CN102712929B - 植物根特异表达启动子的鉴定和应用 - Google Patents

Abstract

一种分离的DNA，其具有SEQ ID NO：1所示的序列或类似序列，该DNA能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部特异转录和/或表达。还提供包含该DNA的表达盒和转基因植物。

Description

植物根特异表达启动子的鉴定和应用

技术领域

本发明属于植物转基因育种领域，具体而言，本发明涉及分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部特异转录和/或表达。另外，本发明还涉及包含该DNA的表达盒和植物等，并涉及该DNA的应用。

背景技术

尽管许多植物（如，水稻，尤其是Oryza sativa.japonica等）的基因组序列已经被揭示（如可参见GenBank登录号AP003843.3、GenBank登录号AP004670.4等），但是大量基因组序列的功能仍旧未知。另外，美国专利申请US2006075523A1公开了来自水稻和其他植物的非生物性胁迫应答相关的多肽和多核苷酸，其中多核苷酸序列SEQ ID NO：15442长达2000个核苷酸，并且该序列淹没在该文献公开的众多序列中而未被指定特定功能；而美国专利US7365185B2公开了来自水稻和其他植物的基因组启动子序列，但是其中多核苷酸序列SEQ ID NO：68961长达2760个核苷酸，并且该序列淹没在该文献公开的众多序列中而未被指定特定功能，更不清楚其是否具有植物体表达部位的特异性。

外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型的强启动子，比如CaMV 35S启动子和玉米Ubiquitin-1启动子，然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间（发育阶段特异性）或空间（组织器官特异性）不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。

此外,在研究某些代谢过程或调节途径时，常常需要将同一途径上的两个以上的基因转化到同一个株系中去，采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个基因，或者两个基因分别转化完成后再进行杂交，都需要等待较长的时间，为了提高效率缩短多个基因转化的时间，最近有报道可以利用新的载体同时进行多个基因的转化，但是在多基因转化时如果重复使用同一个启动子，也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。

根是植物体吸收水分和营养物质的重要器官, 根特异表达***可用于研究植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。尽管中国专利申请CN1196753A、CN1791677A、CN101389762A和CN101589144A等文献公开了一系列根特异性启动子，但是这些启动子序列结构各异，无法预期得到新的根特异性启动子。

为此，本发明人经过长期研究，令人惊讶地发现了一种新的根特异性启动子，其不但相对于美国专利US7365185B2等文献公开的序列更短并且确认了具有根特异性启动子的功能，而且在双子叶和单子叶植物中的各个发育阶段能保持这一功能，极大地拓宽了其使用的范围。

发明内容

发明概述

本发明提供了新的分离的DNA，其具有根特异性启动子的功能。另外，本发明还涉及包含该DNA的表达盒和转基因植物等，并涉及该DNA的应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部特异转录和/或表达，所述分离的DNA的序列选自下列组的序列：

（a）具有SEQ ID NO：1所示的序列；

（b）在严格条件下能够与（a）所述序列的DNA杂交的DNA序列；

（c）与（a）所述序列有至少90%（优选为至少95%）序列同一性的DNA序列；

（d）包含SEQ ID NO：1中至少150个（优选为至少200个）连续核苷酸的DNA序列；和

（e）与（a）-（d）之任一所述序列互补的DNA序列。

优选本发明第一方面的DNA，其序列长度小于2000个核苷酸，优选小于1500个核苷酸，更优选小于1200个核苷酸。

 优选本发明第一方面的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部中柱鞘中特异转录和/或表达。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明第一方面的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

在第二方面，本发明提供了表达盒，其包含：

（a）本发明第一方面的DNA；和

（b）核酸，其可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游。

优选本发明第二方面的表达盒，其中所述核酸能够赋予植物选自下列组的性状：

（a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高； 

（b）所述核酸所编码的抑制性RNA含量的提高；

（c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

（d）抗植物病虫害能力的提高，尤其是抗发生在植物根部病虫害能力的提高；

（e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

（f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

在第三方面，本发明提供了用本发明第二方面的表达盒转化的转基因的植物、植物种子、植物组织或植物细胞，优选其中，本发明第一方面的DNA能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部特异转录和/或表达。

