CN104073469B - 裂解水产致病菌噬菌体的分离与筛选方法 - Google Patents

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本发明涉及一种裂解水产致病菌噬菌体的分离与筛选方法，噬菌体名称为ΦA8‑29，分类名称为Aeromonas veronii phage，保藏编号：CGMCC No.9152；维氏气单胞菌名称为A8‑29，分类名称为Aeromonas veronii，保藏编号：CGMCC No.9093，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年04月25日。本发明提供了一种水产致病菌噬菌体的筛选与鉴定方法，分离得到的噬菌体能够用于预防和控制水产致病菌的感染，避免或减少抗菌素在水产养殖中的使用，发展水产养殖的绿色模式。

Description

裂解水产致病菌噬菌体的分离与筛选方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种裂解水产致病菌噬菌体的分离与筛选方法。
背景技术
我国2007年全国水产养殖面积5633.21kha，养殖产量4747.5万吨，占全世界水产养殖总产量的2/3以上，养殖产量超过捕捞产量。每年约1/10的养殖面积发生病害，每年因病害损失的养殖产量约占30％，直接经济损失超过百亿元，其中细菌性鱼病的发病率和致死率都接近或超过50％。
重要水产病原菌包括弧菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属、黄杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、巴氏杆菌属菌属、爱德华菌、迟缓爱德华氏菌、耶尔森氏菌属、沙雷氏菌、葡萄球菌属、链球菌属、诺卡氏菌属、梭状杆菌属和结核菌属等。
水产养殖中细菌性疾病的预防和控制，主要通过饲料中添加抗菌素实现。我国年产抗菌素为40万吨，其中近一半用于畜牧水产养殖。长期使用抗菌素的结果，直接导致90％的细菌对一种以上抗菌素具有耐药性，20％的细菌对5种以上抗菌素具有耐药性，降低了治疗效果，造成了环境污染，对食品安全产生极大威胁。因此，我们迫切需要一个能够控制水产致病菌的代替方法。
噬菌体(Bacteriophage或phage)是自然界存在数量最多的生物，约有1031个噬菌体。噬菌体是感染细菌等微生物的病毒，能够特异地裂解宿主菌，同时与宿主菌是否耐药无关。噬菌体不感染人类、动物、植物以及其它非宿主的细菌，几乎对环境不产生压力。另一方面，某些噬菌体能够编码一种酶，可以降解宿主菌的胞外多糖聚合物(EPS)，从而破坏致病菌形成的生物被膜。这些特性使噬菌体可以用来控制致病菌的感染。
虽然噬菌体广泛存在于自然界的各种环境中，但是噬菌体的分布存在不确定性。很多情况下，采用常规方法，很难分离到噬菌体，这种情况出现在多种致病菌噬菌体的分离。本发明涉及的方法，采用从特定环境分离致病菌，并以该致病菌为宿主菌，从相同样品中，直接分离特异性的噬菌体，解决了噬菌体的来源于特异性问题，分离到的噬菌体可直接用于水产品细菌性疾病的防控。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高效快速地水产致病菌噬菌体的筛选与鉴定方法，采用本方法可以高效快速地筛选针对不同致病菌的噬菌体，能够避免或减少抗菌素在水产养殖中的使用，对于发展水产养殖的绿色模式，对于食品安全，都具有重要价值
本发明另外一个目的是分离噬菌体与维氏气单胞，命名且已保藏。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的
一株能够裂解维氏气单胞菌的噬菌体，噬菌体名称为ΦA8-29，分类名称为Aeromonas veronii phage，保藏编号：CGMCC No.9152；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年04月25日。
噬菌体ΦA8-29裂解的维氏气单胞菌，名称为A8-29，分类名称为Aeromonasveronii，保藏编号：CGMCC No.9093，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年04月25日。
