CN105695335A - 一种新的黄曲霉及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的黄曲霉及其用途。本发明黄曲霉，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.3.15413的黄曲霉LB-Y4。本发明黄曲霉的代谢产物具有抑制金黄色葡萄球菌等细菌的活性，可以制备抗细菌药物或消毒剂，临床应用前景良好。

Description

一种新的黄曲霉及其用途

技术领域

本发明涉及一种新的黄曲霉及其用途。

背景技术

黄曲霉(Aspergillusflavus)，半知菌类，一种常见腐生真菌。多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。菌落生长较快，结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色。菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多小梗(一般为双层)，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子合成孢子头，可用于产生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是酿造工业中的常见菌种。

目前，未见黄曲霉及其代谢产物具有抑制细菌的活性的报道。

发明内容

本发明提供了一种新的黄曲霉，其抑菌代谢产物的制备方法及其用于制备抗细菌药物或消毒剂的用途。

本发明黄曲霉，其特征在于：它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCCNo.3.15413的黄曲霉LB-Y4。

前述黄曲霉LB-Y4(AspergillusflavusLB-Y4)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2014年10月23日，保藏编号为：CGMCCNo.3.15413。

本发明还提供了制备前述黄曲霉的抑菌代谢产物的方法，包括如下步骤：

(1)发酵：取保藏号为CGMCCNo.3.15413的黄曲霉LB-Y4，接种于添加有终浓度为20g/L可溶性淀粉和8g/L蛋白胨的PD培养基中，在28℃±1℃、180转/分的条件下摇床培养，培养7～10天，过滤，得发酵上清液和菌丝体；

(2)提取：

取步骤(1)的发酵上清液，减压浓缩，得浓缩液，醇沉，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，即为发酵上清液的乙酸乙酯萃取物；

取步骤(1)的菌丝体，烘干，研碎，加入50倍(v/w)的无水乙醇超声提取60min，后用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯相，即为菌丝体的乙酸乙酯萃取物；

合并收集发酵上清液的乙酸乙酯萃取物及菌丝体的乙酸乙酯萃取物，减压浓缩至浸膏，即得。

步骤(2)中，醇沉方法是：加入浓缩液三倍体积的无水乙醇，静置12h。

本发明还提供了前述方法制备得到的抑菌代谢产物及其在制备抗细菌药物或消毒剂中的用途。

所述抗细菌药物或消毒剂是抗金黄色葡萄球菌的药物或消毒剂。

本发明还提供了一种抗菌药物或消毒剂，它是以前述抑菌代谢产物为活性成分，加上药品上或消毒剂上可接受的辅料制备而成的制剂。

所述抗细菌药物或消毒剂是液体制剂、气体制剂、固体制剂或半固体制剂。

本发明提供的新的黄曲霉的代谢产物具有抑制金黄色葡萄球菌等细菌的活性，可以制备抗细菌药物或消毒剂，也是寻找新型抗生素的重要微生物资源，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明所述黄帚橐吾内生真菌黄曲霉LB-Y4在PDA平板上的形态。

图2为黄曲霉LB-Y4在发酵培养基种的形态。

图3为黄曲霉LB-Y4孢子形态特征。

图4为代谢产物的抑菌效果图。

具体实施方式

实验材料和试剂：

实施例1本发明黄曲霉的分离鉴定

1、分离

1.1常规内生真菌分离法

将健康黄帚橐吾叶片中间部分剪成2mm小片，镊子将小片浸于75％酒精30S，无菌水漂洗2～3次，3％NaClO2～3min，再浸入75％酒精30S，无菌水漂洗2～3次，用最后一次无菌水作对照，无菌镊子取出小叶片将其平贴于PDA平板上，每皿内放置6小片，用封口膜封口后室温下放置5天后连续观察统计出现的菌落形态和数量，若对照组没有长出任何菌，则说明表面消毒完全。

1.2内生真菌菌种纯化

挑取典型菌株三点点植于双抗PDA平板(100％PDA平板中含有氨苄青霉素40ppm，硫酸链霉素80ppm来抑制细菌生长)上，20℃培养5天后，挑取菌落边沿生长区菌丝尖端纯化，单菌落斜面保存，将分离纯化的真菌编号。

1.3内生真菌保种

挑取尖端菌丝接种于无菌斜面PDA培养基，28℃恒温培养箱中培养5-7天待孢子布满整个斜面并无杂菌生长，加入无菌石蜡油4℃封藏，加入量以直立试管时高出斜面顶端约1cm为宜。

2、鉴定

取前述方法分离得到的菌株，采用如下方法鉴定：

(1)菌落形态特征

利用显微镜及肉眼观察细胞及固体平板上的菌落形态。

(2)分子生物学鉴定

利用PCR技术，测定前述菌株的18SrDNA/ITS序列，利用BLAST软件将该序列与GenBank中收录的DNA序列进行比对，并与相关菌种构建进化树，鉴定菌株的种属。

