CN103865850A - 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法 - Google Patents
一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103865850A CN103865850A CN201410093180.2A CN201410093180A CN103865850A CN 103865850 A CN103865850 A CN 103865850A CN 201410093180 A CN201410093180 A CN 201410093180A CN 103865850 A CN103865850 A CN 103865850A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- agarase
- vibrios
- bat
- strain
- damping fluid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 241001568331 Vampirovibrio Species 0.000 title abstract 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 23
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 claims description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 21
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 claims description 19
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 19
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 19
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 10
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 9
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 9
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 8
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims description 8
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 8
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 8
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 4
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 claims description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 238000003825 pressing Methods 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 abstract description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 abstract 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 17
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000519590 Pseudoalteromonas Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000036247 Agarivorans Species 0.000 description 1
- 241000590031 Alteromonas Species 0.000 description 1
- 241000237373 Aplysia sp. Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000605056 Cytophaga Species 0.000 description 1
- -1 D-semi-lactosi Chemical class 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241001441750 Littorina Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000195474 Sargassum Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000235017 Zygosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910001186 potin Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一株蝙蝠弧菌（Vampirovibrio sp.）fjfst-2013001，已于2013年12月8日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏编号为CCTCC M 2013638，以及用该菌株发酵制备琼胶酶的方法。本发明以该菌株作为菌种，采用碳源、氮源、无机盐组成的发酵培养基，在优化后的培养条件下，琼胶酶的活力达到4.17U/ml。发酵液通过硫酸铵进行盐析，离心收集沉淀，后进行透析，取透析液过离子交换柱及凝胶柱，冷冻干燥即可获得琼胶酶干粉。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，涉及筛选一株蝙蝠弧菌（Vampirovibriosp.）及其培养发酵制备琼胶酶的方法。
