CN115232757A - 酿酒酵母菌株、发酵菌株及其构建方法和生物乙醇生产方法 - Google Patents

酿酒酵母菌株、发酵菌株及其构建方法和生物乙醇生产方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种酿酒酵母菌株、发酵菌株及其构建方法和生物乙醇生产方法。酿酒酵母菌株的命名为CE10，酿酒酵母菌株的保藏编号为CGMCC NO.24860。本申请提供的CE10酿酒酵母菌株相比于野生型的酿酒酵母，可以有效利用木糖进行代谢，进而提高生物乙醇的产量；也可以提高对乙酸等酸类抑制剂的耐受性，进而进一步提高生物乙醇的产量。

Description

酿酒酵母菌株、发酵菌株及其构建方法和生物乙醇生产方法
技术领域
本申请涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种酿酒酵母菌株、发酵菌株及其构建方法和生物乙醇生产方法。
背景技术
生物乙醇以可再生生物质为原料，经过一系列生物转化加工过程得到，是可再生生物燃料的重要来源。与汽油相比，生物乙醇具有较高的辛烷值、较高的压缩比和较短的时间燃烧，可以有效降低发动机的爆震率；同时生物乙醇具有较高的蒸发焓、层流火焰速度和汽化热；此外，生物乙醇中氧含量高，有利于提高燃烧效率，并且硫含量低，有利于降低二氧化硫等空气污染物的排放。
目前，生物乙醇主要从富含木质纤维素的原料中获得，比如农作物残留物(农作物秸秆、甘蔗渣或玉米芯等)、能源作物(芒草或柳枝稷等多年生草本植物等)、水生植物(水葫芦等)、森林材料和城市固体生物质等，储量丰富、可再生且价格相对便宜。
木质纤维素生物质生产乙醇要经过预处理、水解、发酵和蒸馏四个步骤。其中，预处理过程是为了使木质素和半纤维素从木质纤维素基质中脱除，降低纤维素的结晶度，增加生物质的孔隙率和表面积，是将生物质原料转化为可发酵糖和生物燃料的关键步骤。发酵是利用酿酒酵母等微生物将木质纤维素水解液中的可溶性糖转化为生物乙醇的过程。木质纤维素水解液中富含葡萄糖、木糖和乙酸，木糖作为木质纤维素水解液中的第二大糖类，实现对木糖的高效快速转化是利用木质纤维素生物质生产生物乙醇的经济手段。
但是，木质纤维素生物质在预处理过程中会形成乙酸等酸类抑制剂，会影响野生型的酿酒酵母在后续发酵时的速率和产量，且野生型的酿酒酵母只能利用葡萄糖进行代谢，不能利用木糖进行代谢，进而使得野生型的酿酒酵母生产的生物乙醇产量较少，不利于进行大规模生产生物乙醇。
发明内容
本申请的目的在于提供一种酿酒酵母菌株、发酵菌株及其构建方法和生物乙醇生产方法，其旨在改善野生型的酿酒酵母菌株的木糖利用效率低和生物乙醇产量较少的技术问题。
第一方面，本申请提供一种酿酒酵母菌株，酿酒酵母菌株的命名为CE10，酿酒酵母菌株的保藏编号为CGMCC NO.24860。
生物材料：CE10，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2022年05月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.24860。
本申请提供的CE10酿酒酵母菌株相比于野生型的酿酒酵母，可以有效利用木糖进行代谢，提高生物乙醇的产量；也可以提高菌株对乙酸等酸类抑制剂的耐受性，进而进一步提高生物乙醇的产量。
第二方面，本申请提供一种发酵菌株的构建方法，包括将目的基因整合至上述第一方面提供的酿酒酵母菌株的基因组中。目的基因选自MSN2、TIPI、YRB1或SPII。其中，MSN2的序列如SEQ ID NO.1 所示，TIPI的序列如SEQ ID NO.2所示，YRB1的序列如SEQ ID NO.3所示，SPII的序列如SEQ ID NO.4所示。
将目的基因MSN2、TIP1、YRB1或SPI1分别整合至CE10酿酒酵母菌株的基因组中以构建发酵菌株，构建出的发酵菌株相比于野生型的酿酒酵母可以有效利用木糖进行代谢，且相比于CE10酿酒酵母菌株，可以进一步有效提高菌株对木糖的利用效率以及菌株对乙酸等酸类抑制剂的耐受性，进而进一步提高生物乙醇的产量。
第三方面，本申请提供一种发酵菌株的构建方法，包括先缺失上述第一方面提供的酿酒酵母菌株的基因组中的CAT8基因，再以酿酒酵母菌株的基因组中的CAT8为整合位点，将目的基因整合至缺失 CAT8基因后的酿酒酵母菌株的基因组中。目的基因选自MSN2、TIPI、 YRB1或SPII。其中，MSN2的序列如SEQ ID NO.1所示，TIPI的序列如SEQ ID NO.2所示，YRB1的序列如SEQ ID NO.3所示，SPII 的序列如SEQ ID NO.4所示。
先对酿酒酵母菌株CE10的基因组中的CAT8基因进行缺失，有利于使得后续制得发酵菌株在发酵时的代谢通路更多地流向乙醇发酵方向，有利于提高生物乙醇的产量。再以CAT8为整合位点，将 MSN2、TIP1、YRB1或SPI1目的基因整合至缺失CAT8基因后的酿酒酵母菌株的基因组中以构建发酵菌株，构建出的发酵菌株可以显著提高菌株对木糖的利用效率以及菌株对乙酸等酸类抑制剂的耐受性，进一步提高生物乙醇的产量。
在一种可能的实施方式中，将目的基因整合至缺失CAT8基因后的酿酒酵母菌株的基因组中的步骤包括：将含有目的基因的线性片段整合至缺失CAT8基因后的酿酒酵母菌株的基因组中，并使目的基因过表达。
将目的基因过表达，有利于构建出稳定的发酵菌株。
第四方面，本申请提供一种发酵菌株，采用上述第二方面或第三方面提供的发酵菌株的构建方法制得。
本申请提供的发酵菌株，相比于野生型的酿酒酵母可以有效利用木糖进行代谢；相比于CE10酿酒酵母菌株，可以进一步有效提高菌株对木糖的利用效率以及菌株对乙酸等酸类抑制剂的耐受性，进而进一步提高生物乙醇的产量。
