CN106694521B - 一种金属离子强化嗜热溶胞菌用于抗生素菌渣减量化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物降解领域，具体涉及一种采用金属离子强化嗜热溶胞菌用于抗生素菌渣减量化的方法。本发明采用金属离子强化的嗜热溶胞菌作为抗生素菌渣处理菌株，其在有氧发酵的条件下使抗生素菌渣减量40%以上，菌渣中的抗生素残留去除率最高达90%以上。本方法的优点是抗生素菌渣减量化程度高，残留去除率高。此法简单，易于操作，占地面积小，投资成本低，并且不会对环境产生二次污染，具有明显的经济效益、社会效益和环保效益。
Description
技术领域
本发明属于生物降解领域，具体地说，涉及一种采用金属离子强化嗜热溶胞菌用于抗生素菌渣减量化的方法。
背景技术
抗生素在人类的生存和发展以及畜牧业生产中发挥着巨大的作用。到目前为止，抗生素在其应用领域依然是无法被其他物质所取代的。抗生素菌渣是抗生素生产过程的必然产物。这些菌渣因含有丰富的蛋白质、多糖、氨基酸，2008年前一直被采用干燥加工等技术处理后或作为饲料、饲料添加剂，或作为肥料、生产复合肥的原料被进行综合利用。但因为抗生素菌渣中抗生素残留较高，如头孢菌素C 在菌渣中的残留约2 ～ 2. 5mg/g ，青霉素在菌渣中的残留约1～2mg/g，红霉素在菌渣中的残留约0. 2～ 0.9mg/g ，土霉素在菌渣中的残留约0. 5 ~ 2. l mg/g，四环素在菌渣中的残留约0. 5 ~ 2mg/g这些残留物最终都会通过食物链进入动物体内和人体内。长期摄入含有氨基糖苷类抗生素残留的食品会导致肾毒性和耳毒性；长期摄入含有头孢类青霉素类抗生素残留的食品导致哮喘、紫斑；另外它会使病原菌耐药性增加，从而带来预防与治疗某些人类疾病和牲畜家禽疾病的困难，最后导致无药可治；而将它们作肥料使用会造成土壤中的微生物生态环境的严重失调，土壤肥力下降，加速石漠化沙漠化；同时影响我国畜产品的出口贸易。
2008年后，国家将抗生素菌渣列为危险废物，按危险废物处置只能焚烧。我国己经成为全球最大的抗生素原料药生产国和出口国，原料药产量己占全球总产量的80%，其中出口占到全世界原料药市场的70%以上。2012 年全国生产抗生素约14 万吨，其菌渣超过150万吨。菌渣的焚烧成本己成为抗生素工业生存和发展的瓶颈。
对抗生素菌渣的处理，一直都在寻求更妥善的处置途径。许多科研机构及制药企业开展了抗生素菌渣无害化处置和不同用途的研究。环境保护部门也非常重视和鼓励抗生素菌渣处置等新技术的开发。例如，比较成功的有1) 药渣炭化处置；2) 生物质能热电联供技术，但是，有关微生物降解领域的研究还很少。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种嗜热微生物复合菌剂处理抗生素菌渣的方法，特别是一种采用金属离子强化嗜热溶胞菌用于抗生素菌渣减量化的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种采用金属离子强化嗜热溶胞菌用于抗生素菌渣减量化的方法，包括以下步骤：
（1）嗜热溶胞菌活化
以液体培养基为试验活化嗜热溶胞菌所用的培养基，取嗜热溶胞菌按体积比6-12%接种于液体培养基中，置于55-65℃、110-130 r/min条件下的恒温摇床中恒温培养66-80 h，将菌液取出后稀释100-1000000倍，得稀释液，在无菌条件下将稀释液滴于固体培养基中，进行平板涂布分离，将涂布后的平板倒置于55-65℃恒温培养箱中静置培养20-28h，微生物在固体培养基上会形成单个菌落，根据菌落的形态特征，在固体培养基上划线分离纯化，得到单菌，将分离后得到的单菌菌株在2-6℃冰箱中保存，备用；
（2）金属离子强化嗜热溶胞菌对菌渣减量化处理
将步骤（1）中冷藏的单菌接种到液体培养基中活化20-28 h得嗜热溶胞菌菌液，在离心管中加入抗生素菌渣后，加入体积比为6-12%的OD600nm为0.6-0.8的嗜热溶胞菌菌液，加入金属离子溶液，将有机负荷和pH值分别调节至0.8-1.2 kgCOD/(m3·d)和6.8-7.2，然后将其均置于温度55-65℃，转速110-130 r/min恒温摇床中进行强化减量化处理，处理时间为1-48h。
进一步地，所述液体培养基组成为：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL，pH=7.0，121℃条件下灭菌20 min；固体培养基为在液体培养基中加入质量比为2%的琼脂。
进一步地，所述金属离子为钾离子、钠离子或钙离子。所述金属离子的浓度为100-400μmol·L-1。
进一步地，所述抗生素菌渣包括但不限于头孢菌素菌渣、土霉素菌渣、红霉素菌渣和青霉素菌渣。
进一步地，所述步骤（1）中嗜热溶胞菌按体积比10%接种于液体培养基中，置于60℃、120 r/min条件下的恒温摇床中恒温培养72 h。
进一步地，所述步骤（1）中稀释液在固体培养基中的培养温度为60℃，培养时间为24 h。
进一步地，步骤（2）中有机负荷和pH值分别调节至1.0 kgCOD/(m3·d)和7.0，将其均置于温度60℃，转速120 r/min恒温摇床中进行强化减量化处理。
其中，嗜热溶胞菌是从上海麦森医疗科技有限公司购买的商业菌种。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供一种在抗生素菌渣中加入金属离子强化嗜热溶胞菌，使抗生素菌渣减量化，并使菌渣中的抗生素残留降低的方法。本发明采用金属离子强化的嗜热溶胞菌作为抗生素菌渣处理菌株，其在有氧发酵的条件下使抗生素菌渣减量40%以上，菌渣中的抗生素残留去除率最高达90%以上。本方法的优点是抗生素菌渣减量化程度高，残留去除率高。此法简单，易于操作，占地面积小，投资成本低，并且不会对环境产生二次污染，具有明显的经济效益、社会效益和环保效益。
附图说明
图1 不同浓度金属离子对SS的影响（a: Na+; b: K+; c: Ca2+）；
图2 不同浓度金属离子对SCOD的影响（a: Na+; b: K+; c: Ca2+）；
图3 不同浓度金属离子对NH4 +-N的影响（a: Na+; b: K+; c: Ca2+）。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的说明。下面以青霉素菌渣为例进行试验，但并不限定本发明的保护范围，本发明的方法用于处理其它抗生素菌渣时具有相近的减量化效果，这里不一一赘述。
实施例1 嗜热溶胞菌的活化
牛肉膏蛋白胨培养基为试验活化嗜热溶胞菌所用的培养基，其液体培养基具体组成成分如下：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL，pH=7.0，121℃条件下灭菌20 min。固体培养基即为液体培养基中加入2%的琼脂。
取嗜热溶胞菌按10%（v/v）接种于液体培养基中，置于60℃、120r/min条件下的恒温摇床中恒温培养72h。将菌液取出后，采用10倍梯度稀释法进行稀释，制得10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的稀释液，在无菌条件下将各个浓度的0.1 mL稀释液滴于固体培养基中，进行平板涂布分离，将接种好的平板倒置于60℃恒温培养箱中静置培养。稀释10-4后进行平板涂布的菌株生长情况。嗜热溶胞菌在固体培养基上会呈现出不同的群体形态特征，根据菌落的形态特征，挑取单菌，在固体培养基上划线分离，根据其形态特征的不同分离纯化，得到单菌。将分离后得到的菌株在4℃冰箱中保存，以便后续使用。其中嗜热溶胞菌是从上海麦森医疗科技有限公司购买的商业菌种。
实施例2 青霉素菌渣的处理
在50 mL离心管中加入青霉素菌渣后，加入10%（v/v）的OD600nm = 0.8的嗜热菌菌液，加入金属离子溶液，使其浓度分别在100 μmol·L-1、200 μmol·L-1和400 μmol·L-1并设置空白对照组，有机负荷和pH值分别调节至1.0 kgCOD/(m3·d)和7.0左右。然后，将其均置于温度60℃，转速120 r/min恒温摇床中进行强化减量化试验，每一浓度金属离子条件下设置2组平行试验。试验过程中蒸发掉的水分用蒸馏水补足至初始反应容积，在1 h、2 h、4h、16 h、24 h、38 h和46 h从摇床中取出离心管，测定SS、SCOD和NH4 +-N浓度。
（1）SS的去除率的变化
Na+、K+和Ca2+浓度分别为100 μmol·L-1、200 μmol·L-1和400 μmol·L-1和未加入金属离子条件下嗜热溶胞菌对青霉素菌渣减量化过程中SS的变化情况见图1。
由图1可知，金属离子在一定浓度范围内，3种金属离子在嗜热溶胞菌好氧消化青霉素菌渣减量化过程均具有促进作用。Na+的浓度在200 μmol·L-1时对青霉素菌渣有较好的减量效果，48 h后，菌渣的去除率达到90.96%，说明菌渣的细胞结构和胞外聚合物遭到破坏，嗜热溶胞菌释放的主要为蛋白酶和淀粉酶的胞外酶在Na+的促进下强化了菌渣的减量化效果，Na+在100 μmol·L-1 和400 μmol·L-1浓度下菌渣的去除率分别达到66.20%和65.12%，且在反应前6 h菌渣的去除效果明显。过低或过高浓度的金属离子虽对减量化效果有一定的促进作用，但作用效果不明显。K+在ATP水解，磷的传递过程中起着重要作用，K+浓度为200 μmol·L-1时菌渣的去除率达82.32%，随着反应进行，菌渣中的固体物质不断溶解，SS逐渐减小。K+浓度为100 μmol·L-1和400 μmol·L-1时SS也下降明显，菌渣的去除率分别达到40.27%和47.73%，说明K+在适宜的浓度范围内对青霉素菌渣的减量效果也有促进作用。Ca2+活化中心蛋白酶，可以促进细胞的生长与分泌， Ca2+在改变酶分子维持酶活性中心的稳定性和高活性中起着重要作用。试验结果表明，Ca2+浓度为100 μmol·L-1、200 μmol·L-1和400 μmol·L-1时菌渣的去除率分别为46.09%、78.66%和64.38%，减量效果相对明显，对嗜热溶胞菌对青霉素菌渣的减量化起到了促进作用，且达到相同减量效果的时间较没有加入金属离子的时间大为降低。
（2）SCOD的变化
SCOD的变化趋势可以反映菌渣溶解的程度，接种嗜热溶胞菌后，随着嗜热菌胞外酶的释放，水解反应的进行，菌胶团和胞外聚合物水解，细胞内的有机物得以释放，使SCOD得以升高，各种金属离子对SCOD的影响如图2所示。
从图2中可以看出，K+浓度为200 μmol·L-1时SCOD增长迅速，在4 h左右达到最大值，此时胞内的有机物质如蛋白质、多糖、脂肪等由固相转移到液相，SCOD值出现明显的升高，比空白试验提前20 h达到最大值，且最大值略高于空白试验，在达到相同溶胞率时大大缩短了反应时间。K+浓度为100 μmol·L-1条件下，反应前期SCOD增长缓慢，16 h后开始大幅增长，24 h时达到最大值，最高可达3700 mg/L，但仍低于K+浓度为200 μmol·L-1时的SCOD浓度，之后SCOD开始明显下降。K+浓度为400 μmol·L-1条件下，反应前期SCOD增长迅速，在16 h左右达到最大值，16 h后SCOD含量下降，显然过高或过低浓度的K+均未对嗜热溶胞菌的溶胞效果起到明显的促进作用。Na+浓度为200 μmol·L-1时，SCOD在2 h时迅速达到最大，最高可达3 943mg/L，相比空白提高了32.36%，随着反应的进行，SCOD开始下降，可能是部分有机物挥发，以及嗜热溶胞菌可能利用溶解的有机质作为碳源生长。而当加入的金属离子为Ca2+时，SCOD浓度的变化并不明显，对嗜热溶胞菌的溶胞效果未起到明显的促进作用。
（3）NH4 +-N的浓度的变化
Na+、K+和Ca2+浓度分别为100 μmol·L-1、200 μmol·L-1和400 μmol·L-1和未加入金属离子条件下嗜热溶胞菌好氧消化青霉素菌渣过程中NH4 +-N的变化情况见图3。
在水解过程中NH4 +-N的浓度会影响后续厌氧消化实验的性能和所产生的甲烷的含量，菌渣中NH4 +-N含量与溶胞作用相关，细胞壁破裂释放胞内蛋白质，通常6.25 g的蛋白质中含有约1 g的氮，这些氮主要分布在悬浮固体中，蛋白质在高温消化时会不断溶出，溶出率不断增高，菌渣中的蛋白质在嗜热溶胞菌的作用下溶解，同时菌渣在高温条件下，发生水解作用，生成多肽、二肽、氨基酸等小分子物质，氨基酸进一步水解成有机酸、氨及CO2，并且高温能促进NH4 +-N转为氨气，挥发出去，从而溶液中NH4 +-N的含量经历一个先升高后降低的过程。在添加金属离子后，NH4 +-N浓度的变化趋势如图3所示，高浓度的Na+在4 h时NH4 +-N浓度比空白提高15.68%，比空白试验提前了20 h达到最大值。同样在4 h时，K+浓度在200 μmol·L-1条件下NH4 +-N浓度达到102.04 mg/L，之后NH4 +-N的浓度逐渐趋于平缓最后下降，而过高或过低浓度的K+存在的条件下，NH4 +-N浓度的变化趋势也为先升高后降低，但变化趋势较小。而加入Ca2+后，随着反应的进行，NH4 +-N浓度一直降低。
Claims (7)
1.一种金属离子强化嗜热溶胞菌用于抗生素菌渣减量化的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）嗜热溶胞菌活化
以液体培养基为试验活化嗜热溶胞菌所用的培养基，取嗜热溶胞菌按体积比6-12%接种于液体培养基中，置于55-65℃、110-130 r/min条件下的恒温摇床中恒温培养66-80 h，将菌液取出后稀释100-1000000倍，得稀释液，在无菌条件下将稀释液滴于固体培养基中，进行平板涂布分离，将涂布后的平板倒置于55-65℃恒温培养箱中静置培养20-28h，微生物在固体培养基上会形成单个菌落，根据菌落的形态特征，在固体培养基上划线分离纯化，得到单菌，将分离后得到的单菌菌株在2-6℃冰箱中保存，备用；
（2）金属离子强化嗜热溶胞菌对菌渣减量化处理
将步骤（1）中冷藏的单菌接种到液体培养基中活化20-28 h得嗜热溶胞菌菌液，在离心管中加入抗生素菌渣后，加入体积比为6-12%的OD600nm为0.6-0.8的嗜热溶胞菌菌液，加入金属离子溶液，将有机负荷和pH值分别调节至0.8-1.2 kgCOD/(m3·d)和6.8-7.2，然后将其均置于温度55-65℃，转速110-130 r/min恒温摇床中进行强化减量化处理，处理时间为1-48h；
所述金属离子为钾离子、钠离子或钙离子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基组成为：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL，pH=7.0，121℃条件下灭菌20 min；固体培养基为在液体培养基中加入质量比为2%的琼脂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属离子的浓度为100-400μmol·L-1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗生素菌渣包括但不限于头孢菌素菌渣、土霉素菌渣、红霉素菌渣和青霉素菌渣。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中嗜热溶胞菌按体积比10%接种于液体培养基中，置于60℃、120 r/min条件下的恒温摇床中恒温培养72 h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中稀释液在固体培养基中的培养温度为60℃，培养时间为24 h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中有机负荷和pH值分别调节至1.0kgCOD/(m3·d)和7.0，将其均置于温度60℃，转速120 r/min恒温摇床中进行强化减量化处理。
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