CN105985956A - 一种逆境诱导表达GhiWRKY40启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种逆境诱导表达GhiWRKY40启动子及其应用。本发明公开一种DNA分子，为如下(1)-(3)任一所示：(1)SEQ ID No.8所示的DNA分子；(2)SEQ ID No.11中第1位至第1197位核苷酸所示的DNA分子；(3)SEQ ID No.11所示的DNA分子。本发明公开的启动子可以应用于影响逆境下目的基因的表达，为培育抗旱耐盐碱等植物新品种提供了诱导型启动子，对培育抗逆境植物新品种具有重要的理论及现实意义。

Description

一种逆境诱导表达GhiWRKY40启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种启动子及其应用；特别涉及一种逆境诱导表达GhiWRKY40启动子及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

植物的抗逆性反应是一个非常复杂的过程，可以通过一种途径完成，也可以经过多种途径相互协同或抑制而共同完成，其中包括植物细胞质膜对外源刺激信号的感知，通过第二信使将信号传递给相应的胁迫应答转录因子，最终转录因子与胁迫应答的顺式作用元件特异性结合，从而激活下游基因的表达对逆境作出应答。其中，启动子序列中包含许多重要的顺式作用元件，对植物基因的表达水平具有重要作用，使其成为表达调控的关键环节，无论是在基因功能研究还是在转基因技术研究中都具有十分重要的地位。因此，对启动子结构、功能和作用机制的研究将有助于了解基因调控模式和信号传递途径,对深入了解棉花的防卫机制、提高作物的抗逆性有重要的意义。

低温、干旱、盐碱等非生物胁迫是棉花产量和品质的重要限制因子。近年来，自然条件变化的加剧严重影响着棉花产量的稳定，一定程度上影响了我国棉花产业的稳步发展。因此，开展棉花抗逆研究，通过植物基因的工程手段提高其对干旱、高盐等非生物逆境的忍耐能力具有重要意义。近年来,多种抗逆基因相继被克隆，将其转入作物显著提高了作物对非生物逆境的抵抗能力。但是，包括很多其他转基因提高抗性的实验多采用CaMV35S组成型启动子驱动外源基因的表达，虽然转基因植物的抗逆性得以提高，对植物正常的生长发育以及生理代谢活动产生了严重的抑制。并且，越来越多的研究发现，低温等非生物逆境多发于决定棉花产量和品质的生育中后期，然而随着发育年龄的增加，CaMV35S驱动能力却呈现一定的下降，对于提高棉花抗逆性能造成一定的影响。因此，克隆逆境诱导型启动子尤其是棉花自身逆境诱导型启动子对于棉花抗逆基因工程研究及应用具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供培育抗逆境植物新品种的方法。

为了解决以上技术问题，本发明提供一种DNA分子，为如下(1)-(3)任一所示：

(1)SEQ ID No.8所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No.11中第9位至第1197位核苷酸所示的DNA分子；

(3)SEQ ID No.11所示的DNA分子。

为了解决以上技术问题，本发明还提供一种上调植物逆境胁迫下目的基因表达的方法，包括如下步骤：将上述的DNA分子导入出发植物中，得到转基因植物，使得所述转基因植物中的目的基因以上述DNA分子作为启动子启动所述目的基因的转录；与所述出发植物相比，所述转基因植物的目的基因表达上调；

所述目的基因为所述出发植物的内源基因或外源基因。

上述方法中，所述逆境胁迫为非生物逆境胁迫。

上述任一所述的方法中，所述目的基因为抗逆基因。

上述任一所述的方法中，所述抗逆基因为具有抗非生物逆境胁迫能力的基因。

上述任一所述的方法中，所述非生物逆境胁迫为低温胁迫、高盐胁迫、脱落酸胁迫、干旱胁迫和/或碱胁迫。

为了解决以上技术问题，本发明还提供上述DNA分子在制备启动子中的应用。

为了解决以上技术问题，本发明还提供上述DNA分子或上述任一所述的方法在制备抗逆性增强的植物中的应用。

上述应用中，所述抗逆性为抗非生物逆境胁迫能力。

上述应用中，所述非生物逆境胁迫为低温胁迫、高盐胁迫、脱落酸胁迫、干旱胁迫和/或碱胁迫。

上述任一所述的方法或应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，具体可为十字花科植物，如拟南芥。

