CN105087450A

CN105087450A - 一株海洋细菌及其产生的胞外多糖

Info

Publication number: CN105087450A
Application number: CN201510630852.3A
Authority: CN
Inventors: 张子莲; 焦念志; 蔡阮鸿
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2035-09-29
Also published as: CN105087450B

Abstract

一株海洋细菌及其产生的胞外多糖，涉及一株海洋细菌。所述一株海洋细菌Alteromonase？marina？P2-B12，保藏中心登记入册编号：CGMCC？No.11180。一株海洋细菌Alteromonase？marina？P2-B12制备胞外多糖的方法：1)菌株培养；2)多糖的提取及脱盐；3)分离纯化。制备所得的海洋细菌胞外多糖的分子量大于167kDa，海洋细菌胞外多糖由鼠李糖、甘露糖和半乳糖醛酸以α-1，3和α-1，4键结合构成结构单元([-3]-α-Rhap-(1→3)-α-Manp-(1→4)-α-GalAp-(1→))。

Description

一株海洋细菌及其产生的胞外多糖

技术领域

本发明涉及一株海洋细菌，尤其是涉及一株海洋细菌及其产生的胞外多糖。

背景技术

细菌普遍合成分泌胞外多糖。胞外多糖是细菌的次级代谢产物,是细菌生长过程中分泌到细胞壁外形成与菌体分离的可溶性多糖复合物。海洋细菌因其独特的生活环境,分泌的胞外多糖常常具有特殊结构，因此，海洋细菌生产的胞外多糖在生物技术领域中具有极大的潜在应用价值。已有一些胞外多糖生产菌从不同的海洋环境中被分离，例如从深海热液泉口，海洋火山和热液区，以及浅海海底温泉发现了丰富的胞外多糖生产菌(Poli，2010)。从浅海热泉分离出的Bacillus属的菌株产生的多糖可以抗病毒(Gugliandolo，2014)。从北极海冰中分离的Pseudoalteromonas细菌合成的多糖具有抗冻特性(GugliandoloC,SpanòA,LentiniV,ArenaA,MaugeriTL.2014，Antiviralandimmunomodulatoryeffectsofanovelbacterialexopolysaccharideofshallowmarineventorigin.JApplMicrobiol.116(4):1028-34)。

近几年,随着对微生物多糖研究的深入,世界上微生物多糖产量的年增长量在10％以上,而一些新型多糖年增长量在30％以上,现在世界上每年多糖总需求量在100万吨以上,总价值50～100亿美元。因此,多糖的生产具有巨大的市场价值。然而，当前被应用于实际生产中的细菌多糖非常有限。因此,有必要筛选、分离新的多糖产生菌,并对它们所产多糖的结构、物理化学特性进行深入探究,以进一步拓展它们的应用领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一株海洋细菌AlteromonasemarinaP2-B12。

本发明的另一目的在于提供一株海洋细菌AlteromonasemarinaP2-B12制备具有新颖结构并安全无毒的胞外多糖的方法。

所述一株海洋细菌AlteromonasemarinaP2-B12，已于2015年08月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.11180。

本发明的海洋细菌AlteromonasemarinaP2-B12是从海水样品中分离得到的，海水采集于2012年8月，经度115°E,纬度18°N，水深75m；将采集的海水100μL吸取涂布于平板，放置室温培养。待培养3天后，随机从平板上挑取形态大小不同的菌落进行纯化培养。纯化时用接种环挑取菌落，在平板表面进行划线，观察平板上菌株的颜色、大小、形态是否相同.挑取不同的菌落划线分离，直到分离出单一形态的菌落为止。通过苯酚-硫酸法对所得菌株培养上清液是否产多糖进行检测,初筛多糖产量超过100mg/L,得到该产多糖菌株。该菌株的特征为：AlteromonasemarinaP2-B12为革兰氏阴性菌,长杆状,在2216E固体培养基菌落较大(直径2mm)，乳白色，圆形，***，边缘较圆整,不透明,无迁移性。

本发明通过DNA序列分析确定了其种属关系,属于交替单胞菌属Alteromonase。该菌株16SrRNA序列见说明书最后部分。

所述一株海洋细菌AlteromonasemarinaP2-B12制备胞外多糖的方法，具体步骤如下：

1)菌株培养

以工业葡萄糖为单一碳源添加到人工海水里进行培养，培养基的具体配方为(1L)：葡萄糖10.0g/L、氯化钠19.0g/L、氯化氨0.3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、氯化钾0.3g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、七水合氯化钙0.03g/L，pH7.6；

将AlteromonasemarinaP2-B12接种到培养基摇床培养，得种子培养液；

另配制培养基，放入发酵罐中，灭菌，待温度降到25℃，接入种子培养液培养,得发酵液；

2)多糖的提取及脱盐

将发酵液离心,取上清液，上清液过滤，滤液中加入无水乙醇，静置过夜,然后将粘稠的菌多糖移入离心管中，加入冰冻无水乙醇浸洗，将沉淀收集，冻干，即得菌多糖的提取物，再溶解到水中，移入透析袋，将透析袋悬挂到水中，透析过夜，透析过的菌多糖溶液加入冰冻乙醇再沉淀，冻干，透析除盐后的菌多糖样品即为多糖粗提物；