一种裂解水产致病菌噬菌体的分离与筛选方法，步骤如下：
⑴水产致病菌的分离
收集各种水产品样品，将样品匀浆，稀释匀浆液，取稀释液100μl在选择性培养基上涂板，选择性培养基包括SS培养基、TCBS培养基和麦康凯培养基，37℃倒置培养24-48h，挑取菌落，在同样的选择培养基上划线纯化菌株，反复纯化三次，将形态一致的菌株用灭菌的牙签挑取单菌落，接入LB液体培养基中，37℃振荡培养12h，取对数期菌液与甘油溶液混和后置于-80℃冰箱保藏；
⑵噬菌体的分离
将所有养殖种类的肠道内容物各1g置于50mlTSB-YE培养基中，37℃震荡培养72h，将培养物加入50ml离心管，加1ml氯仿轻轻混匀几次，10000×g离心5min，取上清液置于4℃储存，该上清液作为分离噬菌体的来源；
⑶培养上述分离的水产致病菌至对数生长期，与上述制备的上清液混和，再与0.6％琼脂培养基混匀倒双层平板，37℃培养4-8h，观察噬菌斑的出现，挑取单个噬菌斑，置于LB液体培养基中重悬，制备噬菌体溶液，稀释噬菌体溶液，与对数期的指示菌混匀，再与0.6％琼脂培养基混匀到双层平板，37℃培养4h后观察噬菌斑，重复此步骤纯化噬菌体，
⑷宿主菌基因组DNA的制备
将宿主菌接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜后，菌液离心弃上清，沉淀中加入TE缓冲液重悬菌体，加溶菌酶室温放置10min，加入SDS和蛋白酶K混匀后，60℃水浴保温6h，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，振荡混匀，离心取上清液于新的离心管中，抽提至没有蛋白膜为止；向上清液中加入氯仿抽提，取上清液于新的离心管中，向上清液中加入2倍体积的95％乙醇(预冷)，振荡混匀，离心弃掉上清液；沉淀中加入70％乙醇，10000rpm离心5min，弃掉上清，室温下干燥；加入双蒸水或TE缓冲液(pH8.0)，获得宿主菌染色体DNA溶液，用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，
⑸扩增宿主菌的16SrRNA基因
采用PCR方法，扩增宿主菌的16SrRNA基因片段，PCR扩增产物直接进行DNA序列测定，获得序列经过同源性分析，确定指示菌的生物学分类，
⑹噬菌体保存
噬菌体纯化后，将噬菌体在相应的宿主菌内扩增，用滤膜过滤除菌，添加无菌甘油，混匀，-80℃保存备用；
⑺噬菌体效价测定
将噬菌体溶液稀释，噬菌体稀释液与对数生长期的宿主菌混匀，倒双层平板，37℃培养4-6h后，进行噬菌斑计数，计算噬菌体效价或滴度，
⑻噬菌体的宿主范围分析
培养噬菌体的宿主菌和其它分类相近或相同的细菌，通过双层平板法或直接点样法，观察噬菌体裂解上述细菌的图谱，确定该噬菌体的宿主范围。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本申请分离的噬菌体用于研制针对重要水产致病菌的噬菌体制剂，控制由致病菌引起的水产品的细菌性感染，避免或减少抗菌素在水产养殖过程中的使用，减少多重耐药性细菌的富集，对食品安全具有重要意义。
2、本发明提供的方法可以高效快速地筛选针对不同致病菌的噬菌体，能够避免或减少抗菌素在水产养殖中的使用，对于发展水产养殖的绿色模式，对于食品安全，都具有重要价值。
3、本发明筛选的噬菌体命名ΦA8-29，分类名称为Aeromonas veronii phage，保藏编号：CGMCC No.9152；效价测定为3.3×1010pfu/ml，分离得到的烈性噬菌体能够用于预防和控制水产致病菌的感染，避免或减少抗菌素在水产养殖中的使用，发展水产养殖的绿色模式。
具体实施方式
下面通过具体实施例对发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种裂解水产致病菌噬菌体的分离与筛选方法，步骤如下：
⑴水产致病菌的分离
收集各种水产品样品，将样品匀浆，稀释匀浆液，取稀释液100μl在选择性培养基上涂板，选择性培养基包括SS培养基、TCBS培养基和麦康凯培养基，37℃倒置培养24-48h，挑取菌落，在同样的选择培养基上划线纯化菌株，反复纯化三次，将形态一致的菌株用灭菌的牙签挑取单菌落，接入LB液体培养基中，37℃振荡培养12h，取对数期菌液与甘油溶液混和后置于-80℃冰箱保藏；