本发明提供的启动子可以应用于影响逆境下目的基因的表达，为培育抗旱耐盐碱等植物新品种提供了诱导型启动子，对培育抗逆境植物新品种具有重要的理论及现实意义。

附图说明

图1为非逆境处理条件下GhiWRKY40基因在棉花苗期的不同组织器官中的表达水平以及在逆境处理条件下GhiWRKY40基因在棉花苗期整株苗中的表达水平。

图2为转基因拟南芥的PCR鉴定。

图3为转基因拟南芥中各不同组织器官中GUS的表达情况。

图4为不同逆境处理条件下启动子被诱导后基因的表达水平。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

棉花C312(Coker312)(Gossypium hirsutum L.)在文献“Zhu Y-N,Shi D-Q,RuanM-B,Zhang L-L,Meng Z-H,Liu J,Yang W-C(2013)Transcriptome Analysis RevealsCrosstalk of Responsive Genes to Multiple Abiotic Stresses in Cotton(Gossypiumhirsutum L.).PLoS ONE 8(11):e80218.doi:10.1371/journal.pone.0080218”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

pZero back/blunt为天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为VT204-03。

pPZP111-GUS-NOS的序列如SEQ ID No.12所示，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

Genome Walking Kit为TaKaRa产品，产品目录号为6108。

拟南芥Col-0生态型(Arabidopsis thaliana L.)在文献“Xin-Ran Li,Hong-JuLi,Li Yuan,Man Liu,Dong-Qiao Shi,Jie Liu and Wei-Cai Yang.(2014)Arabidopsis DAYU/ABERRANT PEROXISOME MORPHOLOGY9Is a Key Regulator ofPeroxisome Biogenesis and Plays Critical Roles during Pollen Maturation andGermination in Planta.The Plant Cell,26:619–635.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)：1mol/LNa₂HPO₄的水溶液取5.77mL，1mol/L NaH₂PO₄的水溶液取4.23ml，用水定容至100mL。

10％SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10gSDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节pH至7.2，然后加水定容至100mL。

0.5M EDTA(pH8.0)：在80mL水中加入18.61gNa₂EDTA·2H₂O，用NaOH调pH至8.0，溶解后加水定容至100mL。

GUS酶提取液：0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)取50mL，10％SDS溶液取1mL，0.5MEDTA(pH8.0)取2mL，Triton X-100取100μL，β-巯基乙醇100μL，用水定容至100mL。

MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10mL GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。

反应终止液(0.2mol/L Na₂CO₃的水溶液)：称2.12g Na₂CO₃，用水定容到100mL。

下述实施例中的ABA为脱落酸。

实施例1、棉花逆境诱导表达启动子的筛选及基因表达的鉴定

一、棉花幼苗的种植及逆境处理

将健康、饱满的棉花C312(Coker312)(Gossypium hirsutum L.)种子在体积百分含量75％的乙醇水溶液中处理一分钟，然后倒出溶液，加入10％的双氧水浸泡2小时，期间晃动若干次。倒出双氧水，用灭菌蒸馏水将种子表面的双氧水冲洗干净后，在灭菌蒸馏水中浸泡过夜，确保整个过程在无菌条件下进行。

二、取经过步骤一处理之后露白一致的种子种植在1/2MS培养基上，置于25℃,12小时光周期的培养箱中培养5天，使其发芽，然后分别移至相应的逆境培养基上进行逆境处理，各种逆境处理条件如表1所示。

