CN103102400B

CN103102400B - 大豆转录活性蛋白GmPHD6及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103102400B
Application number: CN201110359375.3A
Authority: CN
Inventors: 陈受宜; 张劲松; 韦伟; 张玉芹; 哈达; 张万科; 马彪; 林晴
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2011-11-14
Filing date: 2011-11-14
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2031-11-14
Also published as: CN103102400A

Abstract

本发明公开了一种大豆转录活性蛋白GmPHD6及其编码基因与应用。该大豆PHD转录因子，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，该大豆PHD转录因子GmPHD6及其编码基因可用于培育耐逆植物品种特别是耐逆大豆品种，如耐盐、耐旱大豆。

Description

大豆转录活性蛋白GmPHD6及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大豆转录活性蛋白GmPHD6及其编码基因与应用。

背景技术

环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，因此培育耐逆性高的作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞具有多条途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。现已在植物中发现了多类与植物耐逆性相关的转录因子，例如：EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB等等。PHD(Plant Homodomain)类具有转录活性的蛋白广泛存在于动植物以及细菌、病毒蛋白中，比如哺乳动物的CBP类蛋白、人的ING1家族、酵母Yng2p蛋白、病毒MIR1蛋白。PHD类蛋白结构域是C4HC3类的锌指结构，其功能主要为以下几类：(1)作为乙酰化或去乙酰化酶参与染色质相关的转录调控；(2)作为E3泛素连接酶参与蛋白降解；(3)作为PIPs受体感知PIPs信号参与染色质相关的转录调控。在拟南芥中首次发现了PHD类蛋白，植物中该类蛋白的功能研究尚少。

大豆是我国五大作物之一，弄清其耐非生物胁迫分子机理，进而为提高其耐逆性提供基础，具有重要的理论及现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆转录活性蛋白GmPHD6及其编码基因与应用。

本发明所提供蛋白，名称为GmPHD6，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.))，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由248个氨基酸残基组成。

上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述蛋白GmPHD6的编码基因GmPHD6也属于本发明的保护范围。

该基因可为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的序列1由747个脱氧核苷酸组成，本序列为GmPHD6基因的读码框，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

上述重组载体具体为将蛋白GmPHD6的编码基因***pROK II载体的Xba I和Kpn I识别位点间得到的重组载体；

本发明还保护了扩增上述蛋白GmPHD6的编码基因全长或其任意片段的引物对。

上述引物对可为扩增GmPHD6的所有引物对，具体可为如下(I)或(II)：

(I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对；

(II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对。

上述蛋白或其编码基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆性植物中的应用是本发明保护的范围。

上述应用具体为将上述基因通过上述重组载体导入植物中，得到转基因毛状根；所述转基因毛状根的增长率大于与转空载体毛状根，转空载体毛状根为将pROKII转入植物得到的转空载体毛状根；

在上述应用中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；

在上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；本发明的实施例中的双子叶植物具体为大豆。

所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将所述基因导入目的植物，会使所述蛋白质目的植物中合成，进而是目的植物的耐逆性性状得到改良。

所述基因可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％，优选为多于45％，更优选为多于50％，最优选多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。

在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。

携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明的实验证明，GmPHD6的表达受高盐、干旱和低温诱导，也受植物激素脱落酸ABA的诱导。已知ABA与植物非生物胁迫应答相关，因此GmPHD6可能与植物对非生物逆境应答的调控相关。之后将GmPHD6基因经发根农杆菌的介导，导入大豆科丰一号根中，获得了转GmPHD6基因的根系，导入GmPHD6的大豆根系与转化空载体大豆根系相比，其耐盐和耐旱性显著提高，GmPHD6基因能够显著提高植物的耐盐、耐旱性。说明GmPHD6参与植物对非生物胁迫应答的调控。

本发明对于培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定，对提高农作物产量具有重要意义。并且从分子生物学角度证明了PDH家族中的一些成员确实参与植物对非生物胁迫应答的调控，其表达与植物的耐非生物胁迫呈正相关。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为GmPHD6基因在高盐、低温、干旱及ABA(脱落酸)处理时的转录特征