优选本发明第三方面的植物、植物种子、植物组织或植物细胞，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，如，玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、大豆、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甘蔗、甜菜、烟草或拟南芥，优选是水稻。

在第四方面，本发明提供了本发明第三方面的植物的生产方法，其包括：

（1）构建本发明第二方面的表达盒；

（2）将步骤（1）获得的表达盒导入植物细胞；

（3）再生出转基因植物；和

（4）选择出转基因植物，其中本发明第一方面的DNA能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部特异转录和/或表达；并且

（5）任选地，增殖步骤（4）获得的植物以获得后代。

在第五方面，本发明还提供了赋予植物性状的方法，其包括

（1）选择能够赋予植物性状的核酸：

（2）使用步骤（1）获得的核酸构建本发明第二方面的表达盒；

（3）将步骤（2）获得的表达盒导入植物细胞；

（4）再生出转基因植物；和

（5）选择出赋予了植物性状的转基因植物；并且

（6）任选地，增殖步骤（5）获得的植物以获得后代，

       其中，所述性状选自下列组：

（a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高； 

（b）所述核酸所编码的抑制性RNA含量的提高；

（c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

（d）抗植物病虫害能力的提高，尤其是抗发生在植物根部病虫害能力的提高；

（e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

（f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

附图说明

图1是表达载体pHPG的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表示潮霉素抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白（β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase））基因；T35s表示35s基因的终止子；HindIII和 BamHI分别表示限制性内切酶HindIII和 BamHI的酶切位点；根特异启动子即为本发明的分离的根特异表达启动子。

图2是KT630P转基因水稻的组织、器官的GUS染色。其中，A为水稻幼苗期植株体；B为转基因抗性愈伤组织；C为苗期叶片；D为苗期的茎；E为苗期的根；F为水稻花器官。

 图3是本发明KT630P启动子驱动的GUS基因在转基因水稻各组织器官中的表达的RT-PCR检测结果。

图4是KT630P转基因拟南芥植株的GUS染色。其中，A为拟南芥幼苗期植株体；B为拟南芥抽苔前植株体；C为拟南芥开花期植株体；D为体式镜观察的根部GUS染色情况。

发明详述

在第一方面，本发明提供了分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部特异转录和/或表达，尤其是其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部中柱鞘中特异转录和/或表达。

在本文中，这种分离的DNA也可以被称为根特异性启动子，属于顺式作用元件。在根特异性启动子的驱动下，其下游并与其可操作地连接的基因的表达往往只限于根这一器官或其组织部位，并表现发育调节等特性。根特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物主要在植物根部或其组织部位积累，例如在根部或其组织中产生的下游的核酸mRNA的量是其他植物体部位的5倍、10倍、100倍、200倍、甚至1000倍，增加区域表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费。在本发明的具体实施方式中，通过肉眼可观测的染色法直接判别本发明的根特异性启动子在植物根部指导转录和/或表达，而且该调控持续在植物发育的各个阶段，而在植物的其他部位，没有肉眼可明显分辨的转录和/或表达。

在本文中，术语“可操作地连接”指的是一种连接方式，该方式使得连接在下游的核酸的转录和/或表达由本发明的根特异性启动子启始并调控。通常，可操作地连接的核酸是连续的。下游的核酸在保持读框的情况下可以间隔少量核苷酸而连接在根特异性启动子的下游，接受其调控。

在本文中，术语“分离的”DNA指的是DNA从其天然的环境（如，植物细胞的基因组）中被分离出来了，或者被化学合成或重组表达出来，并且DNA不含或者基本不含其来源物种的其他核酸、细胞和培养基。本发明的分离的DNA具有较短的核酸序列，优选序列长度小于2000个核苷酸，优选小于1500个核苷酸，更优选小于1200个核苷酸。在本发明的具体实施方式中，本发明的分离的DNA是具有1000个核苷酸的SEQ ID NO：1所示的序列。

