CN103966109B

CN103966109B - 一株产原儿茶醛的五味子内生真菌

Info

Publication number: CN103966109B
Application number: CN201410222209.2A
Authority: CN
Inventors: 郑春英; 矫佳陈琦; 陆欣媛; 张萍
Original assignee: Heilongjiang University
Current assignee: Heilongjiang University
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2034-05-23
Also published as: CN103966109A

Abstract

一株产原儿茶醛的五味子内生真菌，它涉及一株内生真菌。本发明一株产原儿茶醛的五味子内生真菌为原儿茶醛原料的生产提供了新方法。产原儿茶醛的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillus？fumigatus)HWT5，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC？No:M2014131，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2014年4月16日。本发明中的烟曲霉HWT5，其次生代谢产物中含有原儿茶醛，可采用发酵法生产原儿茶醛，为原儿茶醛原料的生产提供新方法。

Description

一株产原儿茶醛的五味子内生真菌

技术领域

本发明涉及一株内生真菌。

背景技术

内生真菌的研究日益成为天然产物化学研究者关注的热点之一，内生真菌次级代谢产物的种类繁多，包括生物碱类、甾体类、萜类、苯并吡喃和苯并呋喃类、香豆素和异香豆素类、醌类、黄酮类、酚和酚酸类、内酯类、脂肪族化合物、氨基酸、肽类等，其药理活性广泛，主要表现为抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫、抗结核、抗氧化等作用。

五味子(SchisandraChinensis(Turcz.)Baill.)，木兰科多年生落叶木藤本植物，主产于东北，为北方濒危道地药材，果实入药。

烟曲霉是引起人类肺部感染非常重要的一种曲霉菌，有从泥土、海洋、植物中分离得到，其次生代谢产物多具有很强的生物活性，进行深入研究，对开展其在医药领域中的应用具有较好前景。

发明内容

本发明的目的是提供了一株产原儿茶醛的五味子内生真菌，为原儿茶醛原料的生产提供了新方法。

本发明一株产原儿茶醛的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2014131，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2014年4月16日。

本发明一株产原儿茶醛的五味子内生真菌，它在PDA固体培养基上培养，菌落初为白色，渐变为墨绿色，易生绿色粉末孢子粉，基质黄绿色，菌株顶部形成球状顶囊，其上全面覆盖一层一层小梗，分生孢子头球状。

本发明一株产原儿茶醛的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5，属于丝孢菌科(Hyphomycetaceae)曲霉属(Aspergillus)。

本发明一株产原儿茶醛的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5，依据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》，可见HWT5菌株的菌落特征和孢子形态与曲霉菌特征极为相近。

本发明一株产原儿茶醛的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5，其序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过MEGA6.0软件构建***进化树，HWT5菌株的序列与曲霉属菌，菌株的同源性都达到了99％以上，结合形态学观察结果，鉴定HWT5菌株为烟曲霉(AspergillusfumigatusHWT5)。

本发明从野生北五味子的藤茎中分离得到五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5，采用HPLC法对五味子内生真菌HWT5的发酵代谢产物进行测定，结果显示，五味子内生真菌HWT5次生代谢产物中含有原儿茶醛，该成分不仅具有广谱抗菌作用，而且还具有降低冠脉阻力，增加冠脉血流量，抑制二磷酸腺苷所致的血小板凝集，抗氧化等作用，是一种重要的医药原料、医药中间体。

本发明中的烟曲霉HWT5，其次生代谢产物中含有原儿茶醛，因此可采用本发明的烟曲霉HWT5发酵法生产原儿茶醛，为原儿茶醛原料的生产提供新方法。

本发明中的烟曲霉HWT5，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、化脓链球菌、粪肠球菌和白色念珠菌具有抑制作用。

附图说明

图1为具体实施方式一中烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5的菌落形态图；

图2为具体实施方式一中烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5的菌落形态图；

图3为具体实施方式一中烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5的18SrDNA的PCR产物的电泳图；