图2为植物表达载体pROK II-GmPHD6的部分结构示意图

图3为发根农杆菌介导转基因毛状根的建立

图4为GmPHD6基因在转基因毛状根中的表达量

图5为pZH01-GmPHD6-RNAi载体图

图6为过量表达GmPHD6和RNAi毛状根的耐盐性鉴定和相对生长率

图7为过量表达GmPHD6和其RNAi毛状根经4％PEG处理后的耐旱性鉴定

图8为过量表达GmPHD6和其RNAi毛状根经4％PEG处理后相对生长率

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

大豆科丰1号(Glycine max L.Merr.Kefeng 1)记载在W.K.Zhang，Y.J.Wang，G.Z.Luo，J.S.Zhang，C.Y.He，X.L.Wu，J.Y.Gai，S.Y.Chen，QTL mapping of tenagronomic traits on the soybean(Glycine max L.Merr.)genetic map and theirassociation with EST markers，Theor.Appl.Genet，2004，108：1131-1139中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；

大豆晋豆23(JD23)及旱敏盐敏品种灰布支(HBZ)均记载在Wei W，Huang J，HaoYJ，Zou HF，Wang HW，Zhao JY，Liu XY，Zhang WK，Ma B，Zhang JS and Chen SY(2009)Soybean GmPHD-Type Transcription Regulators Improve Stress Tolerance inTransgenic Arabidopsis Plants.PLoS ONE，4(9)，e7209.公众获得山西农科院经济作物所同意后可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；

pROKII载体(双元表达载体)记载在D.C.Baulcombe，G.R.Saunders，M.W.Bevan，M.A.Mayo and B.D.Harrison，Expression of biologically active viral satelliteRNA from the nuclear genome of transformed plants.Nature 321(1986)，pp.446-449中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；

发根农杆菌K599记载在Attila Kereszt，et al.，Agrobacteriumrhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology.NatureProtocols，2007，2(4)，549-552)中，公众可从Peter M Gressnon教授，The Universityof Queensland，St Lucia，Queensland 4072，Australia，获得，或经Peter M Gressnon教授同意(书面同意书)后由中科院遗传与发育生物学研究所获得。

实施例1、大豆GmPDH6及其编码基因的筛选及其cDNA的克隆

1、大豆GmPDH6及其编码基因的获得

以大豆抗旱品种晋豆23(JD23)和旱敏感品种灰布织(HBZ，由山西农科院经作所刘学义研究员提供)为材料，通过cDNA-AFLP的方法筛选得到60余个差异表达基因，其中有一个296bp片段，该片段经BLAST大豆EST数据库表明其为包含PHD结构域的锌指蛋白，在比对中发现在多个物种的旱、盐cDNA库中有该基因的同源序列。经在大豆EST数据库中比对得到6个该家族成员，分别命名为GmPHD1-6。其中基因GmPHD6具有序列表中序列1的核苷酸序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白。氨基酸序列分析表明，在序列表中序列2由248个氨基酸残基组成。

根据GmPHD6基因序列设计引物：

GmPHD6 sense：5‘-ATGGACAGTGGAGGACACTA-3’(序列3)，

GmPHD6 antisense：5‘-TCAAGGCCTTGGTCTCTTATT-3’(序列4)

应用RT-PCR方法，从大豆总RNA中扩增GmPHD6基因：取晋豆23(JD23)叶片，置于液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5μg总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20μl PCR反应体系为：1μl一链cDNA(0.05μg)、1μl引物(20μM)、2μl 10×PCR缓冲液、0.4μl dNTP(10mM)和1U Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20μl，液面覆盖液体石蜡油。反应在PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃变性5min；再94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30-32个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。得到约750bp的PCR产物，该PCR产物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物为747bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列，即为GmPHD6基因，其编码蛋白命名为GmPHD6。GmPHD6的氨基酸序列为序列表中的序列2。

将PCR产物克隆于pMD18-T质粒的多克隆位点，得到重组载体pMDGmPHD6，经测序，该载体为将序列表中的序列1***pMD 18-T质粒的多克隆位点得到的载体。

2、GmPHD6基因在非生物胁迫下的表达特征

对大豆耐旱耐盐品种晋豆23(JD23)及旱敏盐敏品种灰布支(HBZ)进行干旱、NaCl、ABA、冷害处理，用于分析大豆GmPHD6在非生物胁迫和脱落酸(ABA)处理下的转录特征。将晋豆23和灰布支的种子种在盆中，生长2星期后，对幼苗分别进行下述胁迫处理：

干旱处理：将大豆幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，分别在光照条件下干旱培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