背景技术
琼胶(agar)，又名琼脂，是一种在海洋红藻中经热水提取得到的海藻多糖，其资源丰富，广泛应用于食品，医药，生物技术等领域，琼胶主要由中性的琼胶糖和离子性的硫琼胶组成，琼胶糖是由1,3连接的β-D-半乳糖和1,4连接的3,6-内醚-α-L-半乳糖残基反复交替连接的直链聚合物。
琼胶酶来源广泛，主要存在于海洋细菌中：交替单胞菌属，噬细胞菌属，假单胞菌属， 交替假单胞菌属，链霉菌属，微颤菌属，弧菌属。在以海藻为食的动物属中均有发现，如海兔属，滨螺属，冠海詹属等。
利用微生物法制备琼胶酶已经有许多年历史了，包括cytophage,(Duckworth M.Turvey JR.Biochem J,1969a),(Van der Meulen HJ,Harder W.Antonie Van Leeuwenhoek.1975),Agarivorans(Hu ct al.Appl Microbiol.2008)(Fu et al.Appl Microbiol Biotechnol.2008),Vibrio(Araki er al.J Mar Biotechnol.1998a)Dong er al.Biosci Biotechnol Biochem.2007),Pseudoalteromonas(Vera et al.Appl Environ Microbiol.1998)(Schroeder et al.Microbiology.2003),Streptomyces(Bibb et al.J Gen Microbiol.1987),Alteromonas(Leon et al.Appl Environ Microbiol.1992)(Wang er al. Appl Microbiol Biotechnol.2006)(Potin et al.EurJBiochem.1993),Pseudomonas(Morrice et al. Eur J Biochem.1983)(Malmqvist.Biochim Biophys Acta.1978)。但是其制备的琼胶酶由于尚未适应大规模工业化生产。所以故急需筛选出新的菌株进入微生物库中，作为生产琼胶酶菌株的后备力量。
琼胶寡糖就是指琼胶多糖经水解后聚合度(DP)为2-10的低聚糖，又称琼胶低聚糖，主要由琼二糖的重复单位连接而成，水溶性好，有利于人体吸收，大大提高了其应用价值，是一种新型的海洋功能性低聚糖，其生物活性正在逐渐被挖掘，不仅具有功能性低聚糖的一般特性，还具有许多普通寡糖无法替代的生理功能特性，如较强的抗肿瘤，抗氧化，抗炎，抗龋齿及抗淀粉老化等活性，是一种极具开发潜力的低聚糖。而在海洋中藻类含量丰富，琼胶酶水解产生的琼胶寡糖对于提高资源的利用价值，有着重要的作用，并有着深远的影响，此外，琼胶酶还可以作为多种产业的工具酶，可制成酶制剂，广泛应用于生物，食品和水产养殖等多种领域。
发明内容
本发明的目的是筛选出一种产琼胶酶的菌株，并提供一种利用此菌株制备琼胶酶的方法。
本发明的技术方案：一株筛选自市售鲍鱼肠道的细菌，可以用于制备琼胶酶(agarase)，其分类命名为蝙蝠弧菌（Vampirovibriosp.）fjfst-2013001，已于2013年12月8日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏编号为CCTCC M 2013638，保藏地址为武汉大学。
微生物菌株的筛选与鉴定：
本发明取市售新鲜鲍鱼，消毒之后，用无菌水清洗，用无菌手术刀将其与壳分离，用镊子和手术刀取下壳上的肠道，涂布于琼脂筛选培养基上，在25℃下，培养48h挑选有明显凹陷的菌落进入琼脂筛选培养基中进行划线分离纯化，纯种接到发酵培养基25℃， 120 rpm，摇瓶培养24-72h，检测培养基中的琼脂酶活力，最终筛选出目标菌株B-13，对其进行生理生化特性鉴定和分子生物学实验指南进行16s rDNA序列分析，确定其属于蝙蝠弧菌（Vampirovibriosp.），拟命名为蝙蝠弧菌（Vampirovibriosp.）fjfst-2013001。
用所述蝙蝠弧菌（Vampirovibriosp.）fjfst-2013001生产琼胶酶的方法包括如下步骤：
（1） 用250mL锥形瓶装20-60mL种子培养基，按常规方法灭菌，冷却，并接种菌落，接种后于20-30℃，80-140rpm摇床培养12-24h后得到种子发酵液；
（2） 用250mL锥形瓶装20-60mL发酵培养基，按常规方法灭菌，冷却，并按2%-10%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，20-30℃培养24-60h后得到含琼胶酶的发酵液；
（3） 而后将发酵培养基经过4℃，8000-10000g冷冻离心10-20min之后，取上清液；
（4） 将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵进行盐析，放置冰箱过夜后，4℃、8000-10000g离心20-40min取沉淀；沉淀置于0.01-0.1mol/L PBS缓冲液中溶解，而后置于透析袋中透析；
（5） 取透析后的透析液，用0.01-0.1mol/L PBS缓冲液冲过2-3床体积后，加入5-10ml透析液进入Q-Sepharose Fast Flow中，上样平衡后，用2-3床0.01-0.1mol/L PBS缓冲液洗去杂质，而后用0.01-0.1mol/L PBS缓冲液含0-2mol/L的NaCl进行梯度洗脱，收集有琼胶酶活性的试管，将有活性的合并，充分透析脱盐，进行冷冻干燥，得粗酶粉；
（6） 取粗酶粉0.1g，溶于5ml的0.01-0.1mol/L PBS缓冲液中，待0.01-0.1mol/L PBS缓冲液冲过4-5床体积之后，加入5ml样液到凝胶柱Sephacryl S-100上，并用含0.01-0.1mol/L PBS缓冲液洗脱，测定并收集有琼胶酶活力的试管；
（7） 将试管中的液体合并进行冷冻干燥，即成琼胶酶。
所述种子培养基为：海水晶25g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，琼脂2g/L，调节pH为7.2-8.4，去离子水配制；发酵培养基配方：海水晶20-30g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母粉0.5-2.5g/L，琼脂1.5-2.5g/L，调节pH为7.2-8.4，去离子水配制。
用该方法生产的琼胶酶的检测方法：
