CN106399312B - 一种诱导启动子NtPCS1P及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导启动子NtPCS1P及其应用，属于生物技术和植物基因工程领域，其核苷酸序列包括如下（a）或（b）或（c）的序列：（a）具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或（b）与a）限定的核苷酸序列具有75%以上一致性，且具有启动子功能的DNA分子；或（c）在高严谨条件下与（a）或（b）限定的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的DNA分子。本发明的NtPCS1P可作为构建植物表达载体的元件，将其连接在目的基因之前，使目的基因的表达受锌和/或镉诱导。因此，本发明的NtPCS1P对通过启动目的基因在锌和/或镉胁迫下的高表达，来提高转基因植物对锌和/或镉的耐受性，具有重要意义。

Description

一种诱导启动子NtPCS1P及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程领域，具体为一种诱导启动子NtPCS1P及其应用。更具体的，本发明是一种来源于烟草的锌和/或镉诱导启动子NtPCS1P及其应用。

背景技术

启动子(Promoter)是一段RNA聚合酶(RNA polymerase，RNA Pol)识别、结合和起始转录的特定DNA序列。植物基因启动子作为重要的顺式作用元件，是位于结构基因5′端上游区的DNA序列，能指导全酶与模板的正确结合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式，并决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是转录调控的中心。

生物在生长发育中，根据自身和环境定时、定位、定量地表达特定基因，这种能力是通过生物的DNA顺式作用元件(cis-acting elements)与反式作用因子(trans-actingfactors)或环境中的温度、光照等因素的互作来实现的，其中，启动子的作用尤为关键。

植物基因的启动子按其基因的表达方式，分为：组成型启动子(即基因的表达不受时空限制和某种物质的诱导而在植物中表达出来)、诱导型启动子(其基因的表达受某种物质的诱导，没有诱导物存在，基因表达水平很低甚至没有)和组织特异性启动子(其基因的表达分布在植物的某个组织或器官中)。

重金属是指密度大于5g·cm^-3的一类金属元素，大约有40种，主要包括镉、铬、汞、铅、铜、锌、银、锡等。许多重金属是植物必需的微量营养元素，但这些重金属在细胞内的过量积累，同样会对植物产生毒害作用，比如锌。另外，一些重金属不是植物必需的营养元素，并且对植物生长具有显著的毒性，比如镉。

近年来，随着现代生物技术的发展，人们开始利用基因操控的方法，来提高植物对重金属的耐受性。使用组成型的强启动子诱导目的基因转化植物时，往往会由于目的基因表达的时间(发育阶段特异性)或空间(组织器官特异性)不能很好地控制，而导致效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高，而对植物的生长发育造成影响。因此，要避免以上问题，就很有必要克隆更多的组织器官特异性或者特定条件诱导性表达的启动子，这样可以根据需要，选择不同的启动子诱导目的基因在适合的时间或空间表达。

为此，本发明人经过长期研究，发现了一个来源于烟草的锌和/或镉诱导启动子，在植物基因工程改造中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对使用组成型的强启动子诱导目的基因转化植物时，往往会由于目的基因表达的时间(发育阶段特异性)或空间(组织器官特异性)不能很好地控制，而导致效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高，而对植物的生长发育造成影响的问题，提供一种诱导启动子NtPCS1P及其应用。本发明的NtPCS1P对通过启动目的基因在锌和/或镉胁迫下的高表达，来提高转基因植物对锌和/或镉的耐受性，具有重要意义。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种诱导启动子NtPCS1P，其核苷酸序列包括如下(a)或(b)或(c)的序列：

