CN104232709A

CN104232709A - 一种发酵生产安普霉素的方法

Info

Publication number: CN104232709A
Application number: CN201410512424.6A
Authority: CN
Inventors: 李可乐; 刘聪洁; 袁昉; 王绘砖; 李敏
Original assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2014-09-28
Filing date: 2014-09-28
Publication date: 2014-12-24

Abstract

本发明公开了一种微生物发酵生产安普霉素的方法，该方法包括斜面培养、种子液培养、发酵培养的过程，操作简单，在发酵培养的过程中补加了玉米浆，从而大幅提高了安普霉素的发酵单位。所述方法制备安普霉素的发酵单位能达到8400U/mL。

Description

一种发酵生产安普霉素的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产安普霉素的方法。

背景技术

安普霉素是一种氨基糖苷类抗生素，较为特别的是，其化学结构中含有辛二糖结构。安普霉素具有抗菌谱广、作用强、残留少、毒性低、不易产生耐药性等特点，广泛应用于大肠杆菌、沙门氏菌和支原体引起的感染。作为药物型饲料添加剂，安普霉素能明显促进增重和提高饲料转化率，在畜禽养殖领域得到了广泛的应用。

安普霉素由黑暗链霉菌发酵产生，目前对微生物发酵法生产安普霉素的研究主要是菌种的诱变处理、发酵培养基的优化，或者发酵工艺的优化，并没有取得很好的效果。2002年田威在《安普霉素产生菌的研究》中利用诱变处理、发酵工艺优化，在4m³发酵罐上发酵最高效价达到5390U/mL。1997年熊宗贵在《尼拉霉素单组份安普霉素高产菌株的研究》中利用均匀设计方法优化使得摇瓶效价达到6800μg/mL。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵生产安普霉素的方法，该方法能大幅提高安普霉素的发酵单位，发酵生产安普霉素的发酵单位最高能达到8400U/mL。

为了实现本发明所述目的，发明人提供了以下技术方案。

一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

a.斜面培养：将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，每支斜面的砂土孢子接种量为0.003-0.005g，在温度37.0±1℃、湿度30-60％的条件下培养120-144h，得到斜面孢子；

b.种子液培养：将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，斜面孢子的接种量为1-4cm²，种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1℃、湿度30-60％、转速180-200rpm的条件下培养20-24h，得到种子液；

c.发酵培养：将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中，种子液的接种量为发酵培养基体积的5％，在温度37.0±1℃、湿度30-60％、转速200-220rpm的条件下培养40-48h，随后加入玉米浆继续培养80-96h，即得到含有安普霉素的发酵液。

所述步骤a中，斜面培养基按质量百分比的组成为：玉米淀粉2.0％-2.5％、硝酸钾0.1％-0.2％、硫酸镁0.025％-0.05％、氯化钠0.04％-0.06％、磷酸二氢钾0.04％-0.06％、酵母粉0.1％-0.2％、碳酸钙0.1％-0.3％、琼脂2.0％-2.5％。砂土孢子在斜面培养基上培养后，斜面上的孢子丰满，颜色均匀一致，孢子层厚。

所述步骤a中，湿度为40-50％，培养的时间为140h。此步骤所选择的条件的好处同上一段所述的斜面培养基的好处。

所述步骤b中，种瓶培养基按质量百分比的组成为：葡萄糖2.0％-2.5％、玉米淀粉1.5％-2.0％、低温黄豆饼粉2.0％-3.0％、碳酸钙0.2％-0.4％、硫酸镁0.05％-0.1％、酵母粉0.1％-0.3％、硫酸铵0.1％-0.15％、玉米浆1％-2％。斜面孢子接种于种瓶培养基中，培养完成后镜检菌丝粗壮、交织成网状，达到优良种子液标准。

所述步骤b中，湿度为40-50％，转速为180rpm，培养的时间为22h。此步骤所选择的条件的好处同上一段所述的种瓶培养基的好处。

所述步骤c中，发酵培养基按质量百分比的组成为：低温黄豆饼粉3.0％-4.0％、玉米淀粉5.0％-7.0％、碳酸钙0.4％-0.5％、磷酸二氢钾0.1％-0.2％、氯化铵0.6％-0.7％、硫酸锌0.02％-0.03％、硫酸镁0.05％-0.1％、淀粉酶0.1％-0.15％。发酵培养基的好处需要和玉米浆的添加的好处结合一起考虑，玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、氨基酸、维生素等成分，是抗生素发酵中十分重要的有机氮源。

