CN102757973B - 一种具有溶栓活性的海蚯蚓纤溶酶的cDNA序列及其氨基酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码海蚯蚓纤溶酶的cDNA序列及其氨基酸序列，分别如序列表中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，属于医药生物工程领域。本发明的有益效果是：根据本发明的海蚯蚓纤溶酶的cDNA序列，可以从海蚯蚓的消化道组织中克隆该纤溶酶的编码基因。该编码基因通过基因重组技术，可以在原核表达***或真核表达***中获得表达。重组海蚯蚓纤溶酶具有纤维蛋白酶原激活活性，可作为新的基因工程溶栓药物。

Description

一种具有溶栓活性的海蚯蚓纤溶酶的cDNA序列及其氨基酸序列

技术领域

本发明涉及一种海蚯蚓纤溶酶，具体地说是一种具有溶栓活性的海蚯蚓纤溶酶的cDNA序列及其氨基酸序列，属于医药生物工程领域。

背景技术

血栓性疾病严重威胁着人类健康，临床上迫切需要寻找安全高效低毒的新型溶栓剂。纤溶酶（Fibrinolytic enzyme），大多属于丝氨酸蛋白酶家族，该家族的蛋白酶催化活性中心Ser附近含高度保守序列GDSGGP，主要裂解纤维蛋白和纤维蛋白原中Lys或Arg羧基端的肽键使其被降解成许多具有抗凝作用的可溶性小肽；有的纤溶酶还作为纤溶酶原激活剂，间接发挥溶栓作用。临床上已正式批准使用的纤溶酶有尿激酶、链激酶、葡激酶以及从蚯蚓体内提取的天然溶栓药物蚓激酶等。

海蚯蚓(Arenicola cristata),属于海洋环节动物门多毛纲小头虫目沙蠾科，形似蚯蚓，生活于潮间带多沙地带，营管居生活，故名海蚯蚓。主要分布于我国渤海、黄海沿岸。海蚯蚓始载于《中国药用动物志》，用于痈疮肿毒，有清热解毒之功效。目前对海蚯蚓的研究方向主要集中在其形态结构、生理代谢、营养成分分析等方面。关于海蚯蚓纤溶酶的cDNA序列、氨基酸序列及其功能在国内外尚无研究和报道。

发明内容

本发明提供一种具有溶栓活性的海蚯蚓纤溶酶的cDNA序列及其氨基酸序列。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

以来自海蚯蚓消化道上皮细胞的mRNA为模板，采用同源序列克隆法，通过3′RACE、5′RACE技术，获得了一种编码具有溶栓活性的海蚯蚓纤溶酶的cDNA序列。将该序列表达活性肽的部分克隆到表达载体上，在原核表达***（如大肠杆菌）或真核表达***（如酵母、动物细胞等）生产具有溶栓活性的重组海蚯蚓纤溶酶。重组海蚯蚓纤溶酶具有纤维蛋白酶原激活活性，可作为新型的基因工程药物。

海蚯蚓纤溶酶cDNA序列的克隆：

（1）设计引物：根据丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶催化活性中心Ser附近所含的高度保守序列GDSGGP设计引物。

（2）目的基因cDNA 3′端序列扩增及测序：由步骤（1）得到引物，和来自海蚯蚓消化道组织的总cDNA为模板，通过3′RACE（cDNA3′末端快速扩增技术）扩增海蚯蚓纤溶酶的基因cDNA 3′端序列。 PCR产物胶回收后分别连TA克隆载体，转化细菌E.coli DH5α，测序。

（3）目的基因cDNA 5′端序列扩增及测序：根据获得的目的基因cDNA 3′端序列设计两对特异性引物，以来自海蚯蚓消化道组织的总cDNA为模板，采用5′RACE（cDNA 5′末端快速扩增技术），进行套式PCR，扩增海蚯蚓纤溶酶基因cDNA 5′端序列。PCR产物胶回收后分别连TA克隆载体，转化细菌E.coli DH5α，测序。

