600nm的OD值，记录实验数据；

(2)采用二倍稀释法检测所得金黄色葡萄球菌裂解蛋白的最小抑菌浓度(MIC)，取8支含有1ml液体培养基的无菌试管，每管中分别加入最终浓度为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/ml金黄色葡萄球菌裂解蛋白，继续在其中加入适量的金黄色葡萄球菌菌液，另取2管，其中1管作为阳性对照，加入培养基和金黄色葡萄球菌菌液，另1管作为阴性对照，只加入培养基；将上述各管依次放入37℃培养箱培养20h，根据浑浊度判断金黄色葡萄球菌裂解蛋白的MIC。

10.权利要求1-3中的任意一项所述的一种金黄色葡萄球菌裂解蛋白在制备治疗金黄色葡萄球菌感染引起的一系列疾病的药物或医疗消毒剂或添加剂中的应用中的应用。