所述步骤c中，湿度为40-50％，转速为220rpm，培养45h后，加入玉米浆后继续培养90h。

所述步骤c中，玉米浆的加入量为发酵液体积的0.5％-1.0％。

所述玉米浆的加入量为发酵液体积的0.7％。

本发明所述发酵生产安普霉素的方法，通过在发酵摇瓶培养过程中加入玉米浆，使得安普霉素发酵单位大幅度提高。有文献报道在发酵过程中添加氨基酸能够促进安普霉素的产量，玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、氨基酸、维生素等成分，是抗生素发酵中十分重要的有机氮源。此发明在发酵过程中添加玉米浆，使发酵单位显著提高。具体是在发酵培养45h，加入玉米浆后继续培养90h，培养完成后最高发酵效价达到8400U/mL。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。

实施例1

斜面培养基按质量百分比的组成为：玉米淀粉2.3％、硝酸钾0.2％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、酵母粉0.2％、碳酸钙0.3％、琼脂2.5％。

种瓶培养基按质量百分比的组成为：葡萄糖2.0％、玉米淀粉2.0％、低温黄豆饼粉2.5％、碳酸钙0.3％、硫酸镁0.1％、酵母粉0.2％、硫酸铵0.15％、玉米浆2％。

发酵培养基按质量百分比的组成为：低温黄豆饼粉4.0％、玉米淀粉6.0％、碳酸钙0.5％、磷酸二氢钾0.2％、氯化铵0.6％、硫酸锌0.03％、硫酸镁0.1％、淀粉酶0.15％。

a.斜面培养：将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，砂土孢子的接种量为0.005g，在温度37.0±1℃、湿度50％的条件下培养140h，得到斜面孢子；

b.种子液培养：将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，斜面孢子的接种量为3cm²的斜面孢子接种于种瓶培养基，种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1℃、湿度50％、转速180rpm的条件下培养22h，得到种子液；

c.发酵培养：将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中，种子液的接种量为发酵培养基体积的5％，在温度37.0±1℃、湿度50％、转速220rpm的条件下培养45h后，随后加入玉米浆，加入玉米浆的量为发酵液体积的0.7％(v/v％)，然后继续培养90h，即得到含有安普霉素的发酵液。

将制备得到的安普霉素发酵液进行检测，测得安普霉素的发酵单位为8400U/mL。

将安普霉素发酵液进行酸碱预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液，洗脱液经过浓缩、脱色，真空干燥最终得到安普霉素。

实施例2

斜面培养基按质量百分比的组成为：玉米淀粉2.0％、硝酸钾0.1％、硫酸镁0.025％、氯化钠0.04％、磷酸二氢钾0.04％、酵母粉0.1％、碳酸钙0.1％、琼脂2.0％。

种瓶培养基按质量百分比的组成为：葡萄糖2.0％、玉米淀粉1.5％、低温黄豆饼粉2.0％、碳酸钙0.2％、硫酸镁0.05％、酵母粉0.1％、硫酸铵0.1％、玉米浆1％。

发酵培养基按质量百分比的组成为：低温黄豆饼粉3.0％、玉米淀粉5.0％、碳酸钙0.4％、磷酸二氢钾0.1％、氯化铵0.6％、硫酸锌0.02％、硫酸镁0.05％、淀粉酶0.1％。

a.斜面培养：将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，砂土孢子的接种量为0.003g，在温度37.0±1℃、湿度50％的条件下培养144h，得到斜面孢子；

b.种子液培养：将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，斜面孢子的接种量为1cm²的斜面孢子接种于种瓶培养基，种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1℃、湿度50％、转速200rpm的条件下培养24h，得到种子液；

c.发酵培养：将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中，种子液的接种量为发酵液体积的5％，在温度37.0±1℃、湿度50％、转速200rpm的条件下培养48h，随后加入玉米浆，加入玉米浆的量为发酵液体积的0.5％(v/v％)，然后继续培养80h，即得到含有安普霉素的发酵液。

将制备得到的安普霉素发酵液进行检测，测得安普霉素的发酵单位为8200U/mL。

实施例3

斜面培养基按质量百分比的组成为：玉米淀粉2.5％、硝酸钾0.2％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.06％、磷酸二氢钾0.06％、酵母粉0.2％、碳酸钙0.3％、琼脂2.5％。