盐处理：将大豆幼苗的根系置于200mM NaCl溶液中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

ABA处理：大豆幼苗的根系置于100μM ABA中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

低温处理：将小麦幼苗置于0℃培养箱中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

总RNA的提取同上述1。应用Real Time PCR分析GmPHD6基因在上述处理时的转录特征，所用引物同上述1。以大豆beta-tubulin为内参，内参的引物为

GmTubRL-1：TGGCCGCTACCTCACTGCCT

GmTubRL-2：TCGTCCATGCCTTCCCCGGT。

结果如图1所示，在高盐胁迫下，两种大豆中的GmPHD6基因均受到胁迫的诱导，前期灰布支中转录较高，而12小时时，晋豆23中的转录明显升高。干旱胁迫下，灰布支中GmPHD6转录在胁迫3小时时上升，至6小时回落，12小时再上升，而在晋豆23中，胁迫1至3小时，下降至6小时时明显升高，12小时升至最高。在两种大豆中GmPHD6转录均不受低温诱导。ABA处理下的转录，在灰布支中不受诱导，而在晋豆23中GmPHD6受到强烈诱导。上升结果表明GmPHD6可能参与植物对非生物胁迫的应答反应。

实施例2、GmPHD6蛋白的功能鉴定

一、GmPHD6转基因毛状根和GmPHD6-RNAi转基因毛状根的获得

1、发根农杆菌介导转基因根系方法的建立

发根农杆菌侵染法根据Attila Kereszt等方法(Attila Kereszt，et al.，Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of rootbiology，Nature Protocols，2007，2(4)，549-552)进行。

具体操作如下：

1)首先将含有GUS基因的pBI121(Datla RS，Hammerlindl JK，Panchuk B，PelcherLE.Keller W，Modified binary plant transformation vectors with the wild-typegene encoding NPTII，Gene.1992Dec 15；122(2)：383-4，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)，通过电击法导入发根农杆菌K599中，得到重组农杆菌。提取重组农杆菌的质粒，用PCR方法鉴定重组农杆菌中所含目的基因，所用引物为

正向：5‘-ATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3’

反向：5‘-AGCGGGTAGATATCACACTC-3’

扩增的片段为GUS基因的5‘端800bP区段，证明该质粒为pBI121，含有GUS基因，含有该质粒的重组农杆菌为阳性重组农杆菌，命名为K599/pBI121。

2)大豆科丰1号种子播种于蛭石中，待长出2片真叶待用。

3)在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基中划线活化K599/pBI121，挑单菌落在含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中摇菌过夜，得到K599/pBI121发根农杆菌菌液。

4)用步骤3)得到的发根农杆菌菌液，用注射器接种6天含两片真叶的步骤2)获得的大豆幼苗(见图3A，6天苗龄，在距离蛭石表面1-2cm处注射。)，保湿生长：光照16小时，温度25℃，湿度50％。2周后，长出毛状根(图3B)，可以用于转基因鉴定和胁迫实验。

当毛状根长度为5-10厘米时，剪去老根，新的毛状根即为转化的根，可进一步用于转基因鉴定。

将4根新的毛状根进行GUS染色，将毛状根直接放在下列染色液：50mM NaPO₄，pH7.2，2mM X-gluc，0.5mM K₃Fe(CN)₆，and 0.5mMK₄Fe(CN)₆中，37℃过夜，毛状根经系列浓度70、50、30％乙醇洗(脱色)，之后放在重蒸水中，观察，结果如图3C所示，可以看出，经GUS染色表明外源基因基因GUS已经在新长出的毛状根中表达，说明上述方法可将外源基因转化至毛状根中(含有pBI121)。上述新的毛状根为转基因毛状根。

因为pBI121载体中带有GUS基因，在建立毛状根的转化***时，应用GUS基因的表达有蓝色，容易检测，因此用的是pBI121载体。而在正式试验中，用NPTII标记较好，因此换成pROK II载体。

2、重组表达载体pROK II-GmPHD6的构建

提取大豆抗旱品种晋豆23(JD23)的RNA，反转录得到cDNA，以Primer-F+和Primer-R-作为引物进行PCR扩增，得到747bpPCR产物，用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切得到的PCR产物，回收酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体pROK II得到的载体骨架连接，得到连接产物。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将序列表中的序列1的核苷酸***pROK II的BamH I和Kpn I酶切位点之间得到的载体，将该载体命名为pROK II-GmPHD6，且序列表中的序列1位于CaMV 35S启动子之后。重组表达载体pROK II-GmPHD6部分结构示意图如图2所示。