(a)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

(b)与a)限定的核苷酸序列具有75％以上一致性，且具有启动子功能的DNA分子；或

(c)在高严谨条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的DNA分子。

一种包含所述DNA分子的表达盒。

一种包含所述表达盒的重组载体。

所述重组载体为双元载体、共合载体。

一种包含所述重组载体的重组微生物。

一种包含所述重组载体的转基因细胞系。

一种引物对，所述引物对用于扩增上述诱导启动子。

一种所述诱导启动子NtPCS1P在植物中表达的应用。

一种所述诱导启动子NtPCS1P在锌和/或镉诱导下启动目的基因在植物中表达的应用。

所述植物为双子叶植物。

所述双子叶植物为烟草、拟南芥或番茄。

为实现上述目的，本发明提供了一种诱导启动子NtPCS1P(具体为植物受锌和/或镉诱导启动子)及其应用，本发明中的启动子，名称为NtPCS1P，来源于烟草，是如下a)、b)或c)的DNA分子：a)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上一致性，且具有启动子功能的DNA分子；c)在高严谨条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。其中，SEQ ID No.1由1097个核苷酸组成，具体如下：

gtgcagcagc tgttgaagaa agacacacac aatacacaag acacaagact gaaatcgctc 60

aactgatttg gctatacatt gcactccttc ctctcagtat ttccatacga ttttttgaat 120

ttctactcct tcgttctgca ttgttttaac ttcaaacaaa gcaactgtaa gtgtgatttg 180

ctaccgaact ttgtgttcgc tgaaacactg ggctttgaag gaccgctaca ccagtgtgtg 240

attcgttcta tcctgggagg aaataatcca ttaccttggg tactaggagg ggattaaatt 300

ccttaagaaa acactgtgaa ttcagtgggc tcgaattaat tactgtttca ttacgataac 360

ttatattttg cagaattatt atttacaaat acaacaatat tggcgggact aacatattcc 420

tcgcttcatt ttatttatga atttgtggtt gtcccttttt tgttttggtc ataagtgaat 480

gactcaccaa acattgtaaa ttatagaaac tttatttgaa aatatgagat ttgtttacat 540

gttggacgat tttccagtga ctctataata gagttttaat caattttctt ggaataatta 600

cataatcaat ccttatatta attttttaga acacataagg tgtattcaca actaaaatca 660

gatcgtaaat gctttactct atatttaatt taatgcgata aacgttttta ttgcaataga 720

tctttcttag gacaaagtaa aaggaaatcc gaatctcttc atgatctaga taaaaaaata 780

gaatatttct ctttttctct ttttccacat tgtagtggtt cttctttatt ccttatactt 840

tgtctattag tgctacttgc catatatttc cattgtacac aaaccttttc tatttaattt 900

gtttattgtt tttcacaata ttggtacaaa tctttgacta cacgaaagct gttgattcgt 960

gaatcgcgtt tgcgcctttt aaattaacgc ggggaatcta ataaaccggc ggaattaaaa 1020

tccctaagtg aggtgaggca cacaagagat actcctacta ctagtattta ttgggggaga 1080

ttctgaagcg agaaaaa 1097

所述高严谨条件是在2×SSC(柠檬酸钠)，0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；然后用0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

同时，基于本发明的诱导启动子，含有NtPCS1P的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

在所述表达盒中，启动子NtPCS1P的下游连接结构基因、或调节基因、或结构基因或调节基因的反义基因、或者能够干扰内源基因表达的小RNA的编码DNA，用于驱动结构基因、或调节基因、或结构基因或调节基因的反义基因、或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。

所述表达盒可由所述启动子NtPCS1P、所述启动子NtPCS1P启动表达的目的基因以及转录终止序列组成；所述启动子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，目的基因具体为β-葡萄糖苷酶(β-glucuronidase,GUS)基因。

所述重组载体可为含有上述表达盒的重组载体，包括但不限于质粒和病毒。所述重组载体也可为重组植物表达载体。所述重组植物表达载体含有上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。所述宿主细胞、组织或器官及其后代是指所有植物细胞或植物组织或植物器官或由这些细胞、组织或器官通过组织分化或无性胚再生并且发育成熟的整体植株(包括种子)。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将pBI121(GenBank:AF485783)的35S启动子替换为所述启动子得到的重组载体。所述目的基因具体为β-葡萄糖苷酶基因(β-glucuronidase,GUS)。

所述重组表达载体可以通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物器官或组织或细胞，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。在本发明的实施例中，具体使用的是农杆菌介导法。

上述NtPCS1P在植物中启动目的基因表达的应用，也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述植物为双子叶植物，例如烟草、拟南芥或番茄。