图4为具体实施方式一中烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5的***进化树图；

图5为具体实施方式一中原儿茶醛对照品的HPLC色谱图，其中1表示原儿茶醛；

图6为具体实施方式一中HWT5发酵液HPLC色谱图，其中1表示原儿茶醛；

图7为具体实施方式一中加原儿茶醛对照品后的HWT5发酵液的HPLC色谱图，其中1表示原儿茶醛。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一株产原儿茶醛的五味子内生真菌，它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2014131，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2014年4月16日。

本实施方式中烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5，它在PDA固体培养基上培养，菌落初为白色，渐变为墨绿色，易生绿色粉末孢子粉，基质黄绿色，菌株顶部形成球状顶囊，其上全面覆盖一层一层小梗，分生孢子头球状(如图1和2所示)。

本实施方式中烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5，其生长温度为28℃，生长pH值自然。

本实施方式中烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5，该菌株分离自健康的野生北五味子的藤茎，实验材料分别于2011年及2012年5月、7月、8月、9月采自黑龙江省帽儿山地区，并经黑龙江省中医研究院付克治研究员鉴定为木兰科植物五味子属SchisandraChinensis(Turcz.)Baill.的植株，样本现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药实验室；它按以下过程进行分离培养：

取健康的野生北五味子的藤茎，用水冲洗干净，取韧皮部，用75％的酒精浸泡3-5min，10％双氧水漂洗15min，无菌水冲洗4次，用无菌刀把藤茎韧皮部切成0.5cm的小块，然后将其置于马铃薯固体分离培养基，于28℃恒温培养3-7天，待其切口边缘长出菌落后，挑取菌丝转入马铃薯固体分离培养基多次划线分离纯化，将纯化后的菌株于斜面固体培养基上培养，4℃保存备用；另外把最后一次冲洗北五味子藤茎韧皮部的无菌水用无菌的涂布棒涂布在马铃薯固体分离培养基表面上，于28℃恒温培养，以此作为对照组。

马铃薯液体培养基：

马铃薯培养基(PDA)：每L由200g的马铃薯、20g的蔗糖和余量的水组成，pH自然，121℃高压灭菌30min；其中马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤。

马铃薯固体分离培养基：

马铃薯培养基(PDA)：每L由200g的马铃薯、20g的蔗糖，16g的琼脂粉和余量的水组成，pH自然，121℃高压灭菌30min；其中马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤。

斜面固体培养基：取5mL马铃薯固体培养基装于试管中，121℃高压灭菌30min后，铺成斜面冷却，以备保存菌种。

试验用主要仪器设备和试剂见表1；

表1

结果：

从健康的野生北五味子的藤茎中分离出内生真菌HWT5，并且阴性对照中对照平板和对照液体培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。

一、分子鉴定：

1、内生真菌HWT5的DNA提取：

将HWT5菌种划线接种于PDA平板上培养5d，从菌落上挑取适量的菌丝，转接到装有50mL马铃薯液体培养基的锥型瓶中，28℃,128r/min摇床培养4d。待菌丝球长到适量时，抽滤发酵液得菌丝体，25％乙醇漂洗2次，灭菌的去离子水冲洗2次，离心去上清液，冷冻干燥，低温保存备用。

(1)取低温保存备用的菌丝体10mg置于研钵中，加液氮研磨成粉末，加1.5mL离心管中。加入200μLBufferDigestion和2μL巯基乙醇，再加入20μLProteinaseK溶液，震荡混匀，56℃水浴1h至细胞完全裂解。

(2)加入100μLBufferPF，充分颠倒混匀，-20℃放置5min。

(3)室温10,000rpm离心5min，将上清转移到1.5mL离心管中。

(4)加入200μLBufferBD，充分颠倒混匀。

(5)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀。

(6)将吸附柱放入吸附管中，用移液器将溶液及半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再室温10,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

(7)将吸附柱放回收集管，加入500μLPWsolution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。