⑵噬菌体的分离
将所有种类(鱼)的肠道内容物各1g置于50ml TSB-YE培养基中，37℃震荡培养72h，将培养物加入50ml离心管，加1ml氯仿轻轻混匀几次，10000×g离心5min，取上清液置于4℃储存，该上清液作为分离噬菌体的来源。
⑶培养上述分离的水产致病菌至对数生长期，与上述制备的上清液混和，再与0.6％琼脂培养基混匀倒双层平板，37℃培养4-8h，观察噬菌斑的出现。挑取单个噬菌斑，置于LB液体培养基中重悬，制备噬菌体溶液，稀释噬菌体溶液，与对数期的指示菌混匀，再与0.6％琼脂培养基混匀到双层平板，37℃培养4h后观察噬菌斑，重复此步骤纯化噬菌体。
⑷宿主菌基因组DNA的制备
将宿主菌接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜后，菌液离心弃上清，沉淀中加入TE缓冲液重悬菌体，加溶菌酶室温放置10min，加入SDS和蛋白酶K混匀后，60℃水浴保温6h，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，振荡混匀，离心取上清液于新的离心管中，抽提至没有蛋白膜为止；向上清液中加入氯仿抽提，取上清液于新的离心管中，向上清液中加入2倍体积的95％乙醇(预冷)，振荡混匀，离心弃掉上清液；沉淀中加入70％乙醇，10000rpm离心5min，弃掉上清，室温下干燥；加入双蒸水或TE缓冲液(pH8.0)，获得宿主菌染色体DNA溶液，用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
⑸扩增宿主菌的16S rRNA基因
采用PCR方法，扩增宿主菌的16S rRNA基因片段，PCR扩增产物直接进行DNA序列测定，获得序列经过同源性分析，确定指示菌的生物学分类。
⑹噬菌体保存
噬菌体纯化后，将噬菌体在相应的宿主菌内扩增，用滤膜过滤除菌，添加无菌甘油，混匀，-80℃保存备用；
⑺噬菌体效价测定
将噬菌体溶液稀释，噬菌体稀释液与对数生长期的宿主菌混匀，倒双层平板，37℃培养4-6h后，进行噬菌斑计数，计算噬菌体效价或滴度。
⑻噬菌体的宿主范围分析
培养噬菌体的宿主菌和其它分类相近或相同的细菌，通过双层平板法或直接点样法，观察噬菌体裂解上述细菌的图谱，确定该噬菌体的宿主范围。
筛选实施例1
按照上述技术方案，分离到1株能够裂解维氏气单胞菌的噬菌体和相应的宿主菌维氏气单胞菌1株。噬菌体名称为ΦA8-29，分类名称为Aeromonas veroniiphage，保藏编号：CGMCC No.9152；维氏气单胞菌名称为A8-29，分类名称为Aeromonas veronii，保藏编号：CGMCC No.9093，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年04月25日。
⑴标本：收集不同品种的淡水鱼等水产品样品。
⑵标本处理：收集鱼的胃肠道内容物，置于1.5ml离心管中，4℃保存。
⑶水产致病菌的分离：将胃肠道内容物混匀，悬浮液用生理盐水做系列稀释。分别取10-1和10-2稀释度稀释液100μl，在选择性固体培养基SS、TCBS和麦康凯上分别涂板，用灭菌的涂布器涂布，涂布至均匀，等平板干燥之后37℃倒置培养24-48h，从培养箱内取出平板，挑取菌落，在选择性培养基上进行三区划线，37℃倒置培养12-16h，反复纯化三次，将形态一致的菌株用灭菌的牙签挑取单菌落，接入5mlLB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养12h，取对数期菌液1ml加入冻存管，接着加入0.5ml50％的甘油溶液混匀后于-80℃冰箱保藏。
⑷噬菌体的富集：取肠道内容物各1ml，置于50mlTSB-YE培养基中，37℃震荡培养72h。将培养物加入50ml离心管，加1ml氯仿轻轻混匀几次后，10000×g离心5min，取上清液置于4℃储存。此时，混合上清液作为分离噬菌体的来源。
⑸噬菌体的分离与纯化：取100μl上清液于离心管中，加入200μl处于对数生长期的指示菌混匀，10min后，将混合物与5mL0.6％的半固体LB培养基(60℃)混匀，倒双层平板，37℃培养4h，观察噬菌斑的出现。用接种环挑取噬菌斑，将噬菌体重悬于1mLLB液体培养基中。稀释噬菌体溶液，分别取各稀释度100μl，分别与200μl宿主菌悬液混匀5min，再与5mL0.6％琼脂培养基(60℃)混匀，迅速倒入1.5％底层琼脂培养基上，37℃培养4h后，观察噬菌斑的形态，重复此步骤纯化噬菌斑。