（4）拼接：应用contigexpress软件对步骤（2）和（3）得到的目的基因cDNA 3′端和5′端序列进行拼接，获得本发明的海蚯蚓纤溶酶编码基因的DNA（mRNA）序列。

（5）根据上述步骤（4）得到的DNA（mRNA）序列，使用DNAMAN软件，获得该海蚯蚓纤溶酶cDNA编码的氨基酸序列。

一种具有溶栓活性的海蚯蚓纤溶酶的编码基因序列，该序列如下：

1        ATCCCAGATC ATCAGTGACC CGGACAACCA ACCTCAACCC ATGAAGTTCC TTCTGCTGTC

61       TGCCCTCGTG GCCCTGGCCT CTGCTGCCCC TAGCTTCAAG GCTCCTGCAC CAAGCCTCAT

121      TTTCTCCAAT GATGGCTACA TTGTTGGTGG CGATGAGGCT GCTGTAGGCC AGTTTCCCTT

181      CCAGGCTGTT CTGCTGTCCT CTACCAGCCC TGGTGGCAGT CTGACCTGTG GAGGTGTCTA

241      CATTGGTGCC AATAGTGGTG GAAATCATTG GCTTTTGAAC GCTGCTCACT GCACCCAGTC

301      CAGTGCCCGT AGCACATGGT TGGGCCTCCA CAGACGCAGT GACACTAGCG ATGGACAGCA

361      CTTCACCTTC GTCCGTATTG TGAACCATCC CAACTATGGC TCTGGAGCTG GTGCTTTCCC

421      CAATGACATC AGCTTGTGTG AGATCAATGG CGTTGTTGAC ACCAGTGGCA ATGTTGGTGC

481      TGCTGTCTTG GCTGAGGGAG ATAATGACTA TGCTGGAGTA AGCGCTATCA TTTCTGGATG

541      GGGAAGAACT TGTGGAGGCT GTGCCCTGCC AGATGAACTG CGGTTTGTTC AGACCACTGT

601      CCTCCCCAAC TATGGAGCTA ACTCTTGCCA GACTGACTGG GGCAGCAATG TCAATGATGG

661      ACACATCTGT GTCAAGTCTG AAAACCAGGA CTCTGGAGCT TGCAATGGTG ACAGTGGTGG

721      CCCCATGTCC ATTGGAAACA CAGTTATTGG AGTGACATCC TGGGGAGCCT CTGGATGTCT

781      GACCTCCTAC CCATCTGCCT ACTCCAGGGT CTCCTTCTTC CGTGACTGGA TCAGAGAGGT

841      GTCTGACATC TAAAGCAATC AGCTGTTATG ACTGCTTTGT AATAATACCA GAGCATCAAT

901      AAAAATTGCA AACAAAATTA TAAAAAAAAA AAAAAAA

序列中划线标示的ATG为起始密码子，划线标示的的TAA为终止密码子。

以上序列为编码海蚯蚓纤溶酶的原始cDNA序列，通过基因工程的方法可对其结构进行改造，得到海蚯蚓纤溶酶cDNA序列的衍生序列。该衍生序列包括新分离的具有与以上所述结构同样基本结构的基因序列以及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、***、缺失获得的该基因序列的各种突变体。

根据海蚯蚓纤溶酶的原始cDNA序列，得到一种具有溶栓活性的海蚯蚓纤溶酶的氨基酸序列。该序列如下：

1        MKFLLLSALV ALASAAPSFK APAPSLIFSN DGYIVGGDEA AVGQFPFQAV LLSSTSPGGS

61       LTCGGVYIGA NSGGNHWLLN AAHCTQSSAR STWLGLHRRS DTSDGQHFTF VRIVNHPNYG

121      SGAGAFPNDI SLCEINGVVD TSGNVGAAVL AEGDNDYAGV SAIISGWGRT CGGCALPDEL

181      RFVQTTVLPN YGANSCQTDW GSNVNDGHIC VKSENQDSGA CNGDSGGPMS IGNTVIGVTS

241      WGASGCLTSY PSAYSRVSFF RDWIREVSDI

划线标示部分（MKFLLLSALV ALASA）为该蛋白酶的信号肽序列。黑体GDSGGP为丝氨酸蛋白酶家族的高度保守序列。

该序列为海蚯蚓纤溶酶的原始氨基酸序列，通过改构可得到一种具有溶栓活性的海蚯蚓纤溶酶的氨基酸序列的衍生序列，包括在原始氨基酸序列基础上进行单个或多个氨基酸的置换、***、缺失等形成的各种变构体。