取上述步骤（3）得到含有琼胶酶的发酵液上清液1mL，加入1mL的PBS缓冲液（其中含有琼胶0.1%），置于40℃水浴锅中酶解30min，后加入1.5mLDNS，沸水浴15min。冷却至室温后，用蒸馏水补齐刻度，使用分光光度计在540nm下进行检测。1U定义为1min产生1ug琼胶寡糖的值。
本发明的有益效果：筛选出一种用于微生物法生产琼胶酶的菌株，分类命名为蝙蝠弧菌（Vampirovibriosp.）fjfst-2013001。本发明以该菌作为菌种，以常见碳源，氮源，无机盐组成的发酵培养基，可以在24-60h内达到最大酶产量。
具体实施方式
以下是说明本发明的具体实施例，但本发明并不限于此。
实施例1
取福州市售新鲜鲍鱼，立即浸入70%的酒精1min消毒，再用无菌水清洗数次，用无菌手术刀将其与壳分离，再用无菌水清洗数次，用镊子和手术刀取下壳上的肠道，置于预先灭菌的研钵中，加入灭菌的1ml海水研磨10min，后加入9ml灭菌海水混匀。吸取1ml进行稀释（10-1,10-2,10-3,10-4,），吸取0.5ml涂布于琼脂筛选培养基上，在25℃下，培养48h挑选有明显凹陷的菌落进入琼脂筛选培养基中进行划线分离纯化，将纯种接到液体培养基25℃，100rpm，摇瓶培养48h，离心取上清，采用分光光度法检测培养基中的琼脂酶活性，经过初筛，共分离获得6株能产琼胶酶的细菌，结合琼胶酶的生产能力，最终选定B-13作为出发菌株。
实施例2
经形态学和生理生化特性研究，B-13菌株的特征如下：
菌落形态：菌落呈现出圆形，表面光滑，乳白色，边缘整齐。
细胞形态：此为革兰氏阴性菌，形态为杆状。
生理生化特征：为兼性厌氧菌，能利用淀粉，葡萄糖，蔗糖，醋酸钠，D-半乳糖等多种化合物作为碳源，也可以利用蛋白胨，酵母膏，硝酸铵，硫酸铵，等多种化合物作为氮源。
对菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，发现其16S rRNA的基因部分片断长度为1484bp，经过NCBI和核糖体数据库进行比对，鉴定为蝙蝠弧菌（Vampirovibriosp.），拟命名为蝙蝠弧菌（Vampirovibriosp.）fjfst-2013001，菌株的16S rRNA序列具体可见序列表。
实施例3
（1） 将蝙蝠弧菌（Vampirovibriosp.）fjfst-2013001在种子培养基中，用250mL锥形瓶装30mL种子培养基，按常规方法灭菌，冷却，并接种菌落，接种后于25℃，140rpm摇床培养24h后得到种子发酵液，所述种子培养基为：海水晶25g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，琼脂2g/L，调节pH为7.4，去离子水配制。
（2） 用250mL锥形瓶装30mL发酵培养基，按常规方法灭菌，冷却，并按4%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，接种后于25℃，140rpm摇床培养培养48h后得到含琼胶酶的发酵液，所述发酵培养基为：海水晶25g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，琼脂2g/L，调节pH为7.4，去离子水配制。
该实施例所得的琼胶酶的活力为1.71U/mL
实施例4
（1） 将蝙蝠弧菌（Vampirovibriosp.）fjfst-2013001在种子培养基中，用250mL锥形瓶装30mL种子培养基，按常规方法灭菌，冷却，并接种菌落，接种后于25℃，100rpm摇床培养24h后得到种子发酵液，所述种子培养基为：海水晶25g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，琼脂2.5g/L，调节pH为8，去离子水配制。
（2） 用250mL锥形瓶装30mL发酵培养基，按常规方法灭菌，冷却，并按8%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，接种后于25℃，100rpm摇床培养培养48h后得到含琼胶酶的发酵液，所述发酵培养基为：海水晶25g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，琼脂2.5g/L，调节pH为8，去离子水配制。
该实施例所得的琼胶酶的活力为4.17U/mL
实施例5
（1） 将上述发酵培养基经过4℃， 8000g冷冻离心15min之后，取上清液。
（2） 将上清液加入质量分数为80%的饱和硫酸铵进行盐析，放置冰箱过夜，4℃， 10000g离心30min取沉淀。
（3） 沉淀置于一定量的0.01mol/L PBS缓冲液中溶解，而后置于透析袋中透析。
（4） 取透析后的透析液，用0.01-0.1mol/L PBS缓冲液冲过2-3床体积后，加入5-10ml透析液进入Q-Sepharose Fast Flow中，上样平衡后，用2-3床0.01-0.1mol/L PBS缓冲液洗去杂质，而后用0.01-0.1mol/L PBS缓冲液含0-2mol/L的NaCl进行梯度洗脱，收集有琼胶酶活性的试管，将有活性的合并之后，充分透析脱盐之后，进行冷冻干燥，得粗酶粉。
（5） 取粗酶粉0.1g，溶于5ml的0.01-0.1mol/L PBS缓冲液中，待0.01-0.1mol/L PBS缓冲液冲过4-5床体积之后，加入5ml样液到凝胶柱Sephacryl S-100上，并用含0.01-0.1mol/L PBS缓冲液洗脱，测定并收集有琼胶酶活力的试管。
（6） 将试管中的液体合并进行冷冻干燥，即成琼胶酶。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1484
<212> DNA
<213> 16S rRNA
<400> 1
cagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggtgtg cttcacacat gcaagtcgaa 60
cgaggtagca atacctagtg gcggacgggt gagtaacgcg tgggaatctg cctttagatg 120
ggggataacg ggccgaaagg tccgctaata ccgcatatgc cgcaaggtga aaggagtaat 180
ccgtctaaag atgagcccgc gtccgattag ctagttggta gagtaagagc ctaccaaggc 240
gacgatcggt agctggtctg agaggatgat cagccacaat gggactgaga cacggcccat 300
