CN101942435A - 一种发酵木糖产乙醇的重组酿酒酵母及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种发酵木糖产乙醇的重组酿酒酵母及其构建方法。本发明通过在酿酒酵母中导入博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)代谢木糖相关酶的编码基因的DNA片段，使酿酒酵母能够分泌表达木糖异构酶，这种酶的酶促反应条件与酿酒酵母的生长条件接近，从而重组的酿酒酵母能够有效利用木糖生产乙醇，解决了酿酒酵母不能利用木糖生产乙醇这一技术难题。本发明为酿酒酵母在发酵木糖产乙醇的工业应用奠定了基础，具有重要的经济效益和社会效益。

Description

一种发酵木糖产乙醇的重组酿酒酵母及其构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种发酵木糖产乙醇的重组酿酒酵母，以及该重组菌的构建方法和用途。

背景技术

石油等化石燃料价格的不断上涨与存储的日益减少，废气的排放，环境保护与可持续性和谐发展等等问题，迫使人们寻找一种环境友好型的可再生能源。生物乙醇作为一种可再生的清洁能源无疑可以解决这一问题。然而传统方法是利用淀粉等粮食作物生产乙醇，原料价格较高，而且还产生“与人争粮”的矛盾。木质纤维素是世界上最丰富的生物质资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素构成。若能充分利用木质纤维素的水解产物——木糖发酵生产乙醇，能使乙醇产量增加25％。因此，利用木质纤维素等可再生生物质资源经酶水解产生的木糖生产乙醇具有重大的经济价值和社会意义。

目前，工业上主要利用酿酒酵母发酵葡萄糖生产乙醇，但其不能利用木糖供自身生长，也不能发酵木糖产乙醇，原因是酿酒酵母缺乏使木糖转变成木酮糖的代谢途径。因此，便无法发酵植物纤维水解液木糖生产乙醇，但酿酒酵母能够利用木酮糖并生产乙醇。

微生物代谢木糖要使其先转化为异构体木酮糖以便进入戊糖磷酸途径(PPP)。自然界中发酵木糖有两条途径：1.在某些细菌中，通过木糖异构酶(XI)直接将木糖转化为木酮糖；2.在某些酵母菌中，木糖首先在木糖还原酶(XR)的作用下被还原为木糖醇，然后在木糖醇脱氢酶(XDH)的作用下生成木酮糖，木酮糖再经木酮糖激酶(XK)作用生成5-磷酸木酮糖，由此进入PPP途径。

目前构建能够代谢木糖并生产乙醇重组酿酒酵母有2种方法：1.在酿酒酵母中引入木糖异构酶基因；2.在酿酒酵母菌中引入木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因。代谢途径如图1所示。

在酿酒酵母引入木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因，可使木糖转变为木酮糖生产乙醇。此重组酿酒酵的母缺点是：1.在发酵过程中，木糖代谢缓慢，残木糖高达1％；2.木糖醇在发酵过程中容易造成堆积，增加了对细胞的毒性，不利于酵母生长。

但在酿酒酵母引入木糖异构酶基因后可一步实现从木糖到木酮糖的转化，并生产乙醇，且不会产生过量的木糖醇抑制酵母生长的现象。该研究涉及在酿酒酵母中引入木糖异构代谢途径，木糖异构酶可将木糖异构化为木酮糖，酿酒酵母可利用木酮糖进入PPP途径生产乙醇。但目前仅涉及细菌木糖异构酶，该酶最适酶促反应温度为85℃，最适作用pH为7.0。在酿酒酵母的生长及生产乙醇条件下(如温度25℃～35℃及pH4.0～6.5)，细菌类木糖异构酶不具有酶活性，其结果是无法将木糖转变成可利用的木酮糖。到目前为止，还没有有关解决该技术问题的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足，提供一种重组酿酒酵母，该酿酒酵母能够发酵木糖产乙醇。

本发明的第二个目的，在于提供上述重组酵母的构建方法。

本发明的再一个目的是将该重组酵母用于乙醇的大规模发酵，以降低成本。

为实现上述目的，本发明将酶促反应与酿酒酵母生长及产乙醇条件接近的木糖异构酶引入到酿酒酵母中，从而使酿酒酵母能够具有发酵木糖并生产乙醇的能力。这种木糖醇异构酶的酶促条件宜在25℃～45℃，pH4.0～6.5。

本发明通过对真菌木糖异构酶进行大规模筛选，意外发现博伊丁假丝酵母木糖异构酶符合这种要求。在此基础上，本发明把含有博伊丁假丝酵母木糖异构酶的基因片段引入酿酒酵母并实现发酵木糖产乙醇的目的。

从而，本发明提供一种表达木糖异构酶的重组酿酒酵母，所述木糖异构酶的酶促条件为25℃～45℃，pH4.0～6.5。优选，所述木糖异构酶为博伊丁假丝酵母木糖异构酶。

本发明还提供一种构建上述重组酿酒酵母的方法，其包括如下步骤：

1.构建含博伊丁假丝酵母木糖异构酶基因(xylA)文库。酶切片段化博伊丁假丝酵母基因组DNA，回收10～12Kb大小的片段；构建含ARS序列的质粒，将回收的片段***所述质粒中；转化感受态宿主菌，挑选阳性克隆，得到含有博伊丁假丝酵母木糖异构酶基因的文库。

2.转化酿酒酵母并筛选阳性克隆。提取构建好的含有木糖异构酶基因文库的质粒转化酿酒酵母感受态细胞，涂布在木糖作为唯一碳源的培养平板上，筛选能够生长的菌落，即得到表达木糖异构酶的重组酿酒酵母。这是由于转化了木糖异构酶基因的重组酿酒酵母能够利用木糖作为碳源进行生长，而其它酿酒酵母则不能生长。

在以上步骤中，用于片段化博伊丁假丝酵母基因组DNA的酶优选是MboI和Bgl II，而ARS序列则优选为酿酒酵母自身的ARS序列。

当然，本领域技术人员还可以根据博伊丁假丝酵母木糖异构酶基因的两侧序列设计相关引物，获得xylA基因，将该基因克隆到适当的载体中，转化酿酒酵母，得到重组酿酒酵母。

因而，本发明还包括一种含有酵母ARS以及上述木糖异构酶基因的重组DNA片段以及含有该重组DNA片段的表达载体。

具体而言，本发明通过以下步骤实现：1.博伊丁假丝酵母能够代谢木糖特性的鉴定：将博伊丁假丝酵母接种于YPD(Y：yeast extract，P：peptone，D：glucose)培养基上活化，然后接种于仅以木糖为唯一碳源的YP平板上培养，能够生长说明博伊丁假丝酵母能够代谢木糖。2.发酵木糖时木糖醇含量的测定：将上述菌接种于仅含有以木糖为碳源的液体YP培养基中发酵，经匀浆破碎细胞离心获得上清夜，取上清100℃煮沸，再离心去蛋白，离心后的上清液经液相色谱检测，未检测出木糖醇。3.木糖异构酶的分离纯化及酶特性研究：将上述的酵母接种于YPD液体培养基中经发酵、纯化，特异性检查纯化产物对木糖、葡萄糖等的偏好以及pH、温度对木糖异构酶的影响。4.酿酒酵母ARS的克隆：以1μg酿酒酵母基因组为模板，以ARS两端序列设计引物。上游引物为AF：5′-ATTCCACTCCACTCCACG-3′下游引物为AR：5′-GCCACTACCGTATTATAGCTCA-3′PCR反应在50μL总体积中进行。5.pUC18-ARS(pA)质粒的构建：将pUC18质粒分别进行Smal I酶切和去磷酸化，然后连接ARS的PCR产物(16℃，16h)，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒PCR验证，并进行DNA序列的鉴定，构建pA质粒。6.含有博伊丁假丝酵母木糖异构酶基因(xylA)文库的建立：提取博伊丁假丝酵母基因组DNA，用MboI和Bgl II酶切，回收10.0-12.0Kb的DNA片段。提取pA质粒并进行BamHI酶切和去磷酸化，连接经MboI和Bgl II酶切获得的10.0-12.0Kb的博伊丁假丝酵母基因组DNA片段(16℃，16h)。连接产物转化DH5α感受态细胞，挑选所有阳性克隆子，建立含有博伊丁假丝酵母木糖异构酶基因的文库。7.转化酿酒酵母并筛选：制备酿酒酵母感受态细胞，提取构建好的含有木糖异构酶基因文库的质粒转化酿酒酵母感受态细胞，涂布在1％木糖作为唯一碳源的培养平板上，30℃培养2～3d，筛选在该平板上生长的菌落。8.重组酿酒酵母共发酵葡萄糖和木糖：将筛选到的重组酵母活化，并在有氧条件下培养种子细胞，然后以葡萄糖和木糖(10％葡萄糖和5％木糖)的混合物为碳源进行微氧发酵，发酵温度为25～32℃，pH为4.0～6.0，并分别测定葡萄糖和木糖的消耗量及乙醇产量。

实验表明，本发明构建得到的重组酿酒酵母能够在其生长条件下发酵木糖并能生产乙醇。本发明为酿酒酵母在发酵木糖产乙醇的工业应用中奠定了基础，具有重要的经济效益和社会效益。

附图说明

图1显示的是已知的两种木糖代谢途径；

图2显示的是本发明木糖代谢途径；

图3为木糖异构酶纯化的SDS-PAGE电泳图；

图4显示的是不同温度对木糖异构酶活性影响；

图5显示的是不同pH对木糖异构酶活性影响；

图6为野生型酿酒酵母共发酵木糖及葡萄糖产乙醇曲线图；

图7为重组酿酒酵母共发酵木糖及葡萄糖产乙醇曲线图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。

实施例1  博伊丁假丝酵母代谢木糖特性的鉴定

将博伊丁假丝酵母(Candida boidinii CGMCC 2.1645，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种于YPD培养基上30℃培养活化，然后接种于以木糖为唯一碳源的YP(不含葡萄糖)平板培养基上，培养2～3d，结果平板上的菌株均可利用木糖生长。挑取平板上菌落最大的细胞接种于仅含有木糖为唯一碳源的YP液体培养基中，在25～32℃，pH4.0～6.0条件能够生长。说明博伊丁假丝酵母可以代谢木糖。

实施例2  木糖发酵时木糖醇含量的测定

按实施例1的条件发酵木糖，匀浆破碎细胞，5000转5min离心获得上清液，取10mL上清液100℃煮沸5min，离心去蛋白，离心后的上清液用作色谱检测。Agilent HPLC 2D色谱工作站：色谱柱为ZORBAX碳水化合物，柱温30℃，流动相为乙腈∶水(80∶20(V/V))，流速1.5mL/min，示差折光检测器检测。木糖醇在0.3～50.0mg/mL范围内检测良好。结果显示未检测出木糖醇。

实施例3  木糖异构酶的分离纯化及酶特性

将活化的博伊丁假丝酵母接种于含1％木糖的YPD液体培养基中，在25～32℃，pH4.0～6.0条件下发酵，获得发酵液进行纯化。

1.纯化：①.将发酵液pH调到7.0，滴加2％的硫酸鱼精蛋白，静置30min，离心去沉淀。②.在pH7.0条件下添加30％的硫酸铵，溶解后静置1h，离心去除杂蛋白，然后再添加硫酸铵使饱和度为80％，4℃静置过夜，离心收集沉淀，重新溶于少量缓冲液中。③.将上述浓缩的酶液上样到DEAE-Sepharose柱层析中，活性部分被0.1M NaCl洗脱下来进一步浓缩。④.将步骤③中的样品经sephacryl S-200凝胶过滤纯化，纯化产物SDS-PAGE电泳鉴定。

2.酶特性检测：①.在反应体系中分别加入20μg的纯化产物，再分别以浓度相同的木糖、葡萄糖、核糖、麦芽糖、半乳糖为底物，其酶促反应产物相应为木酮糖、果糖、核酮糖、蔗糖等。以木糖为参照，确定木糖异构酶的最适底物特。结果该酶的最适底物为木糖，见表1。②.取20μg的纯化产物，以5℃为梯度，在20～55℃下研究不同温度对木糖异构酶活性影响，结果在25～45℃下该酶活性较高，见图4。③.将20μg的纯化产物置于不同pH值的缓冲液中，以1℃为梯度，在pH4.0～8.0下研究不同pH对木糖异构酶活性影响，结果在pH4.0～6.0下该酶有活力，见5。

表1  木糖异构酶的底物特异性

实施列4：ARS基因的克隆

1.酿酒酵母基因组的制备：按照酵母抽提试剂盒的方法。

2.ARS的克隆：以1μg酿酒酵母基因组为模板，以其ARS两端序列设计引物扩增ARS。上游引物为AF：5′-ATTCCACTCCACTCCACG-3′下游引物为AR：5′-GCCACTACCGTATTATAGCTCA-3′，PCR反应体系为50μL∶2μLgDNA，1μL引物AF，1μL引物AR，5μL d NTP，5μL 10×Pfu缓冲液，0.5μL pfu聚合酶，ddH₂O 35.5μL。PCR反应条件为95℃2min，(94℃50sec，50℃45sec，72℃90sec)共30个循环，再于72℃延伸10min，电泳验证。

实施例5：pA质粒的构建

1.pUC18质粒酶切：将pUC18质粒进行Sma I酶切，酶切体系为50μL：pUC18质粒5μL，10×Sma I酶缓冲液5μL，Sma I酶1μL，补ddH₂O至反应终体积为50μL，37℃酶切过夜，标准乙醇沉淀法回收酶切片段。

2.酶切质粒的去磷酸化：pUC18酶切质粒20μL，10×CIAP缓冲液5μL，CIAP酶1μL，补ddH₂O至终体积为50μL。于37℃反应3h后，加入150μL ddH₂O，然后用用酚/氯仿抽提，溶于20μL TE中，备用。

3.pA质粒的构建：在20μL的连接体系中，经Sma I线性化的pUC18质粒与ARS片段各5μL，2μL 10×T₄ DNA连接酶缓冲液，1μLT₄DNA连接酶，补ddH₂O至终体积为20μL，16℃，16-24h连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，涂板，挑选阳性克隆子，少量提取质粒后以AF和AR为引物进行PCR验证，构建好的质粒命名为pA。保存阳性克隆子，培养后提取质粒送交测序。

实施例6：含有博伊丁假丝酵母木糖异构酶基因文库的建立

1.木糖异构酶基因库的获得：将博伊丁假丝酵母接种于YPD培养基上30℃活化，挑取适量接种于液体YPD培养基中培养，按照实施例3中的方法提取基因组DNA。以MboI酶对其基因组进行酶切，酶切体系为50μL：基因组5μL，10×MboI酶缓冲液5μL，NEB MboI酶1μL，补ddH₂O至终体积为50μL。缓慢混匀后置于37℃水浴中酶切12h。酶切完毕后置于65℃水浴中热失活20min，回收全部片段。再以Bgl II酶对其酶切，酶切体系为50μL：基因片段5μL，10×Bgl II酶缓冲液5μL，NEB Bgl II酶1μL，补ddH₂O至终体积为50μL。混匀后置于37℃水浴中酶切12h。酶切完毕后加入EDTA终止反应，回收10.0Kb-12.0Kb之间的DNA片段，-20℃保存。

2.构建：①.将含有pA质粒的E.coli DH5α经培养后提取其质粒，并进行BamHI酶切，酶切体系为50μL：pA质粒10μL，10×BamHI酶缓冲液5μL，BamHI酶1μL，补ddH₂O至终体积为50μL，37℃酶切过夜，标准乙醇沉淀法回收。②.pA酶切质粒的去磷酸化：方法同实施例4。③.含有博伊丁假丝酵母木糖异构酶基因文库的建立：在20μL连接体系中含有5μL经BamH I线性化的pA质粒和5μL经MboI与Bgl II酶切后10.0-12.0Kb的基因组DNA片段，2μL 10×T₄DNA连接酶缓冲液，1μL T₄ DNA连接酶，补ddH₂O至终体积为20μL，在16℃条件下连接过夜，转化DH5α，挑选所有阳性克隆，构建含有木糖异构酶基因的博伊丁假丝酵母基因文库。

实施例7：酿酒酵母发酵木糖菌株SC-pAX的构建、筛选

1.SC-pAX菌株的构建：将酿酒酵母(ACCC 20040，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心)接种于YPD平板上，30℃培养活化并挑取适量接种于YPD液体培养基中，制备感受态细胞并转化：①.30℃下培养酵母细胞16～18h，使OD₆₀₀在0.2～0.3之间。②.20℃，4500转，5min，弃上清，灭菌ddH₂O洗涤，用1mL 1×TE-LiAc(0.1mL10×LiAc，0.1mL 10×TE，0.8mL ddH₂O)重悬，30℃下培养。③.取实施例6中的含有木糖异构酶基因的博伊丁假丝酵母基因文库，DNA含量为5μg，加200μL试验步骤2中的细胞，混匀，加入100μL10×LiAc，100μL 10×TE，800μL 50％PEG4000，振荡混匀。④.30℃培养0.5h，42℃水浴15min后冰上放置1～2min。⑤.离心去上清，0.5mL ddH₂O洗涤混匀。⑥.离心去上清，用1.0mL ddH₂O重悬并稀释涂布在仅含有1％木糖为唯一碳源的YP平板上(Y：yeast extract，P：peptone)30℃培养2～3d。

2.SC-pAX菌株的筛选：经培养后在平板上生长出多个菌落，观察在平板上培养2-3d的重组酿酒酵母细胞，挑选在平板上生长最大的菌落，说明该菌落能够较好地代谢木糖，该菌落被命名为SC-pAX。

实施例8：重组酿酒酵母共发酵葡萄糖和木糖

把筛选到的能够发酵木糖的重组酵母划到YPD平板上活化，并在有氧条件下培养种子细胞。然后以葡萄糖和木糖(10％葡萄糖和5％木糖)的混合物为底物，再分别接种酿酒酵母和重组酿酒酵母SC-pAX进行厌氧发酵，发酵温度控制在30℃，pH为5.0，然后分别测定葡萄糖和木糖的消耗量及乙醇产量。结果如图6和7所示，重组酿酒酵母能够在上述条件下发酵木糖并能生产乙醇，但木糖的代谢速度要低于葡萄糖。而对照组酿酒酵母没有代谢木糖并生产乙醇的能力。

序列表

<110>安徽丰原发酵技术工程研究有限公司

<120>一种发酵木糖产乙醇的重组酿酒酵母及其构建方法

<130>KHP09113769.6

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

attccactcc actccacg                                            18

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gccactaccg tattatagct ca                                       22

Claims (8)

1.一种重组DNA片段，其含有酵母ARS序列以及木糖异构酶基因，所述木糖异构酶的酶促条件为25℃～45℃，pH4.0～6.5。

2.如权利要求1所述的重组DNA片段，其中所述木糖异构酶为博伊丁假丝酵母木糖异构酶。

3.含有权利要求1所述的重组DNA片段表达载体。

4.由权利要求3所述表达载体转化的重组酿酒酵母。

5.一种构建重组酿酒酵母的方法，其包括如下步骤：

1)构建含博伊丁假丝酵母木糖异构酶基因文库

酶切片段化博伊丁假丝酵母基因组DNA，回收10～12Kb大小的片段；构建含酵母ARS序列的质粒，将回收的片段***所述质粒中；转化感受态宿主菌，挑选阳性克隆，得到含有博伊丁假丝酵母木糖异构酶基因的文库；

2)转化酿酒酵母并筛选阳性克隆

提取构建好的含有木糖异构酶基因文库的质粒转化酿酒酵母感受态细胞，涂布在木糖作为唯一碳源的培养平板上，筛选能够生长的菌落，即得到表达木糖异构酶的重组酿酒酵母。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于用于酶切片段化博伊丁假丝酵母基因组DNA的酶为MboI和Bgl II。

7.由权利要求5或6所述方法获得的重组酿酒酵母。

8.权利要求4或7所述重组酿酒酵母在发酵木糖产乙醇中的应用。

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