第五方面，本申请提供一种生物生产生物乙醇的方法，包括在含有木糖的培养体系中发酵培养如上述第一或第四方面提供的菌株。
本申请第一方面提供的CE10酿酒酵母菌株以及本申请第四方面提供的发酵菌株相比于野生型的酿酒酵母，可以有效利用木糖进行代谢，进而提高生物乙醇的产量；采用CE10酿酒酵母菌株以及本申请第四方面提供的发酵菌株在含有木糖的培养体系中进行发酵培养，可以用于大规模生产乙醇。
在一种可能的实施方式中，木糖在培养体系中的浓度为 30-50g/L。
木糖在培养体系中的浓度为30-50g/L，可以保证本申请提供的菌株能够很好地利用木糖进行代谢，进而有利于产生更多的生物乙醇。在一种可能的实施方式中，培养体系中还含有葡萄糖。
培养体系中还含有葡萄糖，可以使得CE10酿酒酵母菌株以及本申请第四方面提供的发酵菌株不仅可以进行木糖代谢，也可以进行葡萄糖代谢，进而有利于产生更多的生物乙醇。
在一种可能的实施方式中，葡萄糖在培养体系中的浓度为 70-100g/L。
葡萄糖在培养体系中的浓度为70-100g/L，可以保证本申请提供的菌株能够很好地利用葡萄糖进行代谢，进而有利于产生更多的生物乙醇。
在一种可能的实施方式中，发酵培养的温度为30-35℃，可以使得CE10酿酒酵母菌株以及本申请第四方面提供的发酵菌株具有良好的活性，有利于更好地进行代谢生产生物乙醇。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1示出了本申请实施例1-5提供的菌株在发酵48h后的木糖利用率对比图。
图2示出了本申请实施例1-5提供的菌株在分别发酵36h和48h 后的乙醇产量对比图。
图3示出了本申请实施例1-5提供的菌株在发酵48h后的乙酸消耗率对比图。
图4示出了本申请实施例2以及对比例1-12提供的菌株在分别发酵36h和48h后的乙醇产量对比图。
图5示出了本申请实施例3-4以及对比例13-17提供的菌株在分别发酵36h和48h后的乙醇产量对比图。
图6示出了本申请实施例5以及对比例18-23提供的菌株在分别发酵36h和48h后的乙醇产量对比图。
生物材料保藏说明：
生物材料：CE10，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2022年05月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.24860。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的一种酿酒酵母菌株、发酵菌株及其构建方法和应用、生产生物乙醇的方法进行具体说明。
本申请提供一种酿酒酵母菌株，酿酒酵母菌株的命名为CE10，酿酒酵母菌株的保藏编号为CGMCC NO.24860。
生物材料：CE10，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2022年05月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.24860。
本申请通过对野生型的酿酒酵母菌株进行数年的适应性进化，得到CE10酿酒酵母菌株，相比于野生型的酿酒酵母，本申请提供的 CE10酿酒酵母菌株可以有效利用木糖进行代谢，进而提高生物乙醇的产量；也可以提高菌株对乙酸等酸类抑制剂的耐受性，进而进一步提高生物乙醇的产量。
CE10酿酒酵母菌株的培养条件为：挑取CE10酿酒酵母菌株单菌落菌于YPD培养基中，于30℃、200rpm振荡培养。
CE10酿酒酵母菌株的保存条件为：将CE10酿酒酵母菌接种于 YPD固体平板培养基，30℃培养48-72h后于4℃短期保藏。或将培养好的CE10酿酒酵母菌菌液接入80％(v/v)无菌甘油冻存管中、 -80℃冷冻长期保藏。
本申请还提供一种发酵菌株的构建方法，包括将目的基因整合至上述提供的CE10酿酒酵母菌株的基因组中。目的基因选自MSN2、 TIPI、YRB1或SPII。其中，MSN2的序列如SEQID NO.1所示，TIPI 的序列如SEQ ID NO.2所示，YRB1的序列如SEQ ID NO.3所示，SPII 的序列如SEQ ID NO.4所示。
将目的基因MSN2(转录因子)、TIP1(模式基因)、YRB1(模式基因)或SPI1(细胞壁基因)分别整合至CE10酿酒酵母菌株的基因组中以构建发酵菌株，相比于野生型的酿酒酵母，可以有效利用木糖进行代谢，进而提高生物乙醇的产量且能够显著提高菌株对乙酸等酸类抑制剂的耐受性；相比于CE10酿酒酵母菌株，本申请构建出的发酵菌株，可以进一步提高菌株对木糖的利用效率以及生物乙醇的产量。
本申请还提供一种发酵菌株的构建方法，包括先缺失上述提供的 CE10酿酒酵母菌株的基因组中的CAT8基因，再以CE10酿酒酵母菌株的基因组中的CAT8为整合位点，将目的基因整合至缺失CAT8 基因后的CE10酿酒酵母菌株的基因组中。目的基因选自MSN2、TIPI、 YRB1或SPII。其中，MSN2的序列如SEQ ID NO.1所示，TIPI的序列如SEQ ID NO.2所示，YRB1的序列如SEQ ID NO.3所示，SPII 的序列如SEQ ID NO.4所示。
先对酿酒酵母菌株CE10的基因组中的CAT8基因进行缺失，有利于使得后续制得发酵菌株在发酵时的代谢通路更多地流向乙醇发酵方向，有利于提高生物乙醇的产量。再以CAT8为整合位点，将 MSN2、TIP1、YRB1或SPI1目的基因整合至缺失CAT8基因后的酿酒酵母菌株的基因组中以构建发酵菌株，构建出的发酵菌株可以显著提高菌株对木糖的利用效率以及菌株对乙酸等酸类抑制剂的耐受性，进一步提高生物乙醇的产量。