本发明的分离的DNA还包括具有SEQ ID NO：1所示的序列的DNA的功能等价体，即具有SEQ ID NO：1的变体序列的DNA，其仍旧能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部特异转录和/或表达的SEQ ID NO：1所示的序列。变体序列包括在严格条件下能够与具有SEQ ID NO：1所示的序列的DNA杂交的DNA序列。本文中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES（pH6.4）和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12-16小时，然后在65℃下用含0.1SDS、和0.1%SSC的洗涤液洗涤15-60分钟。

变体序列还包括与SEQ ID NO：1所示序列有至少90%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的DNA序列。其中，序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

变体序列还包括能够保持根特异性启动子功能的SEQ ID NO：1所示的序列的片段，例如SEQ ID NO：1中至少150个、200个、300个、500个、800个、直至999个连续核苷酸的DNA序列。

在第二方面，本发明提供了表达盒，其包含：

       （a）本发明第一方面的DNA；和

（b）核酸，其可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游。

本发明的表达盒在5’-3’的转录方向上包含本发明第一方面的DNA、可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸、任选的转录和翻译的终止区（如，转录终止元件或多聚腺苷酸化信号）。本发明的表达盒还可以包括，在细菌中复制所需的复制起点（例如，来自pBR322或P15A ori的ORI区），土壤杆菌T-DNA转移所需要的元件（例如，T-DNA的左边界和/或右边界）。本发明表达盒可以包含的其他成分包括，增强子、内含子、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结合位点等。示例性的增强子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米矮缩I基因、TMV Ω元件和酵母的启动子的增强子元件。也可以采用病毒前导序列来作为具有增强子效用的远见，如来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列等。示例性的植物内含子包括来自Adh 1、bronze 1、肌动蛋白1、肌动蛋白2的内含子、以及蔗糖合酶内含子。 

在本文中，可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸编码异元蛋白的多核苷酸、编码融合蛋白的多核苷酸、反义序列、编码dsRNA序列的多核苷酸，等等。优选是能够赋予植物（尤其是植物根部）有益的性状的核酸，所述性状包括：

（a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高； 

（b）所述核酸所编码的抑制性RNA含量的提高；

（c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

（d）抗植物病虫害能力的提高，尤其是抗发生在植物根部病虫害能力的提高；

（e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

（f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

相应地，可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸可以编码蛋白的基因，如昆虫抗性基因、细菌疾病抗性基因、真菌疾病抗性基因、病毒疾病抗性基因、线虫疾病抗性基因、除草剂抗性基因、影响谷粒组成或品质的基因、养分利用基因、真菌毒素减少基因、雄性不育基因、可选择标记物基因、可筛选标记物基因、阴性可选择标记物基因、阳性可选择标记物基因、影响植物农学特征(如产率)的基因、环境胁迫抗性基因(例如，赋予对干旱、热、寒冷、冷冻、过湿、盐胁迫或氧化胁迫的抗性或耐性的基因)、改善淀粉特性或数量、油品数量或品质、氨基酸或蛋白质组成的基因，等等。另外，可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸也可以编码dsRNA、反义RNA、siRNA、miRNA，其与不利的多核苷酸（如，需要下调表达的植物启动子，寄生植物体生物存活、生长或繁殖所必须的植物基因）互补并导致这些多核苷酸的下调。

本发明的表达盒可被***质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被***被转化的植物细胞的基因组中。***可以是定位的或随机的***。优选地，***通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被***植物细胞核的染色体DNA中。