扩增NtPCS1P的引物对也属于本发明的保护范围。

申请人对本发明进行了实际验证。实验结果证明，本申请的锌和/或镉诱导的启动子NtPCS1P在500μM ZnCl₂处理10天环境下启动的目的基因的表达量分别约为正常生长情况下的1.6倍，NtPCS1P在100μM CdCl₂处理10天环境下启动的目的基因的表达量分别约为正常生长情况下的1.51倍。在500μM ZnCl₂处理20天环境下启动的目的基因的表达量分别约为正常生长情况下的1.83倍，NtPCS1P在100μM CdCl₂处理20天环境下启动的目的基因的表达量分别约为正常生长情况下的1.69倍。实验结果表明，本发明的NtPCS1P为锌和/或镉诱导的启动子，具有较好的效果。

综上，本发明的NtPCS1P可作为构建植物表达载体的元件，将其连接在目的基因之前，使目的基因的表达受锌和/或镉诱导。因此，本发明的NtPCS1P对通过启动目的基因在锌和/镉胁迫下的高表达，来提高转基因植物对锌和/或镉的耐受性，具有重要意义。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1为将NtPCS1P启动子构建于pBI121载体质粒中的示意图，其中图A为pBI121示意图，图B为pBI121-NtPCS1P示意图，其中示出了利用NtPCS1P启动子驱动位于其下游的GUS基因表达。

图2为转pBI121-NtPCS1P的烟草分别在500μM ZnCl₂和100μM CdCl₂处理10天和20天环境下幼苗中GUS的染色情况。

图3为转pBI121-NtPCS1P的烟草分别在500μM ZnCl₂和100μM CdCl₂处理10天和20天环境下幼苗中GUS活性的定量统计分析。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发现，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(一)锌和/或镉诱导启动子NtPCS1P的获得

1、植物材料

烟草‘NC89’

2、载体

克隆载体pEASY-Blunt Cloning Kit购自北京全式金公司。

3、试剂与药品

高保真酶PrimeSTAR HS购自TAKARA公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Omega Bio-Tek公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，测序由华大基因科技股份有限公司完成。

缓冲液、试剂、细菌培养基配方参见《分子克隆实验指南》(第三版)(出版社：科学出版社，ISBN：7030103386)。

4、基因克隆

根据SGN(http://solgenomics.wur.nl/)网站上查找到的NtPCS1P启动子序列，设计启动子引物，正向引物中含有HindIII识别序列，反向引物中含有BamHI识别序列：

正向：5’-AAGCTTGTGCAGCAGCTGTTGAAGAAAG-3’；

反向：5’-GGATCCTTTTTCTCGCTTCAGAATCTCC-3’。

用上述引物以烟草‘NC89’的基因组DNA为模板，利用高保真酶PrimeSTAR HS，扩增NtPCS1P启动子。扩增总体积50μL，其中正向引物1μL，反向引物1μL，DNA模板1μL，PrimeSTARHS 25μL，ddH₂O 22μL。扩增程序为：98℃10秒，55℃5秒，72℃5秒，30个循环。琼脂糖凝胶电泳后胶回收与目的启动子大小相近的片段，连接克隆载体pEASY-Blunt。将连接产物转化大肠杆菌，37℃恒温培养16-18小时。挑取大肠杆菌单克隆，接种含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃，150转/每分钟的摇床中扩大培养16-18小时。将扩大培养的大肠杆菌送华大基因科技股份有限公司进行测序分析，测序正确的克隆用以构建表达载体。

5、胶回收

所用Binding Buffer(XP2)、SPW Buffer和Elution Buffer全部来自于OmegaBio-Tek公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒。

(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，置于1.5mL的离心管中。

(2)在离心管中加入与切下的凝胶块等体积的Binding Buffer(XP2)。混合均匀后于55-60℃中放置约7分钟，期间不断晃动(每2-3分钟一次)，直至凝胶块完全融化。