种瓶培养基按质量百分比的组成为：葡萄糖2.5％、玉米淀粉2.0％、低温黄豆饼粉3.0％、碳酸钙0.4％、硫酸镁0.1％、酵母粉0.3％、硫酸铵0.15％、玉米浆2％。

发酵培养基按质量百分比的组成为：低温黄豆饼粉4.0％、玉米淀粉7.0％、碳酸钙0.5％、磷酸二氢钾0.2％、氯化铵0.7％、硫酸锌0.03％、硫酸镁0.1％、淀粉酶0.15％。

a.斜面培养：将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，砂土孢子的接种量为0.004g，在温度37.0±1℃、湿度60％的条件下培养120h，得到斜面孢子；

b.种子液培养：将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，斜面孢子的接种量为4cm²的斜面孢子接种于种瓶培养基，种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1℃、湿度60％、转速200rpm的条件下培养20h，得到种子液；

c.发酵培养：将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中，种子液的接种量为发酵液体积的5％，在温度37.0±1℃、湿度60％、转速220rpm的条件下培养40h，随后加入玉米浆，加入玉米浆的量为发酵液体积的1.0％(v/v％)，然后继续培养96h，即得到含有安普霉素的发酵液。

将制备得到的安普霉素发酵液进行检测，测得安普霉素的发酵单位为8000U/mL。

实施例4

斜面培养基按质量百分比的组成为：玉米淀粉2.0％、硝酸钾0.2％、硫酸镁0.025％、氯化钠0.06％、磷酸二氢钾0.04％、酵母粉0.2％、碳酸钙0.1％、琼脂2.0％。

种瓶培养基按质量百分比的组成为：葡萄糖2.5％、玉米淀粉2.0％、低温黄豆饼粉2.0％、碳酸钙0.2％、硫酸镁0.1％、酵母粉0.1％、硫酸铵0.15％、玉米浆1.5％。

发酵培养基按质量百分比的组成为：低温黄豆饼粉4.0％、玉米淀粉5.0％、碳酸钙0.5％、磷酸二氢钾0.1％、氯化铵0.7％、硫酸锌0.02％、硫酸镁0.1％、淀粉酶0.1％。

a.斜面培养：将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，砂土孢子的接种量为0.004g，在温度37.0±1℃、湿度40％的条件下培养130h，得到斜面孢子；

b.种子液培养：将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，斜面孢子的接种量为3cm²的斜面孢子接种于种瓶培养基，种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1℃、湿度40％、转速180rpm的条件下培养22h，得到种子液；

c.发酵培养：将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中，种子液的接种量为发酵液体积的5％，在温度37.0±1℃、湿度50％、转速220rpm的条件下培养42h，随后加入玉米浆，加入玉米浆的量为发酵液体积的0.9％(v/v％)，然后继续培养85h，即得到含有安普霉素的发酵液。

将制备得到的安普霉素发酵液进行检测，测得安普霉素的发酵单位为8100U/mL。

Claims

1.一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

2.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤a中，斜面培养基按质量百分比的组成为：玉米淀粉2.0％-2.5％、硝酸钾0.1％-0.2％、硫酸镁0.025％-0.05％、氯化钠0.04％-0.06％、磷酸二氢钾0.04％-0.06％、酵母粉0.1％-0.2％、碳酸钙0.1％-0.3％、琼脂2.0％-2.5％。

3.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤a中，湿度为40-50％，培养的时间为140h。

4.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤b中，种瓶培养基按质量百分比的组成为：葡萄糖2.0％-2.5％、玉米淀粉1.5％-2.0％、低温黄豆饼粉2.0％-3.0％、碳酸钙0.2％-0.4％、硫酸镁0.05％-0.1％、酵母粉0.1％-0.3％、硫酸铵0.1％-0.15％、玉米浆1％-2％。

5.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤b中，湿度为40-50％，转速为180rpm，培养的时间为22h。

6.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤c中，发酵培养基按质量百分比的组成为：低温黄豆饼粉3.0％-4.0％、玉米淀粉5.0％-7.0％、碳酸钙0.4％-0.5％、磷酸二氢钾0.1％-0.2％、氯化铵0.6％-0.7％、硫酸锌0.02％-0.03％、硫酸镁0.05％-0.1％、淀粉酶0.1％-0.15％。

7.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤c中，湿度为40-50％，转速为220rpm，培养45h后，加入玉米浆后继续培养90h。

8.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤c中，玉米浆的加入量为发酵液体积的0.5％-1.0％。

9.根据权利要求8所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述玉米浆的加入量为发酵液体积的0.7％。