进一步地，将目的基因整合至缺失CAT8基因后的酿酒酵母菌株的基因组中的步骤包括：将含有目的基因的线性片段整合至缺失 CAT8基因后的酿酒酵母菌株的基因组中，并使目的基因过表达。
以CAT8为整合位点并将目的基因过表达，有利于构建出稳定的发酵菌株。
在本申请的实施例中，含有目的基因的线性片段的制备方法包括：先通过GoldenGate Assembly(GGA)法将载体片段和目的基因片段酶切连接，以构建出含有目的基因的质粒。将含有目的基因的质粒电转至大肠杆菌感受态中，以带有卡那霉素抗性的固体LB培养基筛选出阳性克隆菌落。挑选一定数量的阳性克隆菌落通过菌落PCR 确认是否扩增出正确的条带，若条带大小和测序结果都正确，则可以提取相应的质粒。再以提取的质粒为模板，扩增出含有目的基因的线性片段。
在本申请实施例中，利用同源重组原理将目的基因整合至CE10 酿酒酵母菌株的基因组中，使得目的基因过表达。将含有目的基因的线性片段以及另外两个与含有目的基因的线性片段之间存在同源片段的线性片段，一起通过醋酸锂转化法整合至CE10酿酒酵母菌株的 CAT8位点。
本申请还提供一种发酵菌株，采用上述提供的发酵菌株的构建方法制得。
本申请提供的发酵菌株，相比于野生型的酿酒酵母可以有效利用木糖进行代谢；相比于CE10酿酒酵母菌株，可以进一步有效提高菌株对木糖的利用效率以及菌株对乙酸等酸类抑制剂的耐受性，进而进一步提高生物乙醇的产量。
在本申请中，当采用“先缺失CE10酿酒酵母菌株的基因组中的 CAT8基因，再以CE10酿酒酵母菌株的基因组中的CAT8为整合位点，利用同源重组原理将含有目的基因片段整合至缺失CAT8基因后的CE10酿酒酵母菌株的基因组中，并使目的基因过表达”的方法构建发酵菌株时，当目的基因为MSN2时，发酵菌株命名为WXY246；当目的基因为TIP1时，发酵菌株命名为WXY247；当目的基因为 YRB1时，发酵菌株命名为WXY249；当目的基因为SPI1时，发酵菌株命名为WXY256。
本申请提供的WXY246发酵菌株、WXY247发酵菌株、WXY249 发酵菌株以及WXY256发酵菌株，相比于野生型的酿酒酵母，可以有效利用木糖进行代谢，进而提高生物乙醇的产量且能够显著提高菌株对乙酸等酸类抑制剂的耐受性；相比于CE10酿酒酵母菌株，也可以进一步提高菌株对木糖的利用效率、对乙酸等酸类抑制剂的耐受性以及生物乙醇的产量。
其中，WXY246发酵菌株的培养条件为：挑取WXY246发酵菌株单菌落菌于YPD培养基中，于30℃、200rpm振荡培养。
WXY246发酵菌株的保存条件为：将WXY246发酵菌接种于 YPD固体平板培养基，30℃培养48-72h后于4℃短期保藏。或将培养好的WXY246发酵菌菌液接入80％(v/v)无菌甘油冻存管中、-80℃冷冻长期保藏。
其中，WXY247发酵菌株的培养条件为：挑取WXY247发酵菌株单菌落菌于YPD培养基中，于30℃、200rpm振荡培养。
WXY247发酵菌株的保存条件为：将WXY247发酵菌接种于 YPD固体平板培养基，30℃培养48-72h后于4℃短期保藏。或将培养好的WXY247发酵菌菌液接入80％(v/v)无菌甘油冻存管中、-80℃冷冻长期保藏。
其中，WXY249发酵菌株的培养条件为：挑取WXY249发酵菌株单菌落菌于YPD培养基中，于30℃、200rpm振荡培养。
WXY249发酵菌株的保存条件为：将WXY249发酵菌接种于 YPD固体平板培养基，30℃培养48-72h后于4℃短期保藏。或将培养好的WXY249发酵菌菌液接入80％(v/v)无菌甘油冻存管中、-80℃冷冻长期保藏。
其中，WXY256发酵菌株的培养条件为：挑取WXY256发酵菌株单菌落菌于YPD培养基中，于30℃、200rpm振荡培养。
WXY256发酵菌株的保存条件为：将WXY256发酵菌接种于 YPD固体平板培养基，30℃培养48-72h后于4℃短期保藏。或将培养好的WXY256发酵菌菌液接入80％(v/v)无菌甘油冻存管中、-80℃冷冻长期保藏。
本申请还提供一种生物生产生物乙醇的方法，包括在含有木糖的培养体系中发酵培养上述提供的CE10酿酒酵母菌株以及发酵菌株。
由于本申请提供的CE10酿酒酵母菌株以及构建出的发酵菌株相比于野生型的酿酒酵母，可以有效利用木糖进行代谢，进而提高生物乙醇的产量，采用CE10酿酒酵母菌株以及构建出的发酵菌株在含有木糖的培养体系中进行发酵培养，可以用于大规模生产乙醇。
进一步地，木糖在培养体系中的浓度为30-50g/L，可以保证本申请提供的菌株能够很好地利用木糖进行代谢，进而有利于产生更多的生物乙醇。作为示例性地，木糖在培养体系中的浓度可以为30g/L、 35g/L、40g/L、45g/L或者50g/L等等。
在本申请实施例中，培养体系中还含有葡萄糖，可以使得CE10 酿酒酵母菌株以及本申请构建出的发酵菌株不仅可以进行木糖代谢，也可以进行葡萄糖代谢，进而有利于产生更多的生物乙醇。
进一步地，葡萄糖在培养体系中的浓度为70-100g/L，可以保证本申请提供的菌株能够很好地利用葡萄糖进行代谢，进而有利于产生更多的生物乙醇。作为示例性地，葡萄糖在培养体系中的浓度可以为 70g/L、75g/L、80g/L、90g/L或者100g/L等等。
再进一步地，发酵培养的温度为30-35℃，可以使得CE10酿酒酵母菌株以及本申请构建出的发酵菌株具有良好的活性，有利于更好地进行代谢生产生物乙醇。作为示例性地，发酵培养的温度可以为 30℃、32℃或者35℃等等。
实施例1
本实施例提供一种CE10酿酒酵母菌株(保藏编号为CGMCC NO.24860)。
实施例2
本实施例提供一种WXY246发酵菌株，采用如下步骤构建：
(1)扩增含有目的基因的线性片段。