在第三方面，本发明提供了用本发明第二方面的表达盒转化的转基因的植物、植物种子、植物组织或植物细胞。

本发明的具体实施方式已经通过在两个有代表性的单子叶植物和双子叶植物中的有效应用证明了本发明的根特异性启动子的植物使用范围，因此本发明的根特异性启动子可用于转化任何植物物种，包括单子叶植物和双子叶植物，例如来自以下属的植物：苜蓿属、番茄属、芸苔属、香瓜属、茄属、核桃属、棉属、苹果属、葡萄属、金鱼草属、杨属、草莓属、拟南芥属、云杉属、辣椒属、藜属、菊属、牵牛属、松属、豌豆属、稻属、玉蜀黍属、小麦属、小黑麦属、黑麦属、黑麦草属、大麦属、大豆属、黄杉属、伽蓝菜属、甜菜属、向日葵属、烟草属、南瓜属、蔷薇属、草莓属、百脉根属、驴食草属、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、橘属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡芦巴属、萝卜属、白芥属、颠茄属、曼陀罗属、天仙子属、烟草属、碧冬茄属、毛地黄属、菊苣属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、萱草属、水仙属、天竺葵属、稷属、狼尾草属、毛莨属、千里光属、喇叭舌属、蓝英花属、菜豆属、燕麦属和葱属，优选的植物包括玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、大豆、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甘蔗、甜菜、烟草或拟南芥，更优选是水稻。

在第四方面，本发明提供了本发明第三方面的植物的生产方法，其包括：

（1）构建本发明第二方面的表达盒；

（2）将步骤（1）获得的表达盒导入植物细胞；

（3）再生出转基因植物；和

（4）选择出转基因植物，其中本发明第一方面的DNA能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部特异转录和/或表达；并且

（5）任选地，增殖步骤（4）获得的植物以获得后代。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射，等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术（可参见Horsch RB等(1985)Science 225：1229；White FF，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization， Academic Press，1993，pp.15-38；Jenes B等.Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization， Academic Press，1993，pp.128-143，等）。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被***落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。

在第五方面，本发明还提供了赋予植物性状的方法，其包括

（1）选择能够赋予植物性状的核酸：

（2）使用步骤（1）获得的核酸构建本发明第二方面的表达盒；

（3）将步骤（2）获得的表达盒导入植物细胞；

（4）再生出转基因植物；和

（5）选择出赋予了植物性状的转基因植物；并且

（6）任选地，增殖步骤（5）获得的植物以获得后代，

       其中，所述性状选自下列组：

（a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高； 

（b）所述核酸所编码的抑制性RNA含量的提高；

（c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

（d）抗植物病虫害能力的提高，尤其是抗发生在植物根部病虫害能力的提高；

（e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

（f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

在本文中，“选择”可以是田间或温室选择，也可以是使用遗传标记的遗传选择。在本文中，“增殖”可以有性繁殖，也可以是无性繁殖。在有性繁殖中，显然可以进行额外的杂交步骤，并选择出继承了转基因性状的后代。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的了。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-T1连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4 DNA连接酶购自Promega公司，方法均参照试剂盒提供商推荐的方法进行。实验中所用的载体pCAMBIA1303可购自于CAMBIA公司。

实施例1．启动子KT630P的分离和鉴定

设计如下克隆启动子KT630P所需引物：

引物1：5'- CCCaagcttGCTATATGTGTACGTGATAGTATAT -3'

引物2：5'- CGggatccTTAATTTGCTCTTGTATTAGCTCTA-3'

引物1中序列aagctt为HindIII的酶切位点,引物2中序列ggatcc为BamHI的酶切位点。

利用启动子的正反向引物（其中带下划线部分的序列为启动子序列），以植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取的水稻(中花11)基因组DNA作为模板，进行扩增，反应条件是： 95℃预变性5分钟；94℃变性30秒； 55℃退火30秒；72℃延伸1分钟；30个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T1载体，筛选阳性克隆并进行测序验证。结果表明，所扩增序列为我们预期的KT630P启动子序列，其序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2．表达载体的构建

