CN111909917B

CN111909917B - 一种内溶素Lysmeta1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111909917B
Application number: CN201910387732.3A
Authority: CN
Inventors: 董志扬; 王宁宁; 张山; 王丽; 何永志; 张岩峰; 朱雅新
Original assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: CN111909917A

Abstract

本发明公开了一种内溶素Lysmeta1及其编码基因与应用。本发明保护的内溶素Lysmeta1是序列表的序列1所示的蛋白质。内溶素Lysmeta1是一种SAR内溶素，能够使得大肠杆菌裂解，其裂解大肠杆菌的能力比对照显著提高，并有助于细胞内产物的释放。新型SAR内溶素的发现不仅具有重要的理论研究意义，同时也将为应用内溶素进行细胞裂解提供新的选择。

Description

一种内溶素Lysmeta1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种内溶素Lysmeta1及其编码基因与应用。

背景技术

在自然界中，几乎所有的细菌都有相应的噬菌体，许多噬菌体具有内溶素，在深海环境下也发现了噬菌体的存在，因此利用海洋资源可以获得大量内溶素的基因。

内溶素(lysin/endolysin)是由噬菌体编码的能够降解细菌的一类酶，这类酶在噬菌体感染细胞的增殖周期的末期合成。这些酶也被称为噬菌体溶菌酶，细胞裂解酶，它们共同的特点是以细菌细胞壁肽聚糖层为攻击目标；这种能力导致胞壁层的降解和新组装病毒粒子的释放。大部分的尾状噬菌体通过两个裂解蛋白——内溶素和孔蛋白(holin)来完成裂解，而具有SAR结构域的内溶素，可以不依赖holin裂解大肠杆菌。SAR类内溶素有一个N-末端SAR结构域和相应的针孔蛋白(pinholin)。SAR结构域使得这类内溶素的输出是通过宿主的Sec***，出膜后攻击肽聚糖层，最终导致细胞裂解。

内溶素在农业上能够预防植物疾病之外，也能应用于畜牧业和乳制品行业。例如，可以应用于由多种病原菌引起的牛乳腺炎症(尤其是葡萄球菌和链球菌)，还可以应用于食品中的致病菌检测等各个方面。

发明内容

本发明的目的是提供一种内溶素Lysmeta1及其编码基因与应用。

本发明首先提供了一种蛋白质(命名为Lysmeta1)，是如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；

(a3)与序列表的序列1自所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使(a1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明还保护编码所述蛋白质的基因(命名为Lysmeta1基因)。

所述编码所述蛋白质的基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：

(b1)序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)序列表中序列3所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b4)与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明还保护含有所述Lysmeta1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述重组表达载体具体可为将pET-21a(+)载体的Nde I和XhoI酶切位点间的序列替换为序列表的序列3所示的DNA分子得到的重组表达载体。

本发明还保护所述蛋白质作为内溶素的应用。

本发明还保护所述Lysmeta1基因，或，含有所述Lysmeta1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备内溶素中的应用。

本发明还保护所述蛋白质，或，所述Lysmeta1基因，或，含有所述Lysmeta1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在裂解细胞中的应用。

本发明还保护一种裂解细胞的方法，包括如下步骤：将Lysmeta1基因导入受体细胞，实现受体细胞的裂解。

所述方法中，所述“将Lysmeta1基因导入受体细胞”具体可通过将表达Lysmeta1基因的重组表达载体导入受体细胞实现。

所述受体细胞可为细菌，具体可为大肠杆菌，等具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还保护一种重组菌，是将Lysmeta1基因导入宿主菌中得到的。

所述Lysmeta1基因可通过含有Lysmeta1基因的重组表达载体导入宿主菌。

所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还保护一种内溶素的制备方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，从重组菌中得到内溶素。

本发明提供了一种内溶素Lysmeta1及其编码基因。内溶素Lysmeta1能够使得大肠杆菌裂解，其裂解大肠杆菌的能力比对照显著提高，并有助于细胞内产物的释放。

本发明从海洋元基因组中挖掘新型SAR内溶素，发现新型SAR内溶素单个基因的表达就可以高效裂解大肠杆菌，而不需要任何holin蛋白的参与。新型SAR内溶素的发现不仅具有重要的理论研究意义，同时也将为应用内溶素进行细胞裂解提供新的选择。

附图说明

图1为实施例2中SDS-PAGE检测结果。

图2为实施例2中培养体系观察结果。

图3为实施例3中SDS-PAGE检测结果。

图4为实施例3中培养体系观察结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pET-21a(+)载体：Novagen，货号：69740-3。