表1 各组处理条件

表1中，含200mM NaCl的1/2MS培养基(pH＝5.8)由溶剂和溶质组成；溶质为NaCl，溶剂为1/2MS培养基(pH＝5.8)，NaCl在含200mM NaCl的1/2MS培养基(pH＝5.8)中的浓度为200mM；含有1μM ABA的1/2MS培养基(pH＝5.8)由溶剂和溶质组成；溶质为ABA，溶剂为1/2MS培养基(pH＝5.8)，ABA在含有1μM ABA的1/2MS培养基(pH＝5.8)中的浓度为1μM；含有200mM甘露醇的1/2MS培养基(pH＝5.8)由溶剂和溶质组成；溶质为甘露醇，溶剂为1/2MS培养基(pH＝5.8)，甘露醇在含有200mM甘露醇的1/2MS培养基(pH＝5.8)中的浓度为200mM。

三、采用改良的LiCl沉淀法提取表1中各处理组的幼苗(整株苗)的总RNA，DNA酶消化后的总RNA的浓度和纯度通过NanoDrop ND-1000spectrophotometer及琼脂糖凝胶电泳进行分析，检验合格的总RNA用于下述实验。

四、逆境诱导表达转录因子的筛选

与对照组相比，分析其余各处理组的棉花幼苗在低温、高盐、ABA、干旱、碱害五种非生物逆境条件下的转录组的表达变化(参照文献“Zhu Y-N,Shi D-Q,Ruan M-B,Zhang L-L,Meng Z-H,Liu J,Yang W-C(2013).Transcriptome Analysis RevealsCrosstalk of Responsive Genes to Multiple Abiotic Stresses in Cotton(Gossypiumhirsutum L.).PLoS ONE 8(11):e80218.doi:10.1371/journal.pone.0080218”)，获得一系列受五种逆境共诱导表达的候选基因，结果发现，五种非生物逆境处理条件下，WRKY类转录因子在上调的转录因子中占据最大比率，并且无论是转录本丰富程度还是上调表达水平WRKY类转录因子都处于领先位置。因此，GhiWRKY40基因成为逆境诱导表达启动子分离的关键候选基因，该基因在多逆境芯片中的上调表达倍数结果如表2所示。

表2 GhiWRKY40在多逆境芯片中的上调表达倍数

表2表明，GhiWRKY40可以被ABA、低温、干旱及碱害诱导上调表达，并且诱导表达倍数均在5倍以上，但不被高盐逆境诱导表达。因此，选择该基因为非生物逆境诱导表达启动子分离的候选基因。

五、逆境诱导表达转录因子的鉴定

利用荧光定量PCR的方法对候选基因的组织表达特异性及其逆境诱导表达特性进行鉴定，进一步确定候选基因。

取对照组的幼苗，分别提取其根、茎、叶的总RNA，同时提取其余各个处理组的整株苗的总RNA，将各个总RNA反转录成cDNA。然后利用实时荧光定量PCR技术，采用SuperReal PreMix(SYBR Green)(天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为FP204)，在荧光定量PCR仪C1000TM Thermal Cycler(CFX96real-time system,Bio-Rad，USA)上检测逆境应答相关基因的表达情况。以棉花ACTIN1基因为内参，实验设三次重复。

内参ACTIN1的实时荧光定量PCR引物：

GhiACTIN1上游引物：5'-GTTTATGTGCGGGAAGTTAGG-3'；(SEQ ID No.1)

GhiACTIN1下游引物：5'-TAATGGTGGTGATACGGTGAA-3'。(SEQ ID No.2)

棉花GhiWRKY40基因的实时荧光定量PCR引物：

GhiWRKY40上游引物：5'-GCTTTGGTGGAGGAATTGAA-3'；(SEQ ID No.3)

GhiWRKY40下游引物：5'-CCTCACACTCGGCTTTTCTC-3'。(SEQ ID No.4)

数据处理采用Comparative Ct的方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，ΔCt＝Ct(GhiWRKY40)-Ct(GhiACTIN1)，以2^-ΔCt值衡量基因转录水平，对非逆境处理条件下棉花不同组织器官中抗逆应答基因的表达模式以及五种逆境处理条件下棉花抗逆应答基因的表达模式进行分析比较。