本发明的有益效果是：根据本发明的海蚯蚓纤溶酶的cDNA序列，可以从海蚯蚓消化道组织总cDNA中克隆该酶的编码基因。通过基因重组技术，使该酶的编码基因在原核表达***（如大肠杆菌）或真核表达***（如酵母细胞或动物细胞）中表达。重组海蚯蚓纤溶酶具有纤维蛋白酶原激活活性，可作为潜在的新型溶栓药物。

附图说明

图1为海蚯蚓纤溶酶全长cDNA序列克隆的实验步骤流程图；

图2为海蚯蚓纤溶酶重组蛋白表达纯化及活性测定的实验步骤流程图；

图3为海蚯蚓纤溶酶编码序列在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析图；

图4为纯化的重组海蚯蚓纤溶酶的SDS-PAGE分析图；

图5为重组海蚯蚓纤溶酶的纤维蛋白酶原激活活性测定图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

海蚯蚓纤溶酶全长cDNA的克隆及序列测定。

实验材料：

1.海蚯蚓，采自烟台市近海；

2.Trizol试剂、 3′RACE试剂盒、5′RACE试剂盒（北京吉百特），反转录试剂盒（fermentas公司），T-A Easy试剂盒、Wizard纯化DNA试剂盒、DNase、 RNase H（Promega公司），高保真Taq酶（大连宝生物）。

实验方法：如图1所示，包括以下步骤：

1．设计引物序列： 

引物名称	序列
		3R	5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′
3F1	5′-GGATCTTGCAATGGTGACAGCGGTG-3′
		3R1	5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′
5R	5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′
		5F1	5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGG-3′
5R1	5′-CACCTCTCTGATCCAGTCACGGAAG-3′
		5F2	5′-CCACGCGTCGACTAGTACG-3′
5R2	5′-GGAGTAGGCAGATGGGTAGGAGGTC-3′

3R为含接头引物序列的反转录引物；3R1为3′端接头引物；3F1是根据丝氨酸蛋白酶家族催化活性中心Ser附近所含的高度保守序列GDSGGP设计的引物。5R为oligodT反转录引物。5R1、5R2是根据3′RACE获得的3′端序列设计的特异性引物；5F1为含5′端接头引物序列的引物；5F2为5′端接头引物。

2．海蚯蚓纤溶酶基因cDNA 3′端序列的克隆

3′RACE实验步骤：

1） 取鲜活海蚯蚓肠道组织提取总RNA。

2） 以3R作为反转录引物使用fermentas公司第一链cDNA合成试剂盒进行反转录。

3） 3′末端序列扩增：

PCR反应体系：

按下列组份配制PCR反应液。   

LA TAQ DNA Polymerase（5U/μl）	1μl
		10×PCR Buffer	5μl
dNTP Mixture（各2.5 mM）	4μl
		反转录产物	1μl
引物 3F1（10pM）	2μl
		引物 3R1（10pM）	2μl
灭菌蒸馏水	up to 50μl

    PCR反应条件：

95℃ 5分钟； 95℃ 40秒 60℃30秒 72℃ 1分钟  35个循环； 72℃10分钟。

4)PCR产物胶回收后连TA克隆载体,转化细菌E.coli DH5α，测序。

3．海蚯蚓纤溶酶基因cDNA 5′端序列的克隆

5′RACE实验步骤：

1) 取鲜活海蚯蚓肠道组织提取总RNA。

2）以5R—oligodT作为反转录引物使用fermentas公司第一链cDNA合成试剂盒进行反转录,过柱纯化反转录产物。

3）使用dCTP和TdT对纯化的cDNA加尾,过柱纯化加尾产物。

4) 5′末端序列扩增：

第一轮PCR反应体系：

按下列组份配制PCR反应液。   

LA TAQ DNA Polymerase（5U/μl）	1μl
		10×PCR Buffer	5μl
dNTP Mixture（各2.5 mM）	4μl
		加尾产物	1μl
引物 5F1（10pM）	2μl
		引物 5R1（10pM）	2μl
灭菌蒸馏水	up to 50μl

