CN104152454A

CN104152454A - 来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用

Info

Publication number: CN104152454A
Application number: CN201310174327.6A
Authority: CN
Inventors: 张劲松; 陈受宜; 李擎天; 马彪; 刘云峰; 张万科; 林晴; 何锶洁
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2013-05-13
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2033-05-13
Also published as: CN104152454B

Abstract

本发明公开了来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用。GmMYB363P，是如下a）、b）或c）的DNA分子：a）核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；b）与a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有启动子功能的DNA分子；c）在高严谨条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。GmMYB363P为干旱诱导型启动子。利用GmMYB363P可以使基因在干旱诱导条件下表达，因而避免了组成型启动子过量表达带来的负作用—产生大量的异源蛋白和有毒物质。

Description

来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用

技术领域

本发明涉及来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用。

背景技术

启动子（Promoter）是基因组基因的一个重要组成部分，它像“开关”一样，在转录水平上基本决定其控制下的编码基因是否表达、何时表达、何处表达和表达强度。一般根据启动子作用方式和功能将其大体可以分为三大类：组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子（Constitutive promoter）是指能够驱使其控制下的编码基因在不同器官和/或组织大体恒定表达的一类启动子。它的特点是：受其控制的编码基因的表达具有持续性，但不具有时空特异性；RNA和蛋白质表达量相对恒定，不受外界因素的诱导。诱导型启动子（Inducible promoter）是指能够响应某些特定的物理、化学和生物信号（统称为“诱导子”或“诱导因子”）而驱动其控制的编码基因大幅度地增加转录水平的一类启动子。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名，例如：真菌诱导启动子、共生细菌诱导启动子、化学诱导启动子、金属离子诱导启动子、光诱导启动子、热诱导启动子和创伤诱导启动子等。器官和/或组织特异性启动子（Organ-and/or Tissue-specific promoter），能够驱使其控制下的编码基因仅仅在生物体的某一或某些特定的器官和/或组织，或者仅仅在生长发育的某一或某些特定阶段表达的一类基因。它的特征为，受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，植物上的根特异性启动子、叶片特异性启动子、花特异性启动子、气孔特异性启动子、气孔绒毡层特异性启动子、花粉特异性启动子、果实特异性启动子、种子特异性启动子、胚乳特异性启动子、棉花纤维特异性启动子和韧皮部特异性启动子等等。

在自然环境中，植物生长在开放的***中,经常会遇到冷、热、旱、涝、盐碱、大气污染等不良环境的影响。不良环境作用于植物，将会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引起不可逆伤害，导致整个植株死亡。在各种环境胁迫中,干旱、低温、高热和高盐等非生物胁迫对植物的影响尤为突出，表现为不同程度地对植物体内水分状况的影响，因此又成为水分胁迫，是制约植物生长和农作物产量的最主要非生物性逆境因子。植物在长期的进化中,逐渐形成了一系列应答逆境胁迫的生理、代谢以及防御***。从植物中克隆非生物逆境诱导启动子将为提高植物对非生物胁迫的抗性奠定物质基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供植物受干旱诱导启动子。

本发明所提供的启动子，名称为GmMYB363P，来源于大豆，是如下a）、b）或c）的DNA分子：

a）核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

b）与a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有启动子功能的DNA分子；

c）在高严谨条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。

其中，SEQ ID No.1由1384个核苷酸组成。

上述75%或75%以上一致性，可为80%、85%、90%、95%以上的一致性。

所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液（0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7%SDS）中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液（0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7%SDS，同位素标记的核苷酸片段），65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5%SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1%SDS)，65℃洗膜30min。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有优选地75%或更高，更优选地85%或更高，甚至更优选地90%或更高，以及最优选地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。

含有GmMYB363P的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述含有GmMYB363P的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达目的基因的DNA，该DNA不但包括启动所述目的基因的GmMYB363P，还可包括终止所述目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人Genes Dev.,5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。

所述的含有GmMYB363P的重组载体具体可为用SEQ ID No.1的第1-1384位所示的启动子GmMYB363P替换pCAMBIA-1301的HindⅢ和Bgl Ⅱ之间片段得到的GUS基因重组表达载体pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS。所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia）,欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）,产碱菌属（Alcaligenes）,假单胞菌属（Pseudomonas）,芽胞杆菌属（Bacillus）等。所述的转基因细胞系不包括动物和植物的繁殖材料。

本发明中，携带有GmMYB363P的植物表达载体可通过使用包含但不限于Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

扩增GmMYB363P全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

实验证明，GmMYB363P可在4%分子量为6000的聚乙二醇（PEG6000）水溶液模拟的干旱胁迫诱导下启动目的基因在的表达。

GmMYB363P可用于培育转基因植物，该转基因植物在干旱胁迫诱导下能增加目的基因的表达量。

上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，如大豆。

所述转基因植物理解为不仅包含将目的基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明的GmMYB363P为干旱诱导型启动子。利用GmMYB363P可以使基因在干旱诱导条件下表达，因而避免了组成型启动子过量表达带来的负作用—产生大量的异源蛋白和有毒物质。本发明的GmMYB363P对通过目的基因在干旱胁迫下的高表达来提高转基因植物耐旱性有重要意义。

附图说明

图1为植物表达载体pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS示意图。

图中，GmMYB363promoter表示GmMYB363P。

图2为转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根在水中或4%PEG6000水溶液中培养12小时后的GUS染色图。

图2中，左图为转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根在水中培养12小时后的GUS染色图；右图为转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根在4%PEG6000水溶液中培养12小时后的GUS染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大豆南农1138-2（由南京农业大学国家大豆改良中心提供，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请的实验，记载在文献W.K.Zhang,Y.J.Wang,G.Z.Luo,J.S.Zhang,C.Y.He,X.L.Wu,J.Y.Gai,S.Y.Chen,QTL mappingof ten agronomic traits on the soybean(Glycine max L.Merr.)genetic map andtheir association with EST markers,Theor.Appl.Genet,2004,108:1131-1139）。

大豆科丰1号（Glycine max L.Merr.Kefeng 1）记载在W.K.Zhang,Y.J.Wang,G.Z.Luo,J.S.Zhang,C.Y.He,X.L.Wu,J.Y.Gai,S.Y.Chen,QTL mapping of tenagronomic traits on the soybean(Glycine max L.Merr.)genetic map and theirassociation with EST markers,Theor.Appl.Genet,2004,108:1131-1139中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请的实验。

植物表达载体pCAMBIA-1301,记载于Zheng SJ,et al.,Molecularcharacterization of transgenic shallots(Allium cepa L.)by adaptor ligationPCR(AL-PCR)and sequencing of genomic DNA flanking T-DNA borders,TransgenicRes.2001,10(3):237-45。

发根农杆菌K599记载在Attila Kereszt,et al.,Agrobacteriumrhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology,NatureProtocols,2007,2(4),549-552）中，公众可从Peter M Gressnon教授，The Universityof Queensland,St Lucia,Queensland4072,Australia获得，或经Peter M Gressnon教授同意（书面同意书）后由中科院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请的实验。

实施例1、干旱诱导启动子GmMYB363P的克隆及转基因载体的构建

一、干旱诱导启动子GmMYB363P的克隆

发明人将大豆南农1138-2基因组进行了99X测序和拼接，构建了基因组物理图谱。根据测序数据，获得了启动子GmMYB363P区域序列，据此，设计了启动子GmMYB363P序列的克隆引物，正向引物中含有Hind Ⅲ识别序列，反向引物中含有BamH Ⅰ识别序列：

正向：5’-AAGCTTATCTACCACGGAGACAA-3’；

反向：5’-GGATCCGGATCTATCTTTGCCTT-3’。

用上述引物以大豆南农1138-2的基因组DNA为模板，扩增得到1384bp的扩增产物，将该PCR扩增产物与pMD18-T克隆载体连接后测序。将测序结果表明含有SEQ IDNo.1的第1-1384位所示的DNA分子的重组载体命名为pMD18-T-GmMYB363P。其中，SEQID No.1由1384个核苷酸组成，为启动子GmMYB363P的核苷酸序列。

二、重组表达载体的构建

由于BamHⅠ的酶切识别位点为5’G^GATCC3’，而Bgl II的酶切识别位点为5’A^GATCT 3’，因此上述两个酶切片段可连接。Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切pMD18-T-GmMYB363P，回收GmMYB363P片段并与Hind Ⅲ和Bgl II酶切后的pCAMBIA-1301（GenBank:AF234297.1）植物表达载体连接，得到由启动子GmMYB363P启动GUS基因转录的重组表达载体pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS。经测序证实，pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS为用SEQ ID No.1的第1-1384位所示的启动子GmMYB363P替换pCAMBIA-1301的HindⅢ和Bgl II之间片段得到的GUS基因重组表达载体。

实施例2、利用启动子GmMYB363P培育转基因大豆

运用发根农杆菌介导转基因毛状根方法，将pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS转化到发根农杆菌K599中。

发根农杆菌侵染法根据Attila Kereszt等方法（Attila Kereszt,et al.,Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of rootbiology,Nature Protocols,2007,2(4),549-552）进行，该方法获得的新生毛状根多于96%均为转基因毛状根。

具体操作如下：

1）首先将含有GUS基因的pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS，通过电击法导入发根农杆菌K599中，得到重组农杆菌。提取重组农杆菌的质粒，用PCR方法鉴定重组农杆菌中所含启动子GmMYB363P，所用引物为

正向：5’-AAGCTTATCTACCACGGAGACAA-3’；

反向：5’-GGATCCGGATCTATCTTTGCCTT-3’。

将鉴定结果表明含有SEQ ID No.1的第1-1384位所示的启动子GmMYB363P的重组农杆菌命名为K599/GmMYB363P。

2）大豆科丰1号种子播种于蛭石中，待长出2片真叶待用。

3）在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基中划线活化K599/GmMYB363P，挑单菌落在含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中摇菌过夜，得到K599/GmMYB363P发根农杆菌菌液。

4）用步骤3）得到的K599/GmMYB363P发根农杆菌菌液，用注射器接种6天含两片真叶的步骤2）获得的大豆幼苗，保湿生长：光照16小时，温度25℃，湿度50%。2周后，长出毛状根。

当毛状根长度为5－10厘米时，剪去老根，新的毛状根即为转化的根，可进一步用于鉴定。

将新的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根分为两组，每组10根，一组置于水中培养，一组置于4%PEG6000水溶液中，12小时后分别进行GUS染色。将毛状根直接放在下列染色液：50mM NaPO₄ pH 7.2水溶液,2mM X-gluc,0.5mM K₃Fe（CN）₆,and0.5mM K₄Fe（CN）₆中，37℃过夜,毛状根经系列浓度70、50、30%乙醇洗（脱色）,之后放在重蒸水中，观察，结果如图2所示，可以看出，经GUS染色表明在水中培养12小时的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根显示GUS染色较浅，表明GmMYB363P启动子驱动GUS基因的表达较弱；而在4%PEG6000水溶液处理12小时后，GmMYB363P启动子受诱导，驱动GUS基因的表达，因此转基因毛状根经染色后呈现明显的深蓝色。按照Cote等方法（Cote C et al.,An improved MUG fluorescent assay for the determinationof the GUS activity within transgenic tissue of woody plants,Plant CellRep.,2003,21(6),619-624）对水中培养12小时的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根和在4%PEG6000水溶液处理12小时的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根进行GUS基因表达的荧光定量分析，结果显示在4%PEG6000水溶液培养12小时的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根的GUS活性值为287±20nmol 4-MU min^-1mg^-1蛋白，水中培养12小时的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根的GUS活性值为64±13nmol 4-MU min^-1mg^-1蛋白，GUS基因的表达在PEG模拟的干旱胁迫情况下是水中（正常情况）的4.5倍。上述结果表明启动子GmMYB363P受干旱诱导。

聚乙二醇6000（PEG6000）是亲水性大分子，具有很强的吸水性，可以使植物失水,造成干旱胁迫。所以本实施例采用PEG6000来模拟干旱。

Claims

1.如下a）、b）或c）的DNA分子：

a）核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

2.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。

3.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体，或含有权利要求2所述表达盒的重组载体。

4.含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物、含有权利要求2所述表达盒的重组微生物、或含有权利要求3所述重组载体的重组微生物。

5.含有权利要求1所述DNA分子的转基因细胞系、含有权利要求2所述表达盒的转基因细胞系、或含有权利要求3所述重组载体的转基因细胞系。

6.扩增权利要求1所述的DNA分子全长或其任一片段的引物对。

7.权利要求1所述的DNA分子作为启动子的应用。

8.权利要求1所述的DNA分子在干旱胁迫诱导下启动目的基因在植物中表达的应用。

9.权利要求1所述的DNA分子在培育转基因植物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述转基因植物为转基因大豆。