非逆境处理条件下(对照组)GhiWRKY40基因在棉花苗期的不同组织器官中的表达水平如图1A所示。

图1A表明，抗逆应答基因GhiWRKY40在根中的表达量最高，茎中次之，在叶片中表达量最低。

逆境处理条件下GhiWRKY40基因在棉花苗期整株苗中的表达水平如图1B所示。

图1B表明，与对照组相比，在五种逆境处理条件下，GhiWRKY40基因在棉花幼苗中均呈现显著性的上调表达，其中在干旱条件下表达上调的最多。

以上结果表明，GhiWRKY40是一个在根中强势表达并且可以被非生物逆境诱导上调表达的基因。

实施例2、染色体步移获取GhiWRKY40基因上游的启动子序列

一、特异性引物的设计

设计如下三个特异性引物，设计方向为需要扩增的未知区域方向，GhiWRKY40SP2的位置应设计在GhiWRKY40SP1的内侧，GhiWRKY40SP3位于GhiWRKY40SP2的内侧。进行染色体步移，用于获取GhiWRKY40转录区上游的启动子序列。

染色体步移特异引物：

GhiWRKY40SP1：5′-CCCATTGTTGTTGTTGCTGGTTTC-3′(SEQ ID No.5)

GhiWRKY40SP2：5′-ATCCACTAACTGGCTTTGCAATGC-3′(SEQ ID No.6)

GhiWRKY40SP3：5′-GTTCCTCCATTAAAGCACCACTCTG-3′(SEQ ID No.7)

二、棉花基因组DNA的提取

用改良的CTAB法提取未经任何处理的棉花C312(Coker312)叶片的基因组DNA。

三、染色体步移

染色体步移按Genome Walking Kit操作，具体方法为：以步骤二提取的基因组DNA作为模板，以试剂盒中的AP primer作为上游引物，GhiWRKY40SP1作为下游引物，进行第一轮PCR反应，得到第一轮PCR扩增产物；然后将第一轮PCR扩增产物稀释1000倍后作为模板，以AP primer作为上游引物，GhiWRKY40SP2作为下游引物，进行第二轮PCR反应，得到第二轮PCR扩增产物；再将第二轮PCR扩增产物稀释1000倍后作为模板，以AP primer作为上游引物，GhiWRKY40SP3作为下游引物，进行第三轮PCR反应，得到第三轮PCR扩增产物。

四、基因上游启动子序列的获得

取第一轮、第二轮、第三轮PCR扩增产物各20μL进行1％的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收清晰的电泳条带，分别回收各条带与pZero back/blunt载体连接得到各重组质粒，将各重组质粒的***序列进行测序并拼接获得一个长度为1.696kb的DNA片段，与棉花GhiWRKY40已知序列进行比较，结果该1.696kb的DNA片段含有GhiWRKY40基因cDNA序列5’端编码区的343个核苷酸，即5’端编码区部分重叠，表明所剩余的长度为1.353kb的DNA片段就是GhiWRKY40基因的启动子序列，将其命名为GhiWRKY40启动子，其序列如SEQ ID No.8所示。

五、GhiWRKY40启动子的序列分析

通过启动子顺式作用元件预测网站PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/sigscan)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/p-lantcare/html/)相关信息学软件对获得的序列中的顺式作用元件进行搜索、预测和分析，结果表明，该启动子中含有众多与己知真核生物的顺式元件的同源序列。序列除了含基本的启动元件以外，还包含CAAT-box、ABRE、DREB、I-box、G-box、W-box、E-box、CACT-box、GATA-box、WRKY、CBF等逆境诱导型启动子的作用元件。表明该启动子可能具有多重因子的诱导活性。

实施例3、GhiWRKY40启动子的克隆及转基因表达载体的构建

一、根据所获得的GhiWRKY40的启动子序列，结合生物信息学预测的转录起始位点及终止位点设计引物，设计并合成的引物如下：

GhiWRKY40-F：5′-AACTGCAGCCAACACCAGTCGTCACTATTCT-3′(SEQ ID No.9)