    PCR反应条件：

95℃ 5分钟； 95℃ 40秒 60℃30秒 72℃ 1分钟  35个循环； 72℃10分钟。

第二轮PCR反应体系：

按下列组份配制PCR反应液。   

LA TAQ DNA Polymerase（5U/μl）	1μl
		10×PCR Buffer	5μl
dNTP Mixture（各2.5 mM）	4μl
		加尾产物	1μl
引物 5F2（10pM）	2μl
		引物 5R2（10pM）	2μl
灭菌蒸馏水	up to 50μl

    PCR反应条件：

95℃ 5分钟； 95℃ 40秒 60℃30秒 72℃ 1分钟  35个循环； 72℃10分钟。

5）取第二轮PCR产物电泳胶回收纯化，连接TA克隆载体，转化细菌E.coli DH5α，测序。

4．应用Contigexpress软件对海蚯蚓纤溶酶基因cDNA 5′端和3′端序列进行拼接。

获得海蚯蚓纤溶酶基因cDNA全长序列，如下：

1        ATCCCAGATC ATCAGTGACC CGGACAACCA ACCTCAACCC ATGAAGTTCC TTCTGCTGTC

61       TGCCCTCGTG GCCCTGGCCT CTGCTGCCCC TAGCTTCAAG GCTCCTGCAC CAAGCCTCAT

121      TTTCTCCAAT GATGGCTACA TTGTTGGTGG CGATGAGGCT GCTGTAGGCC AGTTTCCCTT

181      CCAGGCTGTT CTGCTGTCCT CTACCAGCCC TGGTGGCAGT CTGACCTGTG GAGGTGTCTA

241      CATTGGTGCC AATAGTGGTG GAAATCATTG GCTTTTGAAC GCTGCTCACT GCACCCAGTC

301      CAGTGCCCGT AGCACATGGT TGGGCCTCCA CAGACGCAGT GACACTAGCG ATGGACAGCA

361      CTTCACCTTC GTCCGTATTG TGAACCATCC CAACTATGGC TCTGGAGCTG GTGCTTTCCC

421      CAATGACATC AGCTTGTGTG AGATCAATGG CGTTGTTGAC ACCAGTGGCA ATGTTGGTGC

481      TGCTGTCTTG GCTGAGGGAG ATAATGACTA TGCTGGAGTA AGCGCTATCA TTTCTGGATG

541      GGGAAGAACT TGTGGAGGCT GTGCCCTGCC AGATGAACTG CGGTTTGTTC AGACCACTGT

601      CCTCCCCAAC TATGGAGCTA ACTCTTGCCA GACTGACTGG GGCAGCAATG TCAATGATGG

661      ACACATCTGT GTCAAGTCTG AAAACCAGGA CTCTGGAGCT TGCAATGGTG ACAGTGGTGG

721      CCCCATGTCC ATTGGAAACA CAGTTATTGG AGTGACATCC TGGGGAGCCT CTGGATGTCT

781      GACCTCCTAC CCATCTGCCT ACTCCAGGGT CTCCTTCTTC CGTGACTGGA TCAGAGAGGT

841      GTCTGACATC TAAAGCAATC AGCTGTTATG ACTGCTTTGT AATAATACCA GAGCATCAAT

901      AAAAATTGCA AACAAAATTA TAAAAAAAAA AAAAAAA

其编码的氨基酸序列为：

1        MKFLLLSALV ALASAAPSFK APAPSLIFSN DGYIVGGDEA AVGQFPFQAV LLSSTSPGGS

61       LTCGGVYIGA NSGGNHWLLN AAHCTQSSAR STWLGLHRRS DTSDGQHFTF VRIVNHPNYG

121      SGAGAFPNDI SLCEINGVVD TSGNVGAAVL AEGDNDYAGV SAIISGWGRT CGGCALPDEL

181      RFVQTTVLPN YGANSCQTDW GSNVNDGHIC VKSENQDSGA CNGDSGGPMS IGNTVIGVTS

241      WGASGCLTSY PSAYSRVSFF RDWIREVSDI

实施例2

重组表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达。

实验材料： 内切酶BamHI、XhoI（大连宝生物），表达载体pET-21a、E.coliBL21为本室保存，IPTG（北京东胜泰博），超声波裂解仪（上海比朗）。

实验方法：如图2所示，包括以下步骤：

1.     根据获得的cDNA序列，设计一对引物:

F	5′-TTATGGATCCATTGTTGGTGGCGATGAG-3′
		R	5′-AATACTCGAGGATGTCAGACACCTCTCTGATC-3′

上游引物F中含BamHI酶切位点，下游引物R中含XhoI 酶切位点。

以海蚯蚓纤溶酶的cDNA为模板，利用pfu DNA聚合酶扩增不含信号肽编码区即活性肽的cDNA片段。

2．将该PCR产物利用酶切、连接的方法与原核表达载体pET-21a相连。将表达载体转化E.coliBL21(DE3)，构建工程菌。

3．挑取工程菌单菌落，接种于5ml含100μg/ml 氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜。取50μl转接到5ml同样培养基中继续37℃培养4h。取1ml菌液作为诱导前对照，剩余菌液加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至1.0 mM,继续30℃培养4h，8000×g离心5min收集菌体。

4．菌体按每1ml菌液加50μl Tris-CL缓冲液（20mM,pH7.4,10mM 咪唑，0.5M NaCl），超声破碎。4℃ 12000×g离心30min，取上清和沉淀，沉淀用缓冲液按每1ml菌液菌体加50μl的量重悬沉淀，上清和沉淀各取10μl进行SDS-PAGE分析。结果如图3所示：M蛋白质分子量标准；1诱导前上清；2诱导前沉淀；3诱导后上清；4诱导后沉淀。在28KD处可见有重组海蚯蚓纤溶酶融合蛋白，主要以包涵体形式存在，上清中含量较少。

实施例3

重组海蚯蚓纤溶酶的分离纯化。

实验材料： 镍柱填料、超滤管（北京东胜泰博）。

实验方法：如图2所示，包括以下步骤：

1.挑取工程菌单菌落，接种于5ml含100μg/ml 氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜。转接到500ml同样培养基中继续37℃培养4h。加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至1.0 mM，继续30℃培养4h，8000×g离心5min收集菌体。

2.菌体重悬于25ml Tris-CL缓冲液（20mM,pH7.4,10mM 咪唑，0.5M NaCl），超声破碎细胞，4℃ 12000×g离心30min，取上清液。

3.上清液流过Ni²⁺树脂柱，50ml洗涤液洗涤（20mM Tris-CL,pH7.4,10mM 咪唑，0.5M NaCl）。

4.用洗脱液（20mM Tris-CL,pH7.4,500mM 咪唑，0.5M NaCl）洗脱结合蛋白，每次加入1ml洗脱液，共5ml得到纯化的重组海蚯蚓纤溶酶，约28KD。（图4中M蛋白分子量标准；1，2，3，4，为洗脱蛋白的不同管号）。

实施例4

重组海蚯蚓纤溶酶的纤维蛋白酶原激活活性测定。

实验材料： 琼脂糖（Amresco公司）、多美滋脱脂奶粉（雀巢香港有限公司）、牛血纤维蛋白溶酶原（中国食品药品检定研究院）、尿激酶（中国食品药品检定研究院）。

实验方法：包括以下步骤：

1.在50mlTBS-HCL(50mmol/L Tris-CL, pH8.0,150mmol/L NaCl)缓冲液中，加入0.5g琼脂糖，微波炉煮沸。加入0.5g脱脂奶粉，混匀。冷却至40℃后加入10U纤维蛋白原，混匀。