将测序验证已经***KT630P启动子序列的pEASY-T1质粒用HindIII和 BamHI 双酶切，连入同样用HindIII和 BamHI 双酶切的载体pHPG中，挑取菌落进行PCR检测，选取PCR结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pHPG-KT630P。其中，菌落PCR检测所需引物为pHPG载体上引物，位于所克隆的启动子片段两侧，扩增片段约为启动子的长度，以菌液为模板，扩增检测，PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸1分钟；34个循环；72℃延伸10分钟。

所构建的表达载体的T-DNA区的图谱如图1所示，其中：LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表示潮霉素抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白（β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase））基因；T35S表示35S基因的终止子；HindIII和 BamHI分别表示内切HindIII和 BamHI的酶切位点；根特异启动子即为实施例1获得的KT630P启动子。

实施例3．植物转化和功能鉴定

利用热激法将质粒pHPG-KT630P转入农杆菌AGL0菌株，利用农杆菌介导法对水稻进行共转化，同时利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥植株。从转基因植株中分离各组织器官，进行GUS活性检测，将各组织器官置于含有GUS染色缓冲液的离心管中，放于37℃温箱温育过夜，然后室温条件下在无水乙醇中脱色保存。

3.1 转基因水稻苗的组织器官染色

将转化KT630P启动子得到的具有潮霉素抗性的水稻愈伤组织，进行GUS染色实验，结果如图2B所示，抗性愈伤组织中没有显示出肉眼可观测到的蓝色，表明在该组织中基本没有GUS基因的表达。

将转化KT630P启动子的转基因水稻的组织器官，即叶片、茎、根和花分别进行GUS染色。结果分别如图2C、图2D、图2E和图2F所示，GUS基因只在转基因水稻苗的根系中有很强的表达，显现出肉眼可明显观测到的很强的蓝色；而在其它各器官（叶片、茎、和花）中，基本没有检测到GUS基因的表达。另外，取完整的转基因水稻苗进行GUS染色，结果如图2A所示，通过明显的颜色对比可以发现，只有根部显示出肉眼可明显观测到的很强的蓝色，而其他器官部位都没有肉眼可识别的明显蓝色。这表明，本发明的启动子能够在转基因植株根中指导其下游的GUS蛋白表达，而且这种表达具有根部的特异性；而且，无论在苗期还是花期，多个发育阶段均表现出这种表达具有根部的特异性。

3.2  转基因水稻的RT-PCR表达分析

取KT630P转基因水稻植株纯系的根、茎、叶和花器官，提取RNA，反转录为cDNA作为模板，以水稻ACTIN基因作为内参照，分析KT630P启动子驱动的GUS报告基因在转基因水稻中的表达情况。

RT-PCR的检测引物是：

引物3：5'- TAATGTTCTGCGACGCTCAC -3'

引物4：5'- CGGCGAAATTCCATACCTG -3'

引物5：5'- TGTTCCTGCCATGTATGT -3'

引物6：5'- ATGTCCCTCACAATTTCC -3'

其中，引物3和引物4是GUS基因的检测引物，其扩增片段大小为321bp；引物5和引物6是水稻内参基因ACTIN的分析引物，其扩增片段大小为252bp。PCR检测体系和程序是：

10×buffer          2μL

10mM dNTP             0.4μL

10 mM引物3（对照分析使用10 mM引物5）           0.4μL

10 mM引物4（对照分析使用10 mM引物6）           0.4μL

Taq polymerase    0.4μL

cDNA                        1μL

ddH2O                      15.4μL

PCR反应条件：95℃，预变性5分钟；94℃，变性30秒；55℃，退火30秒；72℃，延伸25秒；28个循环，72℃，10分钟。

反应结束后，对PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR检测结果如图3所示，对照分析中所有ACTIN内参照的表达在根、茎、叶和花等器官中都被检测出来了，没有明显差异；而对于GUS基因的表达，在根、茎、叶和花等器官中，只在根组织中检测到了GUS基因的表达。这再一次表明，本发明的启动子能够在转基因植株根中指导其下游的异源蛋白表达，而且这种表达具有根部的特异性；而且，无论在苗期还是花期，多个发育阶段均表现出这种表达具有根部的特异性。