(下划线所示序列5′-CTGCAG-3′为PstI酶切识别位点)

GhiWRKY40-R：5′-CGGGATCCTGGTGGAAAGAAATCGAAGG-3′(SEQ ID No.10)

(下划线所示序列5′-GGATCC-3′为BamHI酶切识别位点)

二、提取实施例1中对照组的棉花的叶片的基因组DNA，以其为模板，以GhiWRKY40-F和GhiWRKY40-R为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(如SEQ ID No.11所示)，将其与pZero back/blunt载体连接，得到重组质粒，将其命名为pZeroback/blunt-GhiWRKY40promoter，将重组质粒送测序，结果正确。

SEQ ID No.11中第9位至第1197位为GhiWRKY40启动子的部分序列。

三、PstI和BamHI双酶切pZero back/blunt-GhiWRKY40promoter，得到基因片段；PstI和XbaI双酶切pPZP111-GUS-NOS，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为PGhiWRKY40GUS(pPZP111-GhiWRKY40promoter-GUS-NOS)，将其送测序，结果正确，表明SEQ ID No.11所示的DNA分子替换了pPZP111-GUS-NOS的PstI和BamHI位点间序列，pPZP111-GUS-NOS的其余序列保持不变。

四、将PGhiWRKY40GUS转化农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，再将重组农杆菌转化拟南芥Col-0生态型，得到T0代转PGhiWRKY40GUS质粒拟南芥。

将空载体pPZP111-GUS-NOS转化农杆菌GV3101，得到对照农杆菌，再将对照农杆菌转化拟南芥Col-0生态型，得到T0代转pPZP111-GUS-NOS质粒对照拟南芥。

五、分别收获T0代转PGhiWRKY40GUS质粒拟南芥以及T0代转pPZP111-GUS-NOS质粒对照拟南芥的种子，于37℃保温箱中烘干3天后，置于4℃冰箱中春化2天。将收获的T0代转PGhiWRKY40GUS质粒拟南芥以及T0代转pPZP111-GUS-NOS质粒对照拟南芥的种子在含有50mg/mL卡那霉素的MS筛选培养基上进行选择性培养，分别得到T1代转PGhiWRKY40GUS质粒拟南芥阳性苗和T1代转pPZP111-GUS-NOS质粒对照拟南芥阳性苗。

六、单株提取T1代转PGhiWRKY40GUS质粒拟南芥阳性苗基因组DNA，利用引物GhiWRKY40-F和GhiWRKY40-R进一步进行PCR阳性鉴定。其中，以T1代转pPZP111-GUS-NOS质粒对照拟南芥阳性苗的基因组DNA为模板，进行上述实验作为阴性对照，PGhiWRKY40GUS质粒为模板，进行上述实验作为阳性对照。PCR扩增结果如图2所示。

图2中，1为阳性对照的PCR扩增产物，2、3、4为以T1代转PGhiWRKY40GUS质粒拟南芥阳性苗基因组DNA为模板的PCR扩增产物，5为阴性对照的PCR扩增产物，M为DNA marker。

图2表明，T1代转PGhiWRKY40GUS质粒拟南芥阳性苗基因组DNA和PGhiWRKY40GUS质粒的PCR扩增产物中具有目的条带，阴性对照无目的条带。进一步确定步骤五筛选得到的T1代转PGhiWRKY40GUS质粒拟南芥阳性苗为转PGhiWRKY40GUS阳性，在下述实施例中均将其简称为转基因拟南芥。

实施例4、转基因拟南芥中GhiWRKY40启动子启动下的GUS表达特性分析

一、染色：在避光条件下，加入适量GUS染色液于2mL的离心管中，将T1代转基因拟南芥浸到离心管的GUS染液中，抽真空30min，然后将其置于37℃保温箱中放置6h。