大肠杆菌BL21(DE3)：Biomed，货号：BC201-01。

实施例1、Lysmeta1及其编码基因的获得

从来源于西北印度洋的沉积物中提取总DNA，进行高通量测序获得基因组数据。

对基因组数据进行大量分析，得到一个内溶素的编码基因(命名为Lysmeta1基因)，如序列表的序列2所示。该基因编码的蛋白质(命名为Lysmeta1蛋白)如序列表的序列1所示。

实施例2、Lysmeta1的功能验证

一、重组菌的制备

1、将pET-21a(+)载体的Nde I和XhoI酶切位点间的序列替换为序列表的序列3所示的DNA分子，得到重组表达载体pET-Lysmeta1(已经测序验证)。

序列3与序列2的区别仅在于缺少了终止密码子。

2、将步骤1得到的重组表达载体pET-Lysmeta1导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1。

3、将pET-21a(+)载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)-pET。

二、内溶素Lysmeta1的表达及活性检测

待测菌：重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1和重组菌BL21(DE3)-pET。

1、将待测菌接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌液OD600值达到0.6-0.8左右，向培养体系中加入IPTG(IPTG在培养体系中的浓度为1mM)，16℃、200rpm培养16-20小时。

2、完成步骤1后，取培养体系，观察大肠杆菌的裂解效果。

3、完成步骤1后，取培养体系，离心并收集菌体沉淀，将菌体沉淀用pH7.0磷酸钠缓冲液重悬后超声得到全细胞裂解液。

4、将步骤3得到的全细胞裂解液离心并收集上清液。

5、将步骤3得到的全细胞裂解液和步骤4得到的上清液分别进行SDS-PAGE检测。

SDS-PAGE检测结果如图1所示。图1中，泳道1为重组菌BL21(DE3)-pET全细胞裂解液(步骤4收集)的SDS-PAGE检测结果；泳道2为重组菌BL21(DE3)-pET上清液(步骤5收集)的SDS-PAGE检测结果；泳道3为重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1全细胞裂解液(步骤4收集)的SDS-PAGE检测结果；泳道4为重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1上清液(步骤5收集)的SDS-PAGE检测结果。SDS-PAGE显示在18.8kDa附近有单一条带(箭头)，这与计算的内溶素分子量19kDa一致。

培养体系观察结果如图2所示。图2中，1为重组菌BL21(DE3)-pET培养体系的观察结果；2为重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1培养体系的观察结果。结果表明，与对照相比表达Lysmeta1的大肠杆菌有明显的裂解效果。

实施例3、Lysmeta1的SAR结构域分析

一、重组菌的制备

根据对Lysmeta1的序列分析，Lysmeta1含有一个额外的N端跨膜结构域，预测其可能为SAR内溶素，而且具其SAR结构域有GGGA基序，这也出现在许多SAR内溶素中。为了研究对Lysmeta1 SAR结构域的预测是否准确，构建去除Lysmeta1的N端及SAR结构域的突变体。

1、将pET-21a(+)载体的Nde I和XhoI酶切位点间的序列替换为序列表的序列4所示的DNA分子，得到重组表达载体pET-Lysmeta1-SAR(已经测序验证)。

序列4与序列3的区别仅在于缺少了N端及SAR结构域的编码序列(序列3自5’端第4-81位)。

2、将重组表达载体pET-Lysmeta1-SAR导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1-SAR。

二、内溶素表达及活性检测

待测菌：重组菌BL21(DE3)-pET、重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1和重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1-SAR。

2、完成步骤1后，取培养体系，观察大肠杆菌的裂解效果。

4、将步骤3得到的全细胞裂解液离心并收集上清液。

SDS-PAGE检测结果如图3所示。图3中，泳道1为重组菌BL21(DE3)-pET全细胞裂解液(步骤4收集)的SDS-PAGE检测结果；泳道2为重组菌BL21(DE3)-pET上清液(步骤5收集)的SDS-PAGE检测结果；泳道3为重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1-SAR全细胞裂解液(步骤4收集)的SDS-PAGE检测结果；泳道4为重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1-SAR上清液(步骤5收集)的SDS-PAGE检测结果；泳道5为重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1全细胞裂解液(步骤4收集)的SDS-PAGE检测结果；泳道6为重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1上清液(步骤5收集)的SDS-PAGE检测结果。

结果表明，去除SAR结构域的蛋白条带明显比对照的迁移率快。

培养体系观察结果如图4所示。图4中，1为重组菌BL21(DE3)-pET培养体系的观察结果；2为重组菌重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1-SAR培养体系的观察结果；3为重组菌BL21(DE3)-pET-Lysmeta1培养体系的观察结果。

结果表明，去除SAR结构域的蛋白裂解活性丧失。

上述结果表明对Lysmeta1的SAR结构域正确。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）

<120> 一种内溶素Lysmeta1及其编码基因与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Arg Ala Gln Lys Ile Gly Ile Ile Leu Leu Leu Leu Val Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ala Leu Ile Tyr Ser Ile Thr Arg Ser Gly Ile Glu Lys Ile