以序列如SEQ ID NO.5所示的T1-0为模板，以序列如SEQ ID NO.6所示的T1-0-gga-F和序列如SEQ ID NO.7所示的T1-0-gga-R分别作为上下游引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出线性T1-0 载体片段。以粗提的野生型酿酒酵母基因组为模板，以序列如SEQID NO.8所示的MSN2-gga-F和序列如SEQ ID NO.9所示的MSN2-gga-R 分别为上下游引物，通过PCR扩增出序列如SEQ ID NO.1所示的 MSN2目的基因片段。
先通过琼脂糖凝胶电泳确定扩增出的MSN2目的基因片段的条带大小是否正确，再通过测序对扩增出的MSN2目的基因片段进行碱基序列的比对。如果条带大小和基因序列都正确，通过GGA法将获得的T1-0载体片段和MSN2目的基因片段进行酶切连接构建出质粒T1-0-MSN2。其中，在酶切连接过程中，使用的内切酶为BsaⅠ-HFv2，使用的连接酶为T4 DNALigase。
将质粒T1-0-MSN2电转至大肠杆菌感受态中，以带有卡那霉素抗性的固体LB培养基筛选出阳性克隆菌落。挑选一定数量的阳性克隆菌落通过菌落PCR确认是否扩增出正确的条带，若条带大小和测序结果都正确，则确定可以提取T1-0-MSN2质粒。以提取的 T1-0-MSN2质粒为模板，以序列如SEQ ID NO.10所示的L1-F和序列如SEQ ID NO.11所示的L2-R分别为上下游引物，扩增出 L1-pPGK1-MSN2-tPGI1-L2线性片段。其中，将质粒T1-0-MSN2电转至大肠杆菌感受态的步骤包括：用75％的酒精清洗电转杯，并倒扣于无尘纸上晾干，将电转杯插在铺有塑料薄膜的冰上预冷20min。将电转感受态细胞从-80℃的冰箱中取出，并插到冰上融化。吸取2.5μL 的连接产物T1-0-MSN2加入至50μL的电转大肠杆菌感受态中混匀，将混匀后的样品加入电转杯孔径中，并***到电转仪中进行脉冲电击。向电击后的样品中加入200μL的无抗LB，并吹打混匀，移至 1.5mL的离心管中。将电转后的菌液在37℃，200rpm的摇床中培养 1h后，于12000rpm下离心2min后收集菌体，留50μL液体混匀涂到相应的抗性平板上，在37℃培养箱中倒置培养16h。
(2)扩增与含有目的基因的线性片段存在同源片段的 CAT8UP-G418-L1和L2-CAT8DOWN。
以序列如SEQ ID NO.12所示的T2-CAT8UP-G418-L1为模板，以序列如SEQ IDNO.13所示的CAT8UP-F和序列如SEQ ID NO.14 所示的L1-R分别为上下游引物，扩增出线性片段CAT8UP-G418-L1。
以序列如SEQ ID NO.15所示的T3-L2-CAT8DOWN为模板，以序列如SEQ ID NO.16所示的L2-F和如SEQ ID NO.17所示的 CAT8DOWN-R分别为上下游引物，扩增出线性片段 L2-CAT8DOWN。
(3)将含有目的基因的线性片段、CAT8UP-G418-L1以及 L2-CAT8DOWN同源重组于CE10酿酒酵母菌株的基因组中。
缺失CE10酿酒酵母菌株的基因组的CAT8基因，以CAT8为整合位点，将含有目的基因的线性片段L1-pPGK1-MSN2-tPGI1-L2、 CAT8UP-G418-L1以及L2-CAT8DOWN通过酿酒酵母醋酸锂转化法转化到CE10酿酒酵母菌株中，以使MSN2基因进行过表达。其中，酿酒酵母醋酸锂转化法的步骤包括：向锥形瓶中加入20mL的YPD 液体培养基和CE10酿酒酵母菌株单菌落，在30℃，200rpm的摇床中培养12h，得到菌液。向装有20mLYPD液体培养基加入菌液，并将OD600调至0.2，于30℃，200rpm的摇床中培养4h，使培养后的菌液的OD600为0.7。向1.5mL离心管中加入1mLOD600为0.7的菌液， 25℃下3000g离心2min，弃上清。吸取1mLddH2O水洗菌液，3000g 离心2min，弃上清。再吸取1mLddH2O水洗菌液，3000g离心2min，弃上清。用100μL0.1MLiAc溶液重悬洗涤后的菌体，30℃培养箱中培养10min，3000g离心2min，弃上清。同时将ssDNA溶液置于100℃的加热块上加热10min，加热结束后立即***冰里。用20μL的ddH2O重悬菌体，然后依次加入360μL50％的PEG溶液，55μL1MLiAc溶液， 75μL的处理后的ssDNA溶液和含有1500ng的 L1-pPGK1-MSN2-tPGI1-L2、1500ng的CAT8UP-G418-L1以及1500ng 的L2-CAT8DOWNddH2O的混合溶液40μL。将混合物于1400rpm下剧烈涡旋震荡至完全混匀，于30℃培养箱培养30min，然后于42℃水浴锅中水浴30min。水浴结束后，将其7500g离心2min，用1mLYPD 液体培养基重悬离心后的菌体，于30℃，200rpm的摇床中培养3h。3000g离心2min，弃上清。加入1mL的ddH2O水洗菌体，3000g离心2min，弃上清。加入1mL的ddH2O水洗菌体，3000g离心2min，弃上清。留50μL的液体重悬菌体涂在有抗性的固体培养基上，在30℃培养箱中倒置培养4天。
实施例3
本实施例提供一种WXY247发酵菌株，WXY247发酵菌株的构建方法与实施例2基本相似，区别在于：本实施例中的目的基因为 TIP1，TIP1目的基因片段的扩增采用如下步骤：以粗提的野生型酿酒酵母基因组为模板，以序列如SEQ ID NO.18所示的TIP1-gga-F和序列如SEQ ID NO.19所示的TIP1-gga-R分别为上下游引物，通过 PCR扩增出序列如SEQ IDNO.2所示的TIP1目的基因片段。
实施例4