actcctacgg gaggcagcag tggggaattt tacgcaatgg gggaaaccct gacgtagcga 360
caccgcgtga gcgaagaagc cctttggggt gtaaagctct gtcagctgga acgaaaacaa 420
tgacggtacc agcagaggaa gcatcggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaagacgta 480
ggatgcgagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagagtt cgtaggtggt ttgttaagtt 540
tggtgttaaa gatcggggct caaccctggg actgcactga atactggcag actcgagtgt 600
ggtagaggct agtggaattc ccagtgtagc ggtgaaatgc gtagatattg ggaagaacac 660
cggtggcgta ggcgactagc tgggccgtaa ctgacgctga ggaacgaaag ccaggggagc 720
gaatgggatt agatacccca gtagtcctgg ccgtaaacga tggatactag gcgtatcggg 780
tatcgacccc tgatgtgccg cagctaacgc gataagtatc ccgcctgagt agtacggccg 840
caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggaac atgtggttta 900
attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg gcttgacatg gtaggaagct ttcggaaacg 960
agagtgtgcc cgcaagggag cctacacaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1020
gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccccc gttgttagtt gccatcaggt 1080
aaagctgggc actctagcga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggacgacgtc 1140
aagtcatcat gccccttatg ccccgggcta cacacgtgtt acaatggctg ggacaatgtg 1200
atgcaatccc gtgaggggga gcgaaccacg aaacccagtc tcagttcaga tcgcaggctg 1260
caactcgcct gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaaccgccg atcagcacgc ggcggtgaat 1320
acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcatgg gagttggtca cgcccaaagt 1380
cggtgcgcta accttcggga agcagccgcc taaggcaggg ccgatgactg ggacgaagtc 1440
gtaacaaggt agccgtaccg gaaggtgcgg ctggatcacc tcct 1484
Claims (5)
1.一株蝙蝠弧菌，其特征在于：所述的菌株为蝙蝠弧菌（Vampirovibrio sp.）fjfst-2013001，已于2013年12月8日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏编号为CCTCC M 2013638。
2.根据权利要求1所述的一株蝙蝠弧菌，其特征在于：所述蝙蝠弧菌的16S rRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种如权利要求1所述的一株蝙蝠弧菌的用途，其特征在于：所述菌株用于制备琼胶酶。
4.一种如权利要求1所述的一株蝙蝠弧菌用于制备琼胶酶的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1） 用250mL锥形瓶装20-60mL种子培养基，按常规方法灭菌，冷却，并接种菌落，接种后于20-30℃，80-140rpm摇床培养12-24h后得到种子发酵液；
（2） 用250mL锥形瓶装20-60mL发酵培养基，按常规方法灭菌，冷却，并按2%-10%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，20-30℃培养24-60h后得到含琼胶酶的发酵液；
（3） 而后将发酵培养基经过4℃，8000-10000g冷冻离心10-20min之后，取上清液；
（4） 将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵进行盐析，放置冰箱过夜后，4℃、8000-10000g离心20-40min取沉淀；
（5） 沉淀置于0.01-0.1mol/L PBS缓冲液中溶解，而后置于透析袋中透析；
（6） 取透析后的透析液，用0.01-0.1mol/L PBS缓冲液冲过2-3床体积后，加入5-10ml透析液进入Q-Sepharose Fast Flow中，上样平衡后，用2-3床0.01-0.1mol/L PBS缓冲液洗去杂质，而后用0.01-0.1mol/L PBS缓冲液含0-2mol/L的NaCl进行梯度洗脱，收集有琼胶酶活性的试管，将有活性的合并，充分透析脱盐，进行冷冻干燥，得粗酶粉；
（7） 取粗酶粉0.1g，溶于5ml的0.01-0.1mol/L PBS缓冲液中，待0.01-0.1mol/L PBS缓冲液冲过4-5床体积之后，加入5ml样液到凝胶柱Sephacryl S-100上，并用含0.01-0.1mol/L PBS缓冲液洗脱，测定并收集有琼胶酶活力的试管；
（8） 将试管中的液体合并进行冷冻干燥，即成琼胶酶。