20 25 30

Lys Val His Glu Ala Leu Arg Leu Lys Pro Tyr Lys Asp Gln Ala Gly

35 40 45

Lys Trp Thr Ile Gly Tyr Gly His Leu Leu Leu Pro Gly Glu Trp Tyr

50 55 60

Glu Arg Ile Thr Glu Pro Gln Ala Glu Ala Leu Leu Arg Lys Asp Leu

65 70 75 80

Ala Val Ala Glu Ser Thr Val Asn Asn Leu Val Lys Thr Ser Leu Asn

85 90 95

Lys Asn Gln Tyr Asp Ala Leu Val Ser Phe Val Tyr Asn Val Gly Thr

100 105 110

Gly Ala Phe Ser His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Ile Asn Ala Asn Asp

115 120 125

Phe Ile Asn Ala Ala Asn Glu Phe Lys Arg Trp Lys Tyr Ala Gly Gly

130 135 140

Lys Val Ser Asn Gly Leu Leu Ala Arg Arg Glu Arg Glu Lys Thr Leu

145 150 155 160

Phe Thr Thr Val Val

165

<210> 2

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaatcgtg cacagaaaat cggtatcatc ctgctgctgc tggtcggtgg tggtgccctg 60

atctactcca ttacgcgttc cggcatcgaa aagatcaaag tccacgaagc gctgcgcctg 120

aaaccgtaca aagatcaggc gggcaaatgg actatcggct atggccacct gctgctgcca 180

ggtgagtggt acgaacgtat cacggaaccg caggctgaag cgctcctgcg taaagatctg 240

gcggtggccg aatccacggt gaataacctg gtgaaaacga gcctcaacaa aaaccagtac 300

gacgcactcg ttagcttcgt atacaacgtt ggtactggtg ctttctccca ttccaccctg 360

ctgaaaaaaa ttaacgctaa cgacttcatt aacgctgcca acgaatttaa acgttggaaa 420

tatgccggcg gtaaagtttc caacggcctg ctggcacgtc gcgaacgtga gaagactctc 480

ttcacgacgg tggtttaa 498

<210> 3

<211> 495

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaatcgtg cacagaaaat cggtatcatc ctgctgctgc tggtcggtgg tggtgccctg 60

atctactcca ttacgcgttc cggcatcgaa aagatcaaag tccacgaagc gctgcgcctg 120

aaaccgtaca aagatcaggc gggcaaatgg actatcggct atggccacct gctgctgcca 180

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gacgcactcg ttagcttcgt atacaacgtt ggtactggtg ctttctccca ttccaccctg 360

ctgaaaaaaa ttaacgctaa cgacttcatt aacgctgcca acgaatttaa acgttggaaa 420

tatgccggcg gtaaagtttc caacggcctg ctggcacgtc gcgaacgtga gaagactctc 480

ttcacgacgg tggtt 495

<210> 4

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggcatcg aaaagatcaa agtccacgaa gcgctgcgcc tgaaaccgta caaagatcag 60

gcgggcaaat ggactatcgg ctatggccac ctgctgctgc caggtgagtg gtacgaacgt 120

atcacggaac cgcaggctga agcgctcctg cgtaaagatc tggcggtggc cgaatccacg 180

gtgaataacc tggtgaaaac gagcctcaac aaaaaccagt acgacgcact cgttagcttc 240

gtatacaacg ttggtactgg tgctttctcc cattccaccc tgctgaaaaa aattaacgct 300

aacgacttca ttaacgctgc caacgaattt aaacgttgga aatatgccgg cggtaaagtt 360

tccaacggcc tgctggcacg tcgcgaacgt gagaagactc tcttcacgac ggtggtt 417

Claims

1.蛋白质，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下（b1）或（b2）所述的DNA分子：

（b1）序列表中序列2所示的DNA分子；

（b2）序列表中序列3所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体或表达盒。

5.权利要求1所述的蛋白质作为内溶素的应用；所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。

6.权利要求2所述的基因，或，权利要求4所述的重组表达载体或表达盒在制备内溶素中的应用。

7.权利要求1所述的蛋白质，或，权利要求2所述的基因，或，权利要求4所述的重组表达载体或表达盒在裂解细胞中的应用；所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。

8.一种体外裂解细胞的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述的基因导入受体细胞，实现受体细胞的裂解。

9.一种重组菌，是将权利要求2或3所述的基因导入宿主菌中得到的。

10.一种内溶素的制备方法，包括如下步骤：培养权利要求9所述的重组菌，从重组菌中得到内溶素。