本实施例提供一种WXY249发酵菌株，WXY249发酵菌株的构建方法与实施例2基本相似，区别在于：本实施例中的目的基因为 YRB1，YRB1目的基因片段的扩增采用如下步骤：以粗提的野生型酿酒酵母基因组为模板，以序列如SEQ ID NO.20所示的YRB1-gga-F 和序列如SEQ ID NO.21所示的YRB1-gga-R分别为上下游引物，通过PCR扩增出序列如SEQ IDNO.3所示的YRB1目的基因片段。
实施例5
本实施例提供一种WXY256发酵菌株(，WXY256发酵菌株的构建方法与实施例2基本相似，区别在于：本实施例中的目的基因为 SPI1，SPI1目的基因片段的扩增采用如下步骤：以粗提的野生型酿酒酵母基因组为模板，以序列如SEQ ID NO.22所示的SPI1-gga-F和序列如SEQ ID NO.23所示的SPI1-gga-R分别为上下游引物，通过 PCR扩增出序列如SEQ IDNO.4所示的SPI1目的基因片段。
对比例1-23
对比例1-23分别提供了一种发酵菌株，发酵菌株的构建方法与实施例2基本相似，区别在于：目的基因不同，扩增目的基因片段的上下游引物分别如表1所示。
表1
Figure BDA0003706854700000141
Figure BDA0003706854700000151
实验例1
将实施例1-5提供的菌株进行混合糖发酵实验，菌株发酵48h后的木糖利用率结果如图1所示，菌株发酵36h和48h后的乙醇产量结果图2所示，菌株发酵48h后的乙酸消耗结果如图3示。其中，混合糖发酵实验的步骤如下：将培养好的菌液加入之发酵培养基中，调节OD600至1，于30℃，200rpm的摇床中培养避光48h。发酵培养基的制备步骤如下：将80g的蛋白胨、10g的酵母提取物、80g的葡萄糖、40g的木糖以及3g的乙酸加入1L的ddH2O中，得到发酵培养基。
从图1可以看出，实施例1-5的菌株均能有效利用木糖进行代谢；由于野生型的酿酒酵母无法利用木糖进行代谢，表明实施例1-5提供的菌株相对于野生型的酿酒酵母能够显著提高对木糖的利用效率。且实施例2-4提供的菌株在发酵48h后的木糖利用效率均高于实施例1 提供的菌株在发酵48h后的木糖利用效率，表明将MSN2、TIP1、YRB1 或SPI1整合至CE10酿酒酵母菌株的基因组中，可以进一步提高菌株对木糖的利用效率。
从图2可以看出，实施例1提供的菌株在发酵36h以及48h后的乙醇产量分别为0.412g/g总糖和0.439g/g总糖，分别达到了理论最大值的80.8％和86.1％，表明实施例1提供的菌株具有良好的生产生物乙醇的能力。进一步地，实施例2-5的菌株在发酵36h以及48h后的乙醇产量均高于实施例1的菌株在发酵36h以及48h后的乙醇产量，表明将MSN2、TIP1、YRB1或SPI1整合至CE10酿酒酵母菌株的基因组中，可以进一步提高生物乙醇的产量。
从图3可以看出，实施例1-5的菌株均能有效消耗乙酸，表明实施例1-5提供的菌株对乙酸具有一定的耐受性。且实施例2-5提供的菌株在发酵48h后的乙酸消耗率均高于实施例1的菌株在发酵48h 后的乙酸消耗率，说明本申请提供的WXY246发酵菌株、WXY247 发酵菌株、WXY249发酵菌株或WXY256发酵菌株相比于CE10酿酒酵母菌株可以进一步提高菌株对乙酸的耐受性，表明将MSN2、 TIP1、YRB1或SPI1整合至CE10酿酒酵母菌株的基因组中，可以进一步提高菌株对乙酸的耐受性。
实验例2
将实施例2以及对比例1-12提供的菌株进行混合糖发酵实验，菌株发酵36h和48h后的乙醇产量结果图4所示。其中，混合糖发酵实验与实验例1相同。
实施例2以及对比例1-12的目的基因均是转录因子，从图4可以看出，实施例2的菌株在发酵36h以及48h后的乙醇产量均明显高于对比例1-12的菌株在发酵36h以及48h后的乙醇产量，说明相比对比例1-12中采用的转录因子，实施例2选用MSN2转录因子整合至CE10酿酒酵母菌株的基因组中可以有效提高生物乙醇的产量。
实验例3
将实施例3-4以及对比例13-17提供的菌株进行混合糖发酵实验，菌株发酵36h和48h后的乙醇产量结果图5所示。其中，混合糖发酵实验与实验例1相同。
实施例3-4以及对比例13-17的目的基因均是相同表达模式基因，从图5可以看出，实施例3-4的菌株在发酵36h以及48h后的乙醇产量均明显高于对比例13-17的菌株在发酵36h以及48h后的乙醇产量，说明相比对比例13-17中采用的相同表达模式基因，实施例3 和4分别选用的相同表达模式基因TIP1和YRB1整合至CE10酿酒酵母菌株的基因组中可以有效提高生物乙醇的产量。
实验例4
将实施例5以及对比例18-23提供的菌株进行混合糖发酵实验，菌株发酵36h和48h后的乙醇产量结果图6所示。其中，混合糖发酵实验与实验例1相同。
实施例5以及对比例18-23的目的基因均是细胞壁基因，从图6 可以看出，实施例5的菌株在发酵36h以及48h后的乙醇产量均明显高于对比例18-23的菌株在发酵36h以及48h后的乙醇产量，说明相比对比例18-23中采用的细胞壁基因，实施例5选用的细胞壁基因SPI1整合至CE10酿酒酵母菌株的基因组中可以有效提高生物乙醇的产量。
综上，本申请提供的CE10酿酒酵母菌株、WXY246发酵菌株、 WXY247发酵菌株、WXY249发酵菌株或WXY256发酵菌株相比于野生型的酿酒酵母，可以显著提高对木糖利用效率以及生物乙醇的产量，因此在生产生物乙醇领域具有良好的应用前景。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都师范大学
<120> 酿酒酵母菌株、发酵菌株及其构建方法和生物乙醇生产方法
<130> 2022.06.21