3)分离纯化

利用离子交换层析对多糖粗提物进行纯化，收集主峰，将收集到的主峰浓缩脱盐、冷冻干燥，即得海洋细菌胞外多糖。

在步骤1)中，所述摇床培养的条件可为25℃，180rpm，摇床培养过夜；所述灭菌的条件可为120℃灭菌30min；所述种子培养液的接种量按体积百分数可为1％；所述接入种子培养液培养可为25℃，500rpm/min培养94h。

在步骤2)中，所述离心的条件可在8000rpm离心20min；所述过滤可采用0.45μm滤膜(MilliporeHAWP04700)过滤；所述滤液中加入无水乙醇可加入按体积比3倍滤液的无水乙醇；所述静置过夜的温度可为4℃；所述将粘稠的菌多糖移入离心管可采用玻璃棒缠取粘稠的菌多糖移入50mL离心管中；所述浸洗可加入质量百分浓度为75％的冰冻无水乙醇浸洗3次；所述透析袋可采用直径16mm，截留分子量3500道尔顿的透析袋；所述加入冰冻乙醇再沉淀可加入按体积比3倍菌多糖溶液体积的冰冻乙醇再沉淀。

在步骤3)中，所述离子交换层析的条件可为：层析柱规格为1.6cm×30cm，凝胶类型为DEAE-SepharoseFastFlow，用0～2MNaCl进行梯度洗脱，流速为1mL/min。

本发明制备所得的海洋细菌胞外多糖的分子量大于167kDa，海洋细菌胞外多糖由鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)和半乳糖醛酸(GalA)以α-1，3和α-1，4键结合构成结构单元([-3]-α-Rhap-(1→3)-α-Manp-(1→4)-α-GalAp-(1→))。该海洋细菌胞外多糖的糖基组成和糖苷键连接方式与其它已报道的多糖都不相同,是一种新颖的胞外多糖。

附图说明

图1为AlteromonasemarinaP2-B12透射电镜图。在图1中，a的标尺为200nm，b的标尺为0.2μm。

图2为基于16SrRNA的P2-B12进化树分析。

图3为梯度洗脱收集得到的主峰示意图。

图4为洗脱得到的洗脱峰示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1菌株的获得

本发明的菌株是通过以下方法筛选得到的:海水采集于2012年8月，经度115°E,纬度18°N，水深75m。将采集的海水100μL吸取涂布于2216E平板。2216E培养基:蛋白胨5.0g,酵母膏1.0g,磷酸铁0.01g,琼脂20.0g,人工海水1000ml,调ph至7.6。放置室温培养。待培养3天后，随机从平板上挑取形态大小不同的菌落进行纯化培养。纯化时用接种环挑取菌落，在平板表面进行划线，观察平板上菌株的颜色、大小、形态是否相同.挑取不同的菌落划线分离，直到分离出单一形态的菌落为止。通过苯酚-硫酸法对所得菌株培养上清液是否产多糖进行检测,初筛多糖产量超过100mg/L,得到该产多糖菌株。

该菌株的特征为:AlteromonasemarinaP2-B12为革兰氏阴性菌,长杆状(图1),在2216E固体培养基菌落较大(直径2mm),乳白色,圆形,***,边缘较圆整,不透明,无迁移性。16SrRNA基因分析。

提取AlteromonasemarinaP2-B12基因组DNA，进行16SrRNA基因扩增。16SrRNA基因序列扩增引物为：正向引物27f(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)，反向引物1492r(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)。16SrRNA基因扩增的PCR反应体系(50μL)：PremixExTaq酶(5U/μL)25μL、正向引物1μL(10μmol/L)、反向引物1μL(10μmol/L)、模板DNA1μL和无菌水22μL。PCR目标序列扩增程序设置为：95℃预变性5min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。

此PCR产物后进行测序。通过对菌株P2-B12的16SrRNA基因序列比对分析发现，该菌株与AlteromonasmarinaSW-47^T(AF529060)相似性最高。因此，此菌株命名为AlteromonasmarinaP2-B12。该菌株16SrRNA序列见说明书最后部分。

实施例2多糖的提取

多糖分子量的测定

利用高效液相色谱对多糖的分子量进行测定。采用分子排阻色谱柱对多糖进行分析。色谱柱色谱柱由TSKGelGS3000SW_XL凝胶层析柱(7.8mmID×30cm)和TSKGelG2000SW_XL凝胶层析柱(7.8mmID×30cm)串联而成，检测器为折射检测器。流动相是含有0.2‰叠氮化钠的0.1M的醋酸铵。柱体温度设为30℃，流速设为0.6mL/min。标准溶液包括不同分子量的葡聚糖(511，167，67，40，10，5，1kDa)和麦芽四糖(666.6Da)。不同分子量的多糖在分子排阻色谱柱的保留时间不同(见表1)。根据标准多糖的分子量与在柱中的保留时间的相关关系，计算出P2-B12多糖的分子量大于167kDa。