(8)将吸附柱放回收集管，加入500μLWashsolution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。

(9)将吸附柱重新放回收集管，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的Washsolution。

(10)取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μLTEBuffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

2、PCR扩增：

采用真菌通用引物扩增18SrDNA片段。采用真菌通用引物扩增，引物由上海生物工程有限公司合成。

NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC

NS6：GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC

PCR反应体系见表2

表2

试剂	体积(μL)
		10×buffer(with Mg²⁺)	2.5
dNTP(各2.5mmol/L)	1
		Taq酶	0.2
NS1(10μmol/L)	0.5
		NS6(10μmol/L)	0.5
Template(基因组DNA20-50ng/μL)	0.5
		加ddH₂O至	25

PCR循环条件见表3

表3

PCR产物检测：扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

在紫外灯下用解剖刀将目的条带切下，用DNA胶回收试剂盒回收，制备感受态大肠杆菌细胞，将PCR产物与pMD18-T载体进行连接后，连接产物加入到感受态细胞中，进行进行菌落PCR验证。挑取单菌落进行大肠杆菌转化子的PCR检测，证明目的片段已成功转化进入感受态细胞中后，将克隆阳性菌株送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。所测定的核苷酸序列在NCBI数据库中应用BLAST分析进行同源性比较，并根据分子***学研究的基本原理选择相应种属代表菌株的18SrDNA序列应用软件MEGA6.0构建***发育树，确定目标菌株的分类地位。

HWT5基因组经上海生工UNIQ-10柱式真菌基因组抽提试剂盒提取后，采用PCR扩增后凝胶成像结果如图3所示，在1323bp(碱基序列见表SEQIDNO：3)附近得到一扩增片段，证明已成功从HWT5菌株中提取出其基因组DNA。

HWT5菌株的序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过MEGA6.0软件构建***进化树(如图4所示)，HWT5菌株的序列与曲霉属菌，菌株的同源性都达到了99％以上，结合形态学观察结果，鉴定HWT5菌株为烟曲霉(AspergillusfumigatusHWT5)。

二、HWT5菌株的抑菌活性：

1、试验菌株：

(1)大肠杆菌(Scherichiacoli)

(2)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)

(3)金黄色葡萄球菌(StapHlococcusaureusRodenback)

(4)短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)

(5)铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa)

(6)肺炎克雷柏菌(Klebsiellapneumoniae)

(7)鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaummanii)

(8)单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)

(9)屎肠球菌(Enterococcusfaecium)

(10)粪肠球菌(Enterococcusfacalis)

(11)白色念珠菌(Candidaalbicans)

2、仪器和试剂：如下

3、方法：

3.1含试验菌株平板的制作

将12株试验菌株活化2-3次后，制成试管斜面，于恒温培养箱中培养1-2天，用血球计数板计数法，用接种环分别从每种试验菌株的斜面上刮取菌苔于5mL无菌水中，充分振荡摇匀后，滴一滴放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数，然后稀释到菌体浓度为1×10⁷CFU/mL，得到菌悬液；再按每100mL培养基中加入1mL菌悬液的比例向50℃培养基中加入菌悬液，混匀后，迅速的分装到灭菌后的空平板中，冷却，成含菌平板，备用。

3.2抑菌试验用培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂粉16g，水1000mL；加热至所有药品溶化后，定容至1000mL，调节pH7.0-7.2，121℃高压灭菌30min。

马铃薯培养基(PDA)：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉16g，水1000mL；马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤，再加入糖及琼脂，加热溶化后，定容至1000mL，pH自然，121℃高压灭菌30min。

3.3发酵液的制备

在PDA培养基上活化HWT5内生真菌，培养2-5天后，无菌操作挑取内生真菌菌丝接种于含50mL液体PDA培养基的100mL三角瓶中，28℃，140r/min摇床上培养7-10天，平行发酵3次，无菌操作下用八层灭菌后的纱布过滤，得到发酵液。

3.4菌饼法(内生真菌活性筛选)

用内直径0.6cm，外直径0.8cm的打孔器在已产孢的内生真菌的菌落边缘相同半径处制备菌饼，然后用无菌接种针挑取菌饼在每个含测试菌平板上接2个菌饼，各内生真菌对12种供试菌分别作3个平行；同时用PDA固体培养基作阴性对照，100u/mL链霉素做阳性对照；置于30℃下培养24小时，测量其抑菌圈直径(Ф)。

3.5滤纸片法(内生真菌发酵液抗菌活性测定)

用发酵液浸泡无菌滤纸片(Ф＝0.8cm)0.5小时后，平放于含菌平板上，每个平板上置2个发酵液浸过的滤纸片，各内生真菌对12种供试菌分别作3个平行；同时用PDA液体培养基作阴性对照，100u/mL链霉素溶液做阳性对照，在相同的条件下发酵；将制好的平板置于30℃下培养24小时，测量其抑菌圈直径(Ф)。

3.6结果

3.6.1菌饼法抑菌试验结果

采用菌饼法对分离得到的内生真菌进行抑菌试验，结果见表4。

表4

注：“-”：无活性，“+”：抑菌圈直径＜11mm，“++”：抑菌圈直径11-17mm，“+++”：抑菌圈直径＞17mm

3.6.2滤纸片法抑菌试验结果

采用滤纸片法对北五味子内生真菌代谢产物进行抑菌试验，结果见表5

表5

由表4和表5的抑菌实验结果可以看出，五味子内生真菌HWT5发酵液的抑菌活性不如菌体本身对12株供试菌的抑制活性，这可能是由于发酵液未经浓缩致使抑菌活性物质含量较低所致。

三、HWT5菌株的活性代谢物：

1、仪器和试剂：如下

2、方法

2.1HWT5活性代谢物的初步筛选：

2.1.1色谱条件

色谱柱：VenusilXBP-C₁₈柱(柱4.6mm×250mm，5μm，USA)；

流动相：甲醇-乙腈-水(36.5:36.5:27)；

流速：1mL/min；

柱温：25℃；

检测波长：254nm；

进样量：10μL。

2.1.2对照品溶液制备

精密称取原儿茶醛对照品适量，以甲醇制成1mg/mL的对照品储备液，精确量取对照品储备液1mL，置于5mL量瓶中用甲醇稀释至刻度，制成质量浓度为0.2mg/mL对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备

在PDA培养基上活化内生真菌HWT5，培养2-5天后，无菌操作挑取内生真菌菌丝接种于含50mL液体PDA培养基的100mL三角瓶中，28℃，140r/min摇床培养7-10天后，无菌操作下用八层灭菌后的纱布过滤，得到发酵液，冻干后备用。

精密称取冻干发酵液样品0.1g，准确加入4mL甲醇溶液，密闭超声30min，滤过，取2.5mL滤液稀释至5mL，即为供试品溶液。

2.1.4样品测定

在“2.1.1”色谱条件下，取对照品溶液和供试品溶液以0.45μm微孔滤膜过滤后，分别精密吸取10μL(3次平行)进样，测定。

2.2结果

2.2.1北五味子内生真菌HWT5活性代谢物的初步筛选

北五味子内生真菌HWT5发酵液中含有原儿茶醛，在“2.1.1”色谱条件下，供试品中对应原儿茶醛对照品溶液位置的其色谱峰保留时间与原儿茶醛对照品一致，而且色谱峰经过标准加入法得到了较好的确认，结果见5、6和7。在北五味子内生真菌HWT5的发酵代谢产物中发现有较高含量的原儿茶醛，因此可以认为在内生真菌HWT5发酵过程中，内生真菌HWT5可以产生了此种次级代谢产物，该发现可为采用五味子内生真菌HWT5发酵法生产原儿茶醛提供新方法。

Claims

1.一株产原儿茶醛的五味子内生真菌，其特征在于它为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2014131，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2014年4月16日。