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2115
<212> DNA
<213> 人工合成
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cgcgatgcaa gaactattga aaatgatagt gaaattaaga gtactaataa tgctagtggc 360
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gaaaaactaa gaaatcaatt gaactcagat acaaattcat attctaactc catttctaat 720
tcaaactcca attctacggg taatttaaat tccagttatt ttaattcact gaacatagac 780
tccatgctag atgattacgt ttctagtgat ctcttattga atgatgatga tgatgacact 840
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aatagaaata caaatctcaa tatcactact aattctacct caagttccaa tgcaagtccg 1020
aataccacta ctatgaacgc aaatgcagac tcaaatattg ctggcaaccc gaaaaacaat 1080
gacgctacca tagacaatga gttgacacag attcttaacg aatataatat gaacttcaac 1140
gataatttgg gcacatccac ttctggcaag aacaaatctg cttgcccaag ttcttttgat 1200
gccaatgcta tgacaaagat aaatccaagt cagcaattac agcaacagct aaaccgagtt 1260
caacacaagc agctcacctc gtcacataat aacagtagca ctaacatgaa atccttcaac 1320
agcgatcttt attcaagaag gcaaagagct tctttaccca taatcgatga ttcactaagc 1380
tacgacctgg ttaataagca ggatgaagac cccaagaacg atatgctgcc gaattcaaat 1440
ttgagttcat ctcaacaatt tatcaaaccg tctatgattc tttcagacaa tgcgtccgtt 1500
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ccattatcgc ctgcatcatc atcctccacg tctcttgcaa caaatcattt ctatcaccat 1680
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agtagtagtg tcaactcaac tggcaatggt gctggggtta cgaaggaaag aaggccaagt 1860
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<213> 人工合成
<400> 39
accaggtctc acgatttact ctttttttgg gtttggtggg gtatcttcat catcg 55
<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 40
accaggtctc aaggtatgac tacagatcct tctgtcaaat tg 42
<210> 41
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 41
accaggtctc acgattcaaa tagaagagtt ggatttgtcc t 41
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
accaggtctc aaggtatggg tgtcatcaag aagaaaagat c 41
<210> 43
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
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accaggtctc acgatttaaa aaaatacagc atcaagatct ccaaattc 48
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<212> DNA
<213> 人工合成
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accaggtctc aaggtatgaa cataccacag cgtcaattta gcaacgaaga gg 52
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<213> 人工合成
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accaggtctc acgatctata cactcgcttc tgtcatgctc gagtcc 46
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<212> DNA
<213> 人工合成
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accaggtctc aaggtatgct agtcttcgga cctaatagta g 41
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<212> DNA
<213> 人工合成
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accaggtctc acgattcaaa aatcaccgtg ctttttgtg 39
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<212> DNA
<213> 人工合成
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accaggtctc aaggtatgtc cggtagaggt aaagg 35
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<212> DNA
<213> 人工合成
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accaggtctc acgatttaac caccgaaacc gtataagg 38
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accaggtctc aaggtatgtc attcgacgac ttacacaaag 40
<210> 51
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<213> 人工合成
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accaggtctc aaggtatgtc attcgacgac ttacacaaag 40
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<213> 人工合成
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accaggtctc aaggtatgac caccactgcc caag 34
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accaggtctc acgattcaaa cctttgcgcc ggtg 34
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<213> 人工合成
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accaggtctc aaggtatggc tggtgaaact tttgaatttc 40
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accaggtctc acgatttaat caacttcttc catctcggtg 40
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<212> DNA
<213> 人工合成
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accaggtctc aaggtatgtc ccgtgaccta caaaaccatt tg 42
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<211> 42
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<213> 人工合成
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accaggtctc acgatttaac tgtcatcagc atatgggcca tc 42
<210> 58
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<212> DNA
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accaggtctc aaggtatgaa gttccaagtt gttttatctg cc 42
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accaggtctc acgattcatg ggaaaatgct ttccagag 38
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<213> 人工合成
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accaggtctc aaggtatgtc tgctgttaac gttgcacctg aattg 45
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<213> 人工合成
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accaggtctc acgatttaac caatcaactc accaaacaaa aatggggtg 49
<210> 62
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accaggtctc aaggtatgca attctctacc gtcg 34
<210> 63
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<213> 人工合成
<400> 63
accaggtctc acgatttaca acaataaagc ggcagc 36
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<213> 人工合成
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accaggtctc aaggtatgca attacattca cttatcgctt c 41
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<213> 人工合成
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accaggtctc acgatttaca ttatagacat gatgattgcc gtc 43
<210> 66
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<212> DNA
<213> 人工合成
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accaggtctc aaggtatgtt taagtctgtt gtttattcgg ttctagccgc 50
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<211> 56
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<213> 人工合成
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accaggtctc acgatttatt gttttaatag ggtatcgttg tagtgagtag tattcc 56
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accaggtctc aaggtatggg ctcaaaagta gcagg 35
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<213> 人工合成
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accaggtctc acgattcagc ttgtatctga gaattttctt ttcttattc 49

Claims (10)

1.一种酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株的命名为CE10，所述酿酒酵母菌株的保藏编号为CGMCC NO.24860。
2.一种发酵菌株的构建方法，其特征在于，包括将目的基因整合至权利要求1所述的酿酒酵母菌株的基因组中；所述目的基因选自MSN2、TIPI、YRB1或SPII；
其中，所述MSN2的序列如SEQ ID NO.1所示，所述TIPI的序列如SEQ ID NO.2所示，所述YRB1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述SPII的序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种发酵菌株的构建方法，其特征在于，包括先缺失权利要求1所述的酿酒酵母菌株的基因组中的CAT8基因，再以所述酿酒酵母菌株的基因组中的CAT8为整合位点，将目的基因整合至缺失CAT8基因后的所述酿酒酵母菌株的基因组中；所述目的基因选自MSN2、TIPI、YRB1或SPII；
其中，所述MSN2的序列如SEQ ID NO.1所示，所述TIPI的序列如SEQ ID NO.2所示，所述YRB1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述SPII的序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求3所述的发酵菌株的构建方法，其特征在于，所述将目的基因整合至缺失CAT8基因后的所述酿酒酵母菌株的基因组中的步骤包括：将含有所述目的基因的线性片段整合至缺失CAT8基因后的所述酿酒酵母菌株的基因组中，并使所述目的基因过表达。
5.一种发酵菌株，其特征在于，采用如权利要求2-4中任一项所述的发酵菌株的构建方法制得。
6.一种生产生物乙醇的方法，其特征在于，包括在含有木糖的培养体系中发酵培养如权利要求1或5所述的菌株。
7.根据权利要求6所述的生产生物乙醇的方法，其特征在于所述木糖在所述培养体系中的浓度为30-50g/L。
8.根据权利要求6所述的生产生物乙醇的方法，其特征在于所述培养体系中还含有葡萄糖。
9.根据权利要求8所述的生产生物乙醇的方法，其特征在于所述葡萄糖在所述培养体系中的浓度为70-100g/L。
10.根据权利要求6所述的生产生物乙醇的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为30-35℃。
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