表1

多糖的结构分析

通过一系列的核磁共振分析，明确P2-B12胞外多糖由三种单糖鼠李糖(Rha),甘露糖(Man)和半乳糖醛酸(GalA)组成，这三种糖以α-1，3和α-1，4键结合构成a[-3]-α-Rhap-(1→3)-α-Manp-(1→4)-α-3OAc-GalAp-(1→)结构单元。

16SrRNA序列：

GAGTTTGATCCTGGCTCAGGTTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCA

AGTCGAACGGTAACATTTCTAGCTTGCTAGAAGATGACGAGTGGCGGACG

GGTGAGTAATGCTTGGGAACTTGCCTTTGCGAGGGGGATAACAGTTGGAA

ACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTTCGGACCAAACGGGGCTTCGGCTC

CGGCGCAAAGAGAGGCCCAAGTGAGATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGC

TTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGTTCTGAGAGGAAGATCAGCCACACT

GGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT

TGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGG

CCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTTGTGAGGAAAAGTTAGTAGTTAAT

ACCTGCTAGCTGTGACGTTAACAACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTG

CCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGG

GCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGCTAGATGTGAAAGCCCCGGG

CTCAACCTGGGATGGTCATTTAGAACTGGCAGACTAGAGTCTTGGAGAGG

GGAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAAC

ATCAGTGGCGAAGGCGACTCCCTGGCCAAAGACTGACGCTCATGTGCGAA

AGTGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAAC

GCTGTCTACTAGCTGTGTGTGCCTTTAAGGCGTGCGTAGCGAAGCTAACG

CGCTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATG

AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGC

AACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATGCTGAGAAGTTACTAGAGAT

AGTTTCGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCA

GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG

TCCTTAGTTGCCAGCCTTAAGTTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGAC

AAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGT

AGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATTTACAGAGGGAAGCGAGACAGTG

ATGTGGAGCGGACCCCTTAAAGAATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCA

ACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGAATACTG

CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGA

GTGGGATGCAAAAGAAGTAGTTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGATTACCA

CTTTGTGTTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCA。

Claims

1.一株海洋细菌AlteromonasemarinaP2-B12，已于2015年08月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.11180。

2.如权利要求1所述一株海洋细菌制备胞外多糖的方法，其特征在于其具体步骤如下：

1)菌株培养

以工业葡萄糖为单一碳源添加到人工海水里进行培养，培养基的具体配方为：葡萄糖10.0g/L、氯化钠19.0g/L、氯化氨0.3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、氯化钾0.3g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、七水合氯化钙0.03g/L，pH7.6；

2)多糖的提取及脱盐

3)分离纯化

3.如权利要求2所述一株海洋细菌制备胞外多糖的方法，其特征在于在步骤1)中，所述摇床培养的条件为25℃，180rpm，摇床培养过夜。

4.如权利要求2所述一株海洋细菌制备胞外多糖的方法，其特征在于在步骤1)中，所述灭菌的条件为120℃灭菌30min。

5.如权利要求2所述一株海洋细菌制备胞外多糖的方法，其特征在于在步骤1)中，所述种子培养液的接种量按体积百分数为1％。

6.如权利要求2所述一株海洋细菌制备胞外多糖的方法，其特征在于在步骤1)中，所述接入种子培养液培养为25℃，500rpm/min培养94h。

7.如权利要求2所述一株海洋细菌制备胞外多糖的方法，其特征在于在步骤2)中，所述离心的条件是在8000rpm离心20min；所述过滤可采用0.45μm滤膜过滤；所述滤液中加入无水乙醇可加入按体积比3倍滤液的无水乙醇；所述静置过夜的温度可为4℃。

8.如权利要求2所述一株海洋细菌制备胞外多糖的方法，其特征在于在步骤2)中，所述将粘稠的菌多糖移入离心管采用玻璃棒缠取粘稠的菌多糖移入50mL离心管中；所述浸洗可加入质量百分浓度为75％的冰冻无水乙醇浸洗3次。

9.如权利要求2所述一株海洋细菌制备胞外多糖的方法，其特征在于在步骤2)中，所述透析袋采用直径16mm，截留分子量3500道尔顿的透析袋；所述加入冰冻乙醇再沉淀可加入按体积比3倍菌多糖溶液体积的冰冻乙醇再沉淀。

10.如权利要求2所述一株海洋细菌制备胞外多糖的方法，其特征在于在步骤3)中，所述离子交换层析的条件为：层析柱规格为1.6cm×30cm，凝胶类型为DEAE-SepharoseFastFlow，用0～2MNaCl进行梯度洗脱，流速为1mL/min。