2.2鉴定结果

(1)菌落形态

如图1～3所示，菌落生长迅速，25℃培养7天直径35-40mm；菌落致密丝绒状或絮状，平坦或辐射状不规则沟纹；分生孢子颜色为黄绿色至草绿色；通常无渗出液；菌落反面无色至淡褐色。分生孢子头初为球形，后呈辐射形；分生孢子梗大多生自基质；顶囊近球形或烧瓶形，发酵培养7-9天形成直径为1-2mm的棕色菌丝球，培养液透明清澈。

(2)18SrDNA/ITS序列为：

ACGAGGGGTACGGTTCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA

结合前述菌落形态特征和18SrDNA/ITS序列，将分离得到的菌株鉴定为黄曲霉(Aspergillusflavus)，定名为黄曲霉LB-Y4(AspergillusflavusLB-Y4)，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2014年10月23日，保藏编号为：CGMCCNo.3.15413。

实施例2采用本发明菌株发酵制备抗菌代谢产物

1、实验材料

PDA固体培养基(1L)：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，其余为水；制备方法：称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍微冷却后再补足水分至1000毫升，即可。

PD液体培养基(1L)：马铃薯200克，葡萄糖20克，其余为水；制备方法：称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍微冷却后再补足水分至1000毫升，即可。

金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌金葡ATCC27217菌株。

2、制备方法

(1)菌种的活化培养：将实施例1分离保存的黄曲霉LB-Y4菌种移至PDA固体平板上，在28℃±1℃条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为4mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；

(2)发酵培养：发酵培养液为每1000mLPD培养基中加入，可溶性淀粉20g，蛋白胨8g，每500mL三角瓶装发酵培养液200mL；配制后121℃灭菌20min，待冷却至40℃在无菌条件下挑取1直径为4mm菌饼，在28℃±1℃条件下，摇床转速180转/分钟，发酵培养7-10天。

(3)发酵物提取：取发酵液，抽滤，分为菌丝和发酵上清液，发酵上清液5L减压浓缩至1L，醇沉去除杂质(即用三倍体积的无水乙醇提取，静置过夜)，抽滤去除沉淀，滤液用乙酸乙酯1:1萃取3次，合并乙酸乙酯相；菌丝体于烘箱烘干后，取出用研钵将菌丝研碎，用无水乙醇(w/v＝1/50)超声提取60min，后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯相，最后合并收集发酵上清液乙酸乙酯萃取物及菌丝乙酸乙酯萃取物，旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏，即得黄曲霉LB-Y4代谢产物，用丙酮溶解4℃冰箱保存备用。

3、抗菌活性检测

3.1取前述方法制备的黄曲霉LB-Y4代谢产物0.1g，并加入10mL体积的丙酮，超声波震荡充分溶解，最终配置成浓度为10g/L的样品溶液；

3.2活化后的金黄色葡萄球菌用无菌水稀释至10⁸cfu/mL，

取0.1mL菌悬液涂布于LB平板上。放上牛津杯，加入100ul样品，丙酮做对照，重复3次，37℃培养1～2d，观察抑菌圈的大小及有无。

4、抗菌活性检测结果

结果如下表1和图4所示：

表1黄曲霉LBY4供试病原细菌的抑制效果

由表1和图4可以看出，本发明前述方法制备的黄曲霉LBY4代谢产物对金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用，可以制备成为抗细菌的药物或消毒剂。

综上，本发明从植物黄帚橐吾茎中分离筛选出一株新的黄曲霉，其代谢物对金黄色葡萄球菌具有较强抑制作用，为医药领域研发新的抗菌药物或消毒剂提供了新的来源。

Claims (8)

1.一种黄曲霉，其特征在于：它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCCNo.3.15413的黄曲霉LB-Y4。

2.制备权利要求1所述黄曲霉的抑菌代谢产物的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)发酵：取保藏号为CGMCCNo.3.15413的黄曲霉LB-Y4，接种于添加有终浓度为20g/L可溶性淀粉和8g/L蛋白胨的PD培养基中，在28℃±1℃、180转/分的条件下摇床培养，培养7～10天，过滤，得发酵上清液和菌丝体；

(2)提取：

取步骤(1)的发酵上清液，减压浓缩，得浓缩液，醇沉，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，即为发酵上清液的乙酸乙酯萃取物；

取步骤(1)的菌丝体，烘干，研碎，加入50倍(v/w)的无水乙醇超声提取60min，后用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯相，即为菌丝体的乙酸乙酯萃取物；

合并收集发酵上清液的乙酸乙酯萃取物及菌丝体的乙酸乙酯萃取物，减压浓缩至浸膏，即得。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，醇沉方法是：加入浓缩液三倍体积的无水乙醇，静置12h。

4.权利要求2或3所述方法制备得到的抑菌代谢产物。

5.权利要求4所述抑菌代谢产物在制备抗细菌药物或消毒剂中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述抗细菌药物或消毒剂是抗金黄色葡萄球菌的药物或消毒剂。

7.一种抗菌药物或消毒剂，其特征在于：它是以权利要求4所述抑菌代谢产物为活性成分，加上药品上或消毒剂上可接受的辅料制备而成的制剂。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述抗细菌药物或消毒剂是液体制剂、固体制剂或半固体制剂。