5.根据权利要求4所述的一株蝙蝠弧菌用于制备琼胶酶的方法，其特征在于：所述种子培养基为：海水晶25g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，琼脂2g/L，调节pH为7.2-8.4，去离子水配制；发酵培养基配方：海水晶20-30g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母粉0.5-2.5g/L，琼脂1.5-2.5g/L，调节pH为7.2-8.4，去离子水配制。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410093180.2A CN103865850B (zh) | 2014-03-14 | 2014-03-14 | 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410093180.2A CN103865850B (zh) | 2014-03-14 | 2014-03-14 | 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103865850A true CN103865850A (zh) | 2014-06-18 |
| CN103865850B CN103865850B (zh) | 2015-11-18 |
Family
ID=50904862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410093180.2A Active CN103865850B (zh) | 2014-03-14 | 2014-03-14 | 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103865850B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104498563A (zh) * | 2015-01-15 | 2015-04-08 | 福建省绿麒食品胶体有限公司 | 一种江蓠菜琼胶寡糖及其制备方法 |
| CN105420142A (zh) * | 2015-10-13 | 2016-03-23 | 中国海洋大学 | 一种来源于海洋生物的细菌Pseudoalteromonas.sp.QJ97及用其生产琼胶酶的方法 |
| CN111826297A (zh) * | 2019-04-18 | 2020-10-27 | 新乡医学院 | 一种产琼胶酶菌株的选育方法 |
| CN113817710A (zh) * | 2021-11-09 | 2021-12-21 | 蓝脑科技(厦门)有限公司 | 一种琼胶酶冻干保护剂及琼胶酶的保存方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0743363A2 (en) * | 1995-04-27 | 1996-11-20 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Novel beta-agrase and microorganism generating the same |
| CN101451113A (zh) * | 2008-11-06 | 2009-06-10 | 国家***第二海洋研究所 | 一种需钠弧菌及采用该菌生产琼胶酶的方法 |
| CN101845447A (zh) * | 2010-04-22 | 2010-09-29 | 国家***第二海洋研究所 | 一种β-琼胶酶编码基因及基因获取方法 |
| CN104498563A (zh) * | 2015-01-15 | 2015-04-08 | 福建省绿麒食品胶体有限公司 | 一种江蓠菜琼胶寡糖及其制备方法 |
-
2014
- 2014-03-14 CN CN201410093180.2A patent/CN103865850B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0743363A2 (en) * | 1995-04-27 | 1996-11-20 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Novel beta-agrase and microorganism generating the same |
| CN101451113A (zh) * | 2008-11-06 | 2009-06-10 | 国家***第二海洋研究所 | 一种需钠弧菌及采用该菌生产琼胶酶的方法 |
| CN101845447A (zh) * | 2010-04-22 | 2010-09-29 | 国家***第二海洋研究所 | 一种β-琼胶酶编码基因及基因获取方法 |
| CN104498563A (zh) * | 2015-01-15 | 2015-04-08 | 福建省绿麒食品胶体有限公司 | 一种江蓠菜琼胶寡糖及其制备方法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104498563A (zh) * | 2015-01-15 | 2015-04-08 | 福建省绿麒食品胶体有限公司 | 一种江蓠菜琼胶寡糖及其制备方法 |
| CN105420142A (zh) * | 2015-10-13 | 2016-03-23 | 中国海洋大学 | 一种来源于海洋生物的细菌Pseudoalteromonas.sp.QJ97及用其生产琼胶酶的方法 |
| CN105420142B (zh) * | 2015-10-13 | 2018-11-09 | 中国海洋大学 | 一种来源于海洋生物的细菌Pseudoalteromonas.sp.QJ97及用其生产琼胶酶的方法 |
| CN111826297A (zh) * | 2019-04-18 | 2020-10-27 | 新乡医学院 | 一种产琼胶酶菌株的选育方法 |
| CN113817710A (zh) * | 2021-11-09 | 2021-12-21 | 蓝脑科技(厦门)有限公司 | 一种琼胶酶冻干保护剂及琼胶酶的保存方法 |
| CN113817710B (zh) * | 2021-11-09 | 2023-11-24 | 蓝脑科技(厦门)有限公司 | 一种琼胶酶冻干保护剂及琼胶酶的保存方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103865850B (zh) | 2015-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Guo et al. | Characterization of flocculating agent from the self-flocculating microalga Scenedesmus obliquus AS-6-1 for efficient biomass harvest | |