3.3 转基因拟南芥的组织器官染色

将KT630P启动子转化拟南芥所得的阳性苗及其各发育阶段的植株体，整棵进行GUS染色。结果如图4A、图4B和图4C所示，在转基因拟南芥的各个发育阶段，报告基因GUS都只在植物根部表现出很强的表达，而在其它组织器官中的染色程度均处于肉眼不可见水平。这再一次表明，对于多种植物，即使是异源植物，本发明的启动子也能够在各个发育阶段的转基因植株根中指导其下游的异源蛋白表达，而且这种表达具有根部的特异性。

用体式镜观察KT630P转基因拟南芥的根系染色情况，发现结果如图4D所示，GUS基因只在根系的中柱鞘中表达。这表明，本发明的启动子指导的表达具有根中柱鞘表达特异性。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  北京未名凯拓作物设计中心有限公司

 

<120>  植物根特异表达启动子的鉴定和应用

 

<130> 

 

<150>  CN201010547550.7

<151>  2010-11-16

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1001

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

 

<400>  1

gctatatgtg tacgtgatag tatatttaac aatgaatcaa atgatatgaa aataataaat     60

 

aattacttaa atattttgaa taagacgaat ggtcaaacac gtactaaaaa gtcaacggtg    120

 

tcaaacattt tgaaacggaa ggagtatatt cttttaactt tgtaatagtt atatataatt    180

 

gttcgtacct cgagtagtta tcataaaact attcaactat tcagaaaaaa aagagtacat    240

 

cttacgggag aaggccagcc aaaattagta catctcatgg tggatgccaa caatcaacaa    300

 

aacctaccaa tccacacatt attacacctg aaaacgatct ctagctctga ttaatttcaa    360

 

acttcgatta tggactagtc aacacttcct aatagcagtg aactttgatt tggccatatg    420

 

aatactccca actttcatac cgaaaatttt atcttcaaac tatgaattct aaggatattc    480

 

ccttttaggc cgatcactag ttcccctttt tatttgcaga gaggaaacat gcaaatttga    540

 

tatagaaata tacaaggggg aagcatacat atgatgccta tctgccatcc caggtacatg    600

 

cctatctgcc aaaacaatca actaacctac caagtaccaa tcctcccata attgaacagc    660

 

tggaccagga aaaatcatca tctgtgtaca tcttaattga ccatattcat gcaagctctg    720

 

atcaagttgt gcaatgtcag tattatatta ctaagttagt agctagttag ttaaatatca    780

 

gtctaataaa tgtctaatca gagctgttag taggaaagag taggtcacca atctctcaaa    840

 

gacttataca agctagattc catcaccaca ctatataaac acacacacac ctgaacacca    900

 

gtcacacaac caaatcaagc tcagcttaat caatcacctc atcacacact cttagctaag    960

 

ctaagctaag ctaagctaga gctaatacaa gagcaaatta a                       1001

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成引物

 

<400>  2

taatgttctg cgacgctcac                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成引物

 

<400>  3

cggcgaaatt ccatacctg                                                  19

 

 

<210>  4

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成引物

 

<400>  4

tgttcctgcc atgtatgt                                                   18

 

 

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成引物

 

<400>  5

atgtccctca caatttcc                                                   18

Claims (3)

1.分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部特异转录和/或表达，所述分离的DNA的序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

2.表达盒，其包含：

（a）权利要求1所述的DNA；和

（b）核酸，其可操作地连接在权利要求1所述的DNA的下游。

3.用权利要求2所述的表达盒转化的转基因水稻的生产方法，其包括：

（1）构建权利要求2所述的表达盒；

（2）将步骤（1）获得的表达盒导入水稻细胞；

（3）再生出转基因水稻；和

（4）选择出转基因水稻，其中权利要求1所述的DNA能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部特异转录和/或表达；并且

（5）任选地，增殖步骤（4）获得的水稻以获得后代。

Images