(3)将DNA吸附管置于2mL离心管中(试剂盒内提供)，将上一步完全融化的凝胶液加入到DNA吸附管中，8000-10000×g室温离心1分钟，弃滤液。

(4)将DNA吸附管重新置回2mL离心管中，加入300μL的Binding Buffer(XP2)，10000×g室温离心1分钟，弃滤液。

(5)将DNA吸附管重新置回2mL离心管中，加入700μL的SPW Buffer，静置2-3分钟，10000×g室温离心1分钟，弃滤液。

(6)将DNA吸附管重新置回2mL离心管中，10000×g室温离心1分钟。

(7)将DNA吸附管置于1.5mL离心管中，在吸附管的膜中央加入30-50μL的ElutionBuffer，室温静置1分钟。10000×g室温离心1分钟洗脱DNA片段。

6、与克隆载体的连接

在200μL离心管中依次加入：胶回收DNA片段4μL，pEASY-Blunt Cloning Vector 1μL，轻轻混合，室温反应10分钟。反应结束后，将离心管置于冰上，用于大肠杆菌转化。

7、大肠杆菌转化

(1)加连接产物于50μL Trans1-T1感受态细胞中(pEASY-Blunt Cloning试剂盒提供)，轻弹混匀，冰浴20-30分钟。

(2)42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。

(3)加250μL平衡至室温的SOC/LB，200转每分钟，37℃孵育1小时。

将菌液于4000转每分钟离心1分钟，弃掉部分上清，保留100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，37℃培养过夜。

(二)重组表达载体pBI121-NtPCS1P的构建

1、菌株及载体

大肠杆菌DH5ɑ、根癌农杆菌EHA105、表达载体pBI121均由西南科技大学生命科学与工程学院生物技术系保存。

2、试剂与药品

限制性内切酶购自Thermo公司，Taq酶购自Tiangen公司，T4DNA连接酶购自Promega公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒及小批量质粒提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司。测序由华大基因科技股份有限公司完成。

缓冲液、试剂、细菌培养基配方、大肠杆菌感受态制备参见《分子克隆实验指南》(第三版)。

3、质粒提取

将测序正确的含有启动子的pEASY-Blunt-NtPCS1P克隆以及pBI121大肠杆菌扩大培养，提取质粒。所用溶液I、溶液II、溶液III、Buffer HB、Wash Buffer和Elution Buffer全部来自于Omega Bio-Tek公司的小批量质粒提取试剂盒。

(1)在10-20mL试管中，将携带有所需质粒的大肠杆菌接种到5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃震荡培养12-16小时。

(2)取1.5-5mL菌液室温10000×g离心1分钟。

(3)去上清，加250μL溶液I，涡旋震荡器震荡至菌体完全悬浮。

(4)加入250μL溶液II，温和颠倒离心管4-6次，获得澄清的裂解液，室温孵育2分钟。

(5)加入350μL溶液III，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀。

(6)室温13000×g离心10分钟。

(7)小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2mL离心管的吸收柱中。室温10000×g离心1分钟。

(8)弃滤液，加500μL Buffer HB，10000×g离心1分钟。

(9)弃滤液，用700μL Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1分钟。

(10)重复第(9)步。

(11)将吸收柱重新置回2mL离心管中，13000×g离心2分钟。

将吸收柱放入干净的1.5mL离心管，在吸附柱的膜中央加30-50μL ElutionBuffer，13000×g离心1分钟。

4、NtPCS1P片段和pBI121载体的酶切和胶回收

对提取的pEASY-Blunt-NtPCS1P和pBI121质粒同时用HindIII和BamHI进行双酶切，反应体系如下表1所示，反应条件为37℃酶切2小时。

将酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳后，分别回收NtPCS1P启动子片段和pBI121载体片段。

表1反应体系

加入的试剂	pESAY-Blunt-NtPCS1P	pBI121
			10×Buffer	5	5
质粒	10	43
			HindIII	1	1
BamHI	1	1
			ddH<sub>2</sub>O	33	0
总体积	50	50

5、NtPCS1P片段和pBI121载体的连接

用T4DNA连接酶连接NtPCS1P启动子片段和pBI121载体片段，反应体系为：10×T4ligase buffer 1μL，NtPCS1P启动子片段5μL，pBI121载体片段3μL，T4ligase 1μL。反应条件为：4℃冰箱过夜连接16-18小时。