2.铺2个平皿，待凝固后打孔，加入40μl重组蛋白，以尿激酶（100U, 20μl）为阳性对照，以PBS为阴性对照，37℃孵育14h。 结果如图5（图5，A:不加纤维蛋白酶原的平板；B：加纤维蛋白酶原的平板。1尿激酶；2重组蛋白；3 PBS）:在加入纤维蛋白酶原的平板上，加重组蛋白和尿激酶的小孔周围形成明显的透明圈；而不加纤维蛋白酶原的平板上, 加重组蛋白和尿激酶的小孔周围都没有透明圈形成。这说明重组蛋白具有纤维蛋白酶原激活活性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种具有溶栓活性的海蚯蚓纤溶酶的cDNA序列，其特征在于，此序列由937个碱基对组成, 此核苷酸序列为：

1        ATCCCAGATC ATCAGTGACC CGGACAACCA ACCTCAACCC ATGAAGTTCC TTCTGCTGTC

61       TGCCCTCGTG GCCCTGGCCT CTGCTGCCCC TAGCTTCAAG GCTCCTGCAC CAAGCCTCAT

121      TTTCTCCAAT GATGGCTACA TTGTTGGTGG CGATGAGGCT GCTGTAGGCC AGTTTCCCTT

181      CCAGGCTGTT CTGCTGTCCT CTACCAGCCC TGGTGGCAGT CTGACCTGTG GAGGTGTCTA

241      CATTGGTGCC AATAGTGGTG GAAATCATTG GCTTTTGAAC GCTGCTCACT GCACCCAGTC

301      CAGTGCCCGT AGCACATGGT TGGGCCTCCA CAGACGCAGT GACACTAGCG ATGGACAGCA

361      CTTCACCTTC GTCCGTATTG TGAACCATCC CAACTATGGC TCTGGAGCTG GTGCTTTCCC

421      CAATGACATC AGCTTGTGTG AGATCAATGG CGTTGTTGAC ACCAGTGGCA ATGTTGGTGC

481      TGCTGTCTTG GCTGAGGGAG ATAATGACTA TGCTGGAGTA AGCGCTATCA TTTCTGGATG

541      GGGAAGAACT TGTGGAGGCT GTGCCCTGCC AGATGAACTG CGGTTTGTTC AGACCACTGT

601      CCTCCCCAAC TATGGAGCTA ACTCTTGCCA GACTGACTGG GGCAGCAATG TCAATGATGG

661      ACACATCTGT GTCAAGTCTG AAAACCAGGA CTCTGGAGCT TGCAATGGTG ACAGTGGTGG

721      CCCCATGTCC ATTGGAAACA CAGTTATTGG AGTGACATCC TGGGGAGCCT CTGGATGTCT

781      GACCTCCTAC CCATCTGCCT ACTCCAGGGT CTCCTTCTTC CGTGACTGGA TCAGAGAGGT

841      GTCTGACATC TAAAGCAATC AGCTGTTATG ACTGCTTTGT AATAATACCA GAGCATCAAT

901      AAAAATTGCA AACAAAATTA TAAAAAAAAA AAAAAAA。

2.根据权利要求1所述的海蚯蚓纤溶酶的cDNA序列，其编码蛋白质的特征在于：由270个氨基酸组成，其氨基酸序列如下：

1        MKFLLLSALV ALASAAPSFK APAPSLIFSN DGYIVGGDEA AVGQFPFQAV LLSSTSPGGS

61       LTCGGVYIGA NSGGNHWLLN AAHCTQSSAR STWLGLHRRS DTSDGQHFTF VRIVNHPNYG

121      SGAGAFPNDI SLCEINGVVD TSGNVGAAVL AEGDNDYAGV SAIISGWGRT CGGCALPDEL

181      RFVQTTVLPN YGANSCQTDW GSNVNDGHIC VKSENQDSGA CNGDSGGPMS IGNTVIGVTS

241      WGASGCLTSY PSAYSRVSFF RDWIREVSDI。

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