Primer-F+：GAGGGATCCATGGACAGTGGAGGACACTA(序列5)

Primer-R-：GAGGGTACCTCAAGGCCTTGGTCTCTTATT(序列6)

3、过量表达GmPHD6基因毛状根的获得

1)重组农杆菌的获得

将上述2得到的重组表达载体pROK II-GmPHD6，通过电击法导入转化发根农杆菌K599，得到重组农杆菌。

提取重组农杆菌的质粒，送去测序，结果为该质粒为pROK II-GmPHD6，将含有该质粒的重组农杆菌命名为K599/pROK II-GmPHD6。

2)转GmPHD6毛状根根系的获得

用注射器将重组农杆菌K599/pROK II-GmPHD6接种生长6天含两片真叶的大豆科丰1号幼苗，具体方法见上述1的步骤4)，保湿生长：光照16小时，温度25℃，湿度50％。2周后，长出毛状根即为转化的毛状根，共获得80个转GmPHD6毛状根根系，可进一步作转基因鉴定和耐逆性检测。

以相同的方法将空载体pROK II转入大豆科丰1号幼苗，得到80个转空载体毛状根根系，以作为实验对照。

3)转GmPHD6毛状根根系的鉴定

分别取80个转GmPHD6毛状根和80个转空载体毛状根(对照)，提取总RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，用Primer-F和Primer-R进行GmPHD6基因表达量分析。Real-Time PCR反应使用TOYOBO公司的RealTime PCR Master Mix试剂盒，并按照说明进行操作。GmPHD6基因表达量检测所用引物为Primer-F和Primer-R；大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-TF和Primer-TR。实验重复三次。结果取平均值±标准差。

Primer-F：5’-ATGGACAGTGGAGGACACTA-3’(序列3)

Primer-R：5’-GGAACTTCTTCAGCAGGCAA-3’(序列7)

Primer-TF：5’-TGGCCGCTACCTCACTGCCT-3’

Primer-TR：5’-TCGTCCATGCCTTCCCCGGT-3’

结果如图4B所示，其中，GmPHD6为转GmPHD6毛状根，对照为转空载体毛状根，从图中看出，转GmPHD6毛状根中GmPHD6的相对表达量为38.5±2；转空载体毛状根中检测出的GmPHD6的相对表达量是大豆原有的GmWRKY78的表达，为3.0±0.1。

在80个转基因毛状根中有75个的GmPHD6基因的表达高于对照30倍以上，因此将此75个视为转基因毛状根，5个为非转基因，共得到75个经检测鉴定的转GmPHD6基因毛状根，即GmPHD6在转GmPHD6毛状根中过表达。

4、GmPHD6-RNAi转基因毛状根的获得

1)重组载体pZH01-GmPHD6-RNAi的获得

以由实施例1得到的载体pMDGmPHD6为模板，根据序列1的自5’末端第1位至509位核苷酸设计引物G6RNAi L和G6RNAi R，得到500bp的PCR产物(序列1的自5’末端第1位至509位核苷酸)，然后进行RNAi载体pZH01(Han Xiao，et al.Functionalanalysis of the rice AP3 homologue OsMADS16 by RNA interference，PlantMolecular Biology，2003，52，957-966，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)的链接。第一链用Sac I和Kpn I双酶切链接，然后使用Xba I和Sal I双酶切将反链连接到第一链阳性克隆上。获得反向***的含GmPHD6-RNAi的植物表达载体pZH01-GmPHD6-RNAi，经过测序，pZH0-GmPHD6-RNAi含有序列1的自5’末端第1位至509位核苷酸，具体结构示意图如图5所示。)。

克隆引物为：

G6RNAi L：GAGTCTAGAGAGCTCATGGACAGTGGAGGACACTA(序列9)

G6RNAi R：GAGGTCGACGGTACCTTTGGGGGTTCAGATCCTCG(序列10)

2)GmPHD6-RNAi转基因毛状根的获得

与上述3的步骤1)-2)方法相同，将pZH01-GmPHD6-RNAi通过发根农杆菌K599转入大豆科丰1号幼苗中，得到GmPHD6-RNAi转基因毛状根。

以相同的方法将K599转入大豆科丰1号幼苗，得到未转基因的毛状根(对照K599)作为对照。

提取GmPHD6-RNAi转基因毛状根的总RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，用G6-RNAi-检测L和G6-RNAi-检测R进行PCR扩增，以未转基因的毛状根作为对照。