⑹噬菌体的保存：挑取噬菌斑，与对数期的宿主菌混合，37℃培养4h，加入几滴氯仿，放置10min，10000×g离心5min，取上清液用0.22μm滤膜过滤进一步除菌，加入无菌甘油，使其终浓度为30％(v/v)，混匀后置于-80℃保存备用。
⑺宿主菌的分子鉴定：首先制备宿主菌的基因组DNA，挑取已经分离噬菌体的宿主菌的单菌落，接种于5mLLB液体培养基中，37℃振荡培养8-10h；取富集培养后的菌液1.5mL，10000rpm离心4-5min；弃上清，沉淀中加入0.5mL TE缓冲液重悬菌体；加入20mg/mL溶菌酶10μl，室温放置10min；加入20％SDS10μl，摇匀，加入10mg/mL蛋白酶K50μl，振荡混匀，60℃水浴保温2h；加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，振荡混匀，10000rpm离心10min，取上清液于新的离心管中，重复苯酚氯仿抽提3-7次；向上清液中加入等体积氯仿抽提，振荡混匀，10000rpm离心10min，取上清液于新的离心管中；向上清液中加入1/10体积的NaAc(3mol/L)，2倍体积的95％乙醇(预冷)，振荡混匀，10000rpm离心10min，弃掉上清液；沉淀中加入200μl70％乙醇，10000rpm离心5min，弃掉乙醇，室温下干燥；加入100-200μL双蒸水或TE缓冲液(pH8.0)重悬沉淀；0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
利用PCR方法，以制备的DNA作为模板，扩增16SrDNA基因片段，所用引物序列包括正向引物：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇(E.coli bases 8 to27)和反向引物：5＇-TACCTTGTTACGACTT-3＇(E.coli bases 1507to1492)。扩增产物直接测序，获得的序列在GenBank中利用Basic Local Alignment SearchTool(BLAST 2.2.26)工具进行同源性分析比对，确定宿主菌为维氏气单胞菌。
⑻噬菌体效价测定：噬菌体溶液用生理盐水做系列稀释，分别取10-6、10-7和10-8稀释液各100μl，分别与200μl对数生长期的气单胞菌混合均匀，倒双层平板，37℃培养4-6h后，记录噬菌斑数量，计算噬菌体效价，噬菌体溶液滴度或效价为3.3×1010pfu/ml。
筛选实施例2
采取相同的技术方案和步骤，采集不同的水产品标本，从标本中分离得到温和气单胞菌的噬菌体ФA33，该噬菌体的效价或滴度为3.0×109pfu/ml。
筛选实施例3
采取相同的技术方案和步骤，采集不同的水产品标本，从标本中分离得到普通变形杆菌的噬菌体ФP5-9，该噬菌体的效价或滴度为6.5×106pfu/ml。
在水产品养殖过程中，能够导致细菌性疾病的重要水产病原菌有多种，包括弧菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属、黄杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、巴氏杆菌属菌属、爱德华菌、迟缓爱德华氏菌、耶尔森氏菌属、沙雷氏菌、葡萄球菌属、链球菌属、诺卡氏菌属、梭状杆菌属和结核菌属等。利用本发明的方法，可以高效快速地筛选针对不同致病菌的噬菌体，能够避免或减少抗菌素在水产养殖中的使用，对于发展水产养殖的绿色模式，对于食品安全，都具有重要价值。

Claims (1)

1.一株能够裂解维氏气单胞菌的噬菌体，其特征在于：噬菌体名称为ΦA8-29，分类名称为Aeromonas veroniiphage，保藏编号：CGMCC No.9152；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年05月06日。
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