二、漂洗：依次用体积百分含量30％，50％，70％，100％的乙醇水溶液浸泡漂洗T1代转基因拟南芥，每次浸泡30分钟。

三、脱色：最后加入100％乙醇浸泡T1代转基因拟南芥直至完全脱色。

四、记录：在体视显微镜下拍照记录。

转基因拟南芥中各不同组织器官中GUS的表达情况如图3所示。

图3中，a为T1代转基因拟南芥幼苗的GUS染色；b为T1代转基因拟南芥幼苗真叶及茎的GUS染色；c为T1代转基因拟南芥幼苗根的GUS染色；d为T1代转基因拟南芥花序的GUS染色；e为T1代转基因拟南芥花药和柱头的GUS染色；f为T1代转基因拟南芥种子的GUS染色；g为T1代转基因拟南芥角果的GUS染色。

图3表明，GUS在拟南芥根、茎、叶、花序、萼片、柱头、角果中均有表达，并且根茎叶中的表达量稍高。

pPZP111-GUS-NOS中不存在任何可以启动GUS表达的原件。

实施例5、在不同逆境处理条件下GhiWRKY40启动子诱导表达后的GUS定量分析

一、将T1代转基因拟南芥(分别命名为PGhiWRKY40-18和PGhiWRKY40-28)分别进行如表3所示的各组处理，得到各组幼苗。

表3 逆境处理条件

二、GUS基因的定量检测

(一)分别在处理16h、24h和48h时，取步骤一的各组幼苗(质量为100mg左右)，用液氮将其急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里分别磨碎各处理组的组织。如果不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80℃冰箱。

(二)将研磨破碎的各组织分别转到EP管里，并立即加入1mL的GUS酶提取液，充分混匀。

(三)12000rpm，4℃离心5min，将上清转至另一EP管中，冰上放置待用。

(四)Bradford法测定各个上清中的蛋白浓度。

(五)GUS表达水平的定量测定

1、取100μL各个上清，分别加入400μL 37℃预热的GUS酶提取液，再加入500μLMUG底物，37℃温浴，得到混合反应物。在0min、15min、30min、45min和60min分别取混合反应物200μL加入到800μL反应终止液中，得到各最终反应物，室温避光保存。

2、用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm时测定各最终反应物不同时间点的荧光强度值。

3、以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。

4、用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，分别求出2个转基因植株PGhiWRKY40-25和PGhi WRKY40-28单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。结果如图4所示。

图4中，CK代表对照组；Cold代表低温组；ABA代表ABA组；Mannitol代表干旱组；pH代表碱组。

图4表明，与对照组相比，PGhiWRKY40-18和PGhiWRKY40-28转基因株系在ABA、低温(Cold)、干旱(Mannitol)、碱(pH＝11)等逆境条件处理24h后，GUS基因表达量均被诱导上调表达，并且随着处理时间的延长荧光信号强度迅速上升，表明PGhiWRKY40基因启动子受到多种逆境条件的诱导表达，与芯片检测结果一致。

Claims (10)

1.一种DNA分子，为如下(1)-(3)任一所示：

(1)SEQ ID No.8所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No.11中第9位至第1197位核苷酸所示的DNA分子；

(3)SEQ ID No.11所示的DNA分子。

2.一种上调植物逆境胁迫下目的基因表达的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的DNA分子导入出发植物中，得到转基因植物，使得所述转基因植物中的目的基因以权利要求1所述的DNA分子作为启动子启动所述目的基因的转录；与所述出发植物相比，所述转基因植物的目的基因表达上调；

所述目的基因为所述出发植物的内源基因或外源基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述逆境胁迫为非生物逆境胁迫。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述目的基因为抗逆基因。

5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于：所述抗逆基因为具有抗非生物逆境胁迫能力的基因。

6.根据权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于：所述非生物逆境胁迫为低温胁迫、高盐胁迫、脱落酸胁迫、干旱胁迫和/或碱胁迫。

7.权利要求1所述的DNA分子在制备启动子中的应用。

8.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2-6任一所述的方法在制备抗逆性增强的植物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗非生物逆境胁迫能力。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述非生物逆境胁迫为低温胁迫、高盐胁迫、脱落酸胁迫、干旱胁迫和/或碱胁迫。