检测引物为：

G6-RNAi-检测L：ATGGACAGTGGAGGACACTA

G6-RNAi-检测R：AGGCCTTGGTCTCTTATTGC

大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-TF和Primer-TR。

结果如图4A所示，为对照K599和GmPHD6-RNAi转基因毛状根中GmPHD6的表达水平，GmPHD6-RNAi转基因毛状根中几乎检测不到GmPHD6的表达，而对照中因为有本底的GmPHD6，因此显示了GmPHD6基因的表达。此结果表明GmPHD6-RNAi转基因毛状根中，GmPHD6几乎不表达。

二、转GmPHD6基因毛状根的耐盐和耐旱性鉴定

实验样本为由上述获得的转空载体毛状根、经检测鉴定的转GmPHD6基因毛状根(本实验中简称为转GmPHD6基因毛状根(GmPHD6))和GmPHD6-RNAi转基因毛状根(G6RNAi)。

1、耐盐性鉴定

将转空载体毛状根(对照)、转GmPHD6基因毛状根(GmPHD6)及GmPHD6-RNAi转基因毛状根(G6RNAi)各取20个经100mM NaCl水溶液处理3天，即浸入100mM NaCl溶液中3天，25℃。实验重复三次，结果取平均值±标准差。以水培(水中正常生长)为对照(每种根系各10个)。

处理3天后，拍照观察，结果如图6A所示，过量表达GmPHD6和RNAi毛状根的耐盐性鉴定，水处理6天(正常条件)转空载体毛状根(对照)和转GmPHD6基因毛状根(GmPHD6)、GmPHD6-RNAi转基因毛状根(G6RNAi)无显著差异，经100mM NaCl处理3天的转空载体毛状根(对照)和转GmPHD6基因毛状根(GmPHD6)的表型，可以看出，在100mM NaCl处理下，之间有显著差异，测量具体如下：测量各组根系，先计算每一根毛状根的增长率＝(处理后根长-处理前根长)/处理前根长，然后取平均值±标准差；

将增长率作图如图6B所示，为过量表达GmPHD6和RNAi毛状根的耐盐的相对生长率，经100mM NaCl水溶液处理转GmPHD6基因毛状根(GmPHD6)的长度增长率为16±8％。而经100mM NaCl水溶液处理转空载体毛状根(对照)的长度增长率为7±5％，GmPHD6-RNAi转基因毛状根(G6RNAi)的长度增长率为2.5±2.3％，之间均有显著差异。说明转GmPHD6基因毛状根比转空载体毛状根耐盐。

2、耐旱性鉴定

将转空载体毛状根(对照)、转GmPHD6基因毛状根(GmPHD6)及GmPHD6-RNAi转基因毛状根(GmPHD6-RNAi)分别浸入4％(体积百分含量)PEG(聚乙二醇6000)处理3天，25℃，以水中正常生长为对照。PEG处理的毛状根各为8个。实验重复三次，结果取平均值。

处理3天后，拍照观察，结果如图7所示，水培时，转空载体毛状根(对照)、GmPHD6-RNAi转基因毛状根(G6RNAi)和转GmPHD6基因毛状根(GmPHD6)的生长无明显差异，

而经4％PEG处理后，之间有显著差异，具体测量和计算毛状根长度增长率的公式同上述1，结果如图8所示。

从图8中看出，过表达GmPHD6毛状根(转GmPHD6基因毛状根)的增长率为53±9％，而转空载体毛状根的增长率约为17±5％，GmPHD6-RNAi转基因毛状根(G6RNAi)增长率仅约为5±3％。

GmPHD6的过表达显著增加了转基因毛状根的耐旱性。

上述过量表达GmPHD6基因的毛状根，GmPHD6-RNAi转基因毛状根和转空载体毛状根的耐逆性鉴定表明，GmPHD6与植物耐非生物胁迫相关，GmPHD6在大豆中的过量表达增加了转基因大豆的耐盐和耐旱性状。GmPHD6基因可作为提高植物耐非生物胁迫基因工程的目的基因。

Claims

1.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质在培育耐逆性植物中的应用；

所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为大豆。

4.序列表中序列1所示的DNA分子在培育耐逆性植物中的应用；

所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为大豆。