6、大肠杆菌转化

将连接产物转化大肠杆菌。

(1)从超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，置于冰上解冻。

(2)将连接产物加入到解冻后的感受态细胞中，小心混匀，冰浴30min。

(3)将含有感受态细胞的离心管置于42℃中，热击90秒。

(4)快速将热击后的离心管转移至冰浴中，冷却2-3分钟。

(5)向冷却后的离心管中加入800μL的SOC，混匀后置于37℃摇床中120转每分钟振摇培养1小时。

(6)将菌液于4000转每分钟离心1分钟，弃掉部分上清，保留100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，37℃培养过夜。

(7)挑取大肠杆菌单克隆进行菌落PCR，将阳性克隆接种含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃，150转/每分钟的摇床中扩大培养16-18小时。将扩大培养的大肠杆菌送华大基因科技股份有限公司进行测序分析，测序正确的克隆提取质粒后，用以转化根癌农杆菌EHA105。

7、重组表达载体转化根癌农杆菌EHA105

(1)从超低温冰箱中取出根癌农杆菌感受态细胞，置于冰上解冻。

(2)将测序正确的重组表达质粒10μL加入到解冻后的感受态细胞中，小心混匀，冰浴30min。

(3)将含有感受态细胞的离心管置于液氮中，速冻1分钟。

(4)快速将速冻后的离心管转移至37℃水浴锅中，放置2-3分钟。

(5)向离心管中加入800μL的SOC，混匀后置于28℃摇床中120转每分钟振摇培养4小时。

(6)将菌液于4000转每分钟离心1分钟，弃掉部分上清，保留100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，28℃培养2天。

(7)挑取农杆菌单克隆进行菌落PCR。

(8)挑取阳性克隆摇菌，并用甘油保存菌液备用。

实施例2利用启动子NtPCS1P驱动报告基因在烟草中表达

1、农杆菌介导的烟草遗传转化

将含有pBI121-NtPCS1P质粒的重组农杆菌通过下述文献中描述的方法(做部分修改)转化烟草：Horseh R B,Fry J E,Hoffmann N I,et al.A simple and general methodfor transferring genes into plants.Science,1985,227:1229-1231.，具体方法如下。

(1)将烟草种子灭菌后播种于含有1/2MS固体培养基的培养瓶中，置于光照培养箱中，培养条件为：25℃，16小时光照，23℃，8小时黑暗，光照强度为80μmol m^-2s^-1。

(2)将含有pBI121-NtPCS1P质粒的重组农杆菌接种于5mL含有50μg/mL利福平和50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，28℃摇床培养12小时，得到5mL pBI121-NtPCS1P种子液。接种1mL pBI121-NtPCS1P种子液至50ml含有50μg/mL利福平和50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，28℃摇床培养至OD600为0.8左右，得到pBI121-NtPCS1P培养液。将pBI121-NtPCS1P培养液于室温4000转每分钟，离心4分钟，弃上清收集菌体，用约10mL活化液(含有15mg/L乙酰丁香酮的MS液体培养)重悬菌体，备用。

(3)在灭菌的培养皿中加入40mL的活化液，用移液器吸取800μL重悬菌体加入到含有活化液的培养皿中，混匀。剪取培养瓶中的烟草叶片，切割成1cm²左右的叶片方块。将叶片方块浸入活化液和菌体的混合物中10分钟，期间可用无菌镊子尖部对叶片方块垂直打孔。

将叶片方块捞出置于无菌滤纸上吸干液体，随后将叶片置于共培养基上，于24±1℃、黑暗条件下培养2天后，转移到分化培养基上；然后，置于光照培养箱中，培养条件为：25℃，16小时光照，23℃，8小时黑暗，光照强度为80μmol m^-2s^-1。每2周更换一次培养基。当愈伤组织长出1.5cm左右的新芽时，切取嫩芽转移至生根培养基上生根，培育约2周后获得完整的硫酸卡那霉素抗性植株。待根系发达后转移至盆中，在温室内24±1℃、16小时光照，8小时黑暗条件下培养至种子成熟，收获成熟的烟草种子(即T1代转基因种子)。各培养基成分见表2。

表2烟草组织所用培养基

注：AS：乙酰丁香酮(Acetosyringone)，6-BA：6－苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)，NAA：萘乙酸(1-Naphthylacetic acid)，Kan：硫酸卡纳霉素(Kanamycin Monosulfate)，Cef：头孢(Cefixime)。

(5)将T1代转基因烟草种子进行灭菌处理得到无菌T1代烟草种子。将无菌T1代烟草种子播种于含200μg/mL硫酸卡那霉素的1/2MS固体选择培养上，置于光照培养箱中，培养条件为：25℃，16小时光照，23℃，8小时黑暗，光照强度为80μmol m^-2s^-1。经筛选培养，得到含有硫酸卡那霉素抗性基因的转基因烟草幼苗。将含有硫酸卡那霉素抗性基因的转基因烟草幼苗转移至盆中，在温室内24±1℃、16小时光照，8小时黑暗条件下培养至种子成熟，收获成熟的烟草种子(即T2代转基因种子)。

2、锌和镉诱导NtPCS1P

将T2代转基因烟草种子进行灭菌处理，得到无菌T2代烟草种子。将无菌T2代烟草种子分别播种在含有200μg/mL硫酸卡那霉素的1/2MS固体选择培养、含有200μg/mL硫酸卡那霉素和500μM ZnCl₂的1/2MS固体选择培养、含有200μg/mL硫酸卡那霉素和100μM CdCl₂的1/2MS固体选择培养上。然后，置于光照培养箱中，分别培养10天和20天进行GUS组织化学染色。培养条件为：25℃，16小时光照，23℃，8小时黑暗，光照强度为80μmol m^-2s^-1。

3、GUS组织化学染色

GUS能与显色底物X-gluc反应，呈现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性的研究GUS的表达水平和表达模式。

(1)GUS染色底物的配制：50mL 0.5M磷酸缓冲液(pH7.0)，50μL 100mM铁***K₃Fe(CN)₆(将3.2924g铁***溶于水，定容至100mL，4℃保存)，50μL 100mM亚铁***K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O(将4.2239g亚铁***溶于水，定容至100mL，4℃保存)，1mL 0.5M EDTA，250μL 1mg/mL X-gluc(用二甲基甲酰胺溶解，-20℃避光保存)。

(2)染色步骤

染色：将待测样品浸到GUS染液中，37℃保温箱中放置24-36小时。

脱色：将染色后的样品经系列浓度乙醇脱色，浓度分别为：50％，75％和90％，至完全脱色后又降低浓度，依次为：90％，70％和50％，最后将样品保存在50％的乙醇溶液中。

(3)观察

用体视镜(Leica M205C)分别观察脱色后的正常培养10天和20天的烟草、脱色后的500μM ZnCl₂处理10天和20天的烟草和脱色后的100μM CdCl₂处理10天和20天的烟草并拍照，结果见图2。结果显示，正常培养10天的烟草经GUS染色后，叶脉呈现淡蓝色，而500μMZnCl₂或100μM CdCl₂处理10天的烟草叶脉呈现深蓝色；正常培养20天的烟草经GUS染色后，叶脉呈现淡蓝色，而500μM ZnCl₂或100μM CdCl₂处理20天的烟草叶脉呈现深蓝色，并且在500μM ZnCl₂或100μM CdCl₂处理20天的烟草根也呈现蓝色。GUS染色实验结果表明，相对正常培养的烟草，500μM ZnCl₂或100μM CdCl₂处理的烟草中GUS表达量增加，在叶脉和根中GUS表达量的增加较高。

4、GUS酶活的测定

按照Cote等的方法(Cote C,Rutledge RG.An improved MUG fluorescent assayfor the determination of the GUS activity within transgenic tissue of woodyplants.Plant Cell Report,2003,21(6):619-624.)对正常培养10天和20天的烟草、500μMZnCl₂处理10天和20天的烟草和100μM CdCl₂处理10天和20天的烟草进行GUS基因表达的荧光定量分析，实验结果如图3所示，实验结果显示：正常培养10天的烟草的GUS活性值为7.63nmol 4-MU min^-1mg^-1蛋白，500μM ZnCl₂处理10天的烟草的GUS活性值为12.2nmol 4-MUmin^-1mg^-1蛋白，100μM CdCl₂处理10天的烟草的GUS活性值为11.52nmol 4-MU min^-1mg^-1蛋白，ZnCl₂处理和CdCl₂处理10天下GUS活性分别是正常培养的1.6倍和1.51倍，呈极显著差异。正常培养20天的烟草的GUS活性值为8.14nmol 4-MU min^-1mg^-1蛋白，500μM ZnCl₂处理20天的烟草的GUS活性值为14.93nmol 4-MU min^-1mg^-1蛋白，100μM CdCl₂处理20天的烟草的GUS活性值为13.72nmol 4-MU min^-1mg^-1蛋白，ZnCl₂处理和CdCl₂处理20天下GUS活性分别是正常培养的1.83倍和1.69倍，呈极显著差异。上述结果表明启动子NtPCS1P受锌和或镉诱导。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 西南科技大学

<120> 一种诱导启动子NtPCS1P及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1097

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotiana tabacum）

<400> 1

gtgcagcagc tgttgaagaa agacacacac aatacacaag acacaagact gaaatcgctc 60

aactgatttg gctatacatt gcactccttc ctctcagtat ttccatacga ttttttgaat 120

ttctactcct tcgttctgca ttgttttaac ttcaaacaaa gcaactgtaa gtgtgatttg 180

ctaccgaact ttgtgttcgc tgaaacactg ggctttgaag gaccgctaca ccagtgtgtg 240

attcgttcta tcctgggagg aaataatcca ttaccttggg tactaggagg ggattaaatt 300

ccttaagaaa acactgtgaa ttcagtgggc tcgaattaat tactgtttca ttacgataac 360

ttatattttg cagaattatt atttacaaat acaacaatat tggcgggact aacatattcc 420

tcgcttcatt ttatttatga atttgtggtt gtcccttttt tgttttggtc ataagtgaat 480

gactcaccaa acattgtaaa ttatagaaac tttatttgaa aatatgagat ttgtttacat 540

gttggacgat tttccagtga ctctataata gagttttaat caattttctt ggaataatta 600

cataatcaat ccttatatta attttttaga acacataagg tgtattcaca actaaaatca 660

gatcgtaaat gctttactct atatttaatt taatgcgata aacgttttta ttgcaataga 720

tctttcttag gacaaagtaa aaggaaatcc gaatctcttc atgatctaga taaaaaaata 780

gaatatttct ctttttctct ttttccacat tgtagtggtt cttctttatt ccttatactt 840

tgtctattag tgctacttgc catatatttc cattgtacac aaaccttttc tatttaattt 900

gtttattgtt tttcacaata ttggtacaaa tctttgacta cacgaaagct gttgattcgt 960

gaatcgcgtt tgcgcctttt aaattaacgc ggggaatcta ataaaccggc ggaattaaaa 1020

tccctaagtg aggtgaggca cacaagagat actcctacta ctagtattta ttgggggaga 1080

ttctgaagcg agaaaaa 1097

Claims (3)

1.一种锌和/或镉诱导启动子NtPCS1P在烟草中表达的应用，其特征在于，设计启动子引物，正向引物中含有Hind III识别序列，反向引物中含有BamH I识别序列：

正向：5’-AAGCTTGTGCAGCAGCTGTTGAAGAAAG-3’；

反向：5’-GGATCCTTTTTCTCGCTTCAGAATCTCC-3’；

用前述启动子引物以烟草‘NC89’的基因组DNA为模板，利用高保真酶PrimeSTAR HS，扩增NtPCS1P启动子，再通过胶回收进行纯化，得到锌和/或镉诱导启动子NtPCS1P核酸；再将锌和/或镉诱导启动子NtPCS1P核酸与克隆载体连接，并经大肠杆菌转化后，形成第一重组表达载体；将测序正确的第一重组表达载体和表达载体通过酶切、胶回收纯化，将锌和/或镉诱导启动子NtPCS1P核酸与表达载体连接，并经大肠杆菌转化后，形成第二重组表达载体，即可应用于烟草中进行表达；

所述锌和/或镉诱导启动子NtPCS1P的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述锌和/或镉诱导启动子NtPCS1P用于驱动目的基因在烟草中的表达。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，在表达的烟草中含有基于所述锌和/或镉诱导启动子NtPCS1P的表达盒和转基因细胞系。

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