| CN105039193B (zh) | 一种微生物发酵生产氨基葡萄糖的菌株及方法 | |
| CN104195080B (zh) | 一株产褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用 | |
| CN102586150B (zh) | 产生褐藻胶裂解酶的菌株及其发酵方法 | |
| CN101608166B (zh) | 一株黄杆菌菌株及其在产生琼胶酶中的应用 | |
| CN110218667B (zh) | 一株产海藻酸裂解酶的菌株sh-1及其应用 | |
| CN106635920B (zh) | 一种高产岩藻多糖酶的海洋交替假单胞菌及其应用 | |
| CN103865850B (zh) | 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法 | |
| CN102586151B (zh) | 一株高产多糖的菌株及利用该菌株发酵生产多糖的方法 | |
| CN104087628A (zh) | 一种降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法 | |
| CN104893997B (zh) | 一种低温生产几丁质酶的菌株及其发酵方法 | |
| CN105969681A (zh) | 一株高抗氧化耐胆盐耐酸植物乳杆菌jr4及其应用 | |
| CN103898013B (zh) | 一株海旋菌及κ-卡拉胶酶的制备 | |
| CN106434475B (zh) | 一株链霉菌属多糖降解菌及其培养方法与应用 | |
| CN111961619A (zh) | 一株可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌和应用 | |
| CN103898012B (zh) | 一株海旋菌及制备琼胶酶的方法 | |
| CN103305496A (zh) | 一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法 | |
| CN105349461A (zh) | 一株产琼胶酶溶藻弧菌及应用 | |
| CN103923853B (zh) | 一株类芽孢杆菌及其用于κ-卡拉胶酶的制备方法 | |
| CN110616150B (zh) | 一株高产多糖华泽兰内生真菌及其应用 | |
| CN103589660B (zh) | 一株产雷公藤甲素的内生细菌 | |
| CN103865851B (zh) | 一株绿脓杆菌用于κ-卡拉胶酶的制备 | |
| CN112458022B (zh) | 高产几丁质脱乙酰酶的地衣芽孢杆菌Bl22及其相关产品和应用 | |
| CN112143669B (zh) | 一株蓝菌藻及其培养方法和应用 | |
| CN114933974A (zh) | 一种拟康氏木霉c5-9及其在拮抗灰葡萄孢菌中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201112 Address after: Room 1609, Jian'an building, No. 3, Section 1, Wanjiali Middle Road, Martian street, Furong district, Changsha City, Hunan Province Patentee after: Changsha liuteng Technology Co.,Ltd. Address before: Cangshan District of Fuzhou City, Fujian province 350002 to build a new town, Jinshan District Patentee before: FUJIAN AGRICULTURE AND FORESTRY University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201215 Address after: No.25-1, Gangcheng Road, dongyinggang Economic Development Zone, Hekou District, Dongying City, Shandong Province Patentee after: Shandong Xingqiang Chemical Industry Technology Research Institute Co.,Ltd. Address before: Room 1609, Jian'an building, No.3, Wanjiali Middle Road, Huoxing street, Furong district, Changsha City, Hunan Province Patentee before: Changsha liuteng Technology Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231101 Address after: Room 707, No. 15 Gangcheng Road, Dongying Port Economic Development Zone, Dongying City, Shandong Province, 257237 Patentee after: Shandong Industry Research Institute Zhongke High-end Chemical Industry Technology Research Institute Co.,Ltd. Address before: No.25-1, Gangcheng Road, dongyinggang Economic Development Zone, Hekou District, Dongying City, Shandong Province Patentee before: Shandong Xingqiang Chemical Industry Technology Research Institute Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |