CN1039618A

CN1039618A - 检测核苷酸顺序的方法

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Publication number: CN1039618A
Application number: CN89102694A
Authority: CN
Inventors: 克莱夫·罗伯特·牛顿; 亚历山大·弗雷德·马卡姆
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: AstraZeneca UK Ltd; Syngenta Ltd
Priority date: 1988-03-10
Filing date: 1989-03-09
Publication date: 1990-02-14
Anticipated expiration: 2004-03-09
Also published as: AU3124689A; EP0332435B1; ES2039294T3; KR970003151B1; EP0332435A3; AU614584B2; ZW3388A1; EP0332435A2; YU49789A; DK118089D0; DK175527B1; JPH0242999A; PL278176A1; HUT52565A; IE61148B1; NO174825C; FI891126A; EP0332435B2; ES2039294T5; JP2853864B2

Abstract

公开了一种检测是否存在一个或多个变异核苷酸顺序的方法，其包括：(i)使核酸样品与基本上互补于靶碱基顺序中诊断部分的诊断引物相接触，从而在适当条件下，只有当诊断引物的末端核苷酸与靶碱基顺序中可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸互补时才能在靶模板上发生诊断引物的延伸，以及(ii)检测有无延伸产物存在。本发明还公开了用于上述检测试验的药盒。

Description

本发明涉及利用扩增或不扩增方式来检测有或没有一个或多个变异核苷酸顺序的方法，以及用于此目的的药盒。

本发明的目的是对遗传条件、素质或体细胞突变的DNA样品进行诊断性筛选，特别是提供了一种对点突变进行快速检测的通用方法，并可通过分析其DNA或RNA来检测感染性病原体并对其进行分型。

已经知道，因DNA水平的特定突变而导致的人类遗传性疾病有数百种。某些遗传性疾病的分子基础已经被认识，而那些目前尚不清楚的突变性质的遗传性疾病的分子基础也正在研究中。有关遗传条件的确切分子基础尚不明瞭，但使用与疾病位点有遗传连锁的DNA探针，通过RFLP技术测得谱系信息，可以对疾病或载体的定位作出诊断。据此，目前已将RFLP技术特别用于假肥大性肌营养障碍、囊性纤维变性及Huntington氏午蹈病的诊断。但这些检测都要根据各自的状况分开进行，因而需要作大量工作，每一种情况都需要进行DNA纯化、限制性酶消化、琼脂糖凝胶电泳分析、Southern印迹分析、杂交、检测已杂交的基因探针以及谱系分析。某些与基因中单个点突变相关联的其他遗传条件是已知的，但是针对这种条件必需分别分析，而且如点突变为异质性的，则困难更多。例如有40多个不同点突变可引起β地中海贫血，至少有5个或许远远超过12个点突变可引起血友病A。在这些异质性疾病条件中，对每一个可能的突变点都要分开分析。这将涉及用多个限制性酶进行复杂的RFLP单倍型分析。

在各种肿瘤发展的过程中，涉及体细胞中的许多点突变，例如ras致癌基因内的点突变〔J.L.Boos et al.Nature 327，293（1987）〕。

Cetus公司的欧洲专利申请87302196.8号（公开号.237，362）中描述了一种检测含有一个或多个核酸之样品的顺序中是否存在至少一个核苷酸变异的方法，该方法包括：

（a）在杂交条件下，用4种不同的三磷酸核苷、三磷酸核苷聚合因子及寡核苷酸引物一同或相继处理待测样品，以检测其每条链的每个核苷酸是否包含所说的变异，这样含有不同变异的每条核酸链均得以检测。在每一引物上均合成了延伸产物，该产物则与每条核苷酸链互补;所选择的一个或多个引物应使之基本上与含有不同变异的每条核酸链互补，这样，如将由一个引物合成的延伸产物从其互补链上分离出来后，它便可用作合成其他引物之延伸产物的模板;

（b）假如待检的变异是存在的，则于变性条件下处理样品，以由其模板上分离出引物延伸产物;

（c）用所说的4种三磷酸核苷、一种三磷酸核苷聚合因子和寡核苷酸引物一同或相继地处理样品，即可使用步骤（b）中产生的每条单链作为模板以合成引物延伸产物，其中包括反复重复步骤（b）和（c）直至使顺序变异（如果存在的话）的核酸扩增到可检测的程度;

（d）将步骤（c）的产物固定于膜上;

（e）于杂交条件下，用标记的顺序特异性核苷酸探针处理膜，只要该探针上有一与扩增顺序的一个区域互补的顺序，该探针即能够与扩增的核酸顺序杂交;以及

（f）检测探针是否与核酸样品中扩增的顺序杂交。

在某些特定情况下，可用几种不同的技术来检测是否至少存在一个核苷酸变异。在导致产生或破坏一个限制性位点之点突变的异常情况下（如镰状细胞性贫血），可在扩增前或扩增后使用限制性酶消化〔F.F.Chehab et.al.Nature 329，293（1987）〕。此外，在大量缺失核苷酸顺序情况下，可就可疑缺失的区域（如引起α-地中海贫血的23kb缺失）来制备扩增引物。在这种情况下，通过不能扩增缺失的顺序进一步确定缺失的存在，从而可作为诊断a-地中海贫血的依据〔F.F.Chehab et.al.Nature 329，293（1987）〕。

欧洲专利申请（EP-A）237，362号中所述的扩增方法较之RFLP法（restriction fragment Length Polymorphism）和由Kan与Dozy〔Proceedings of the National Academy of Sciences（USA）75，5631（1978）〕、Rubin和Kan〔Lancet，1985-I，75（1985）〕、Conner等人〔Proceedings of the National Academy of Sciences（USA），80，78（1983）〕、Kidd等人〔Nature，304，230（1983）〕以及Piratsu等人〔New England Journal of Medicine，309，284（1983）〕描述的等位特异性寡核苷酸技术具有更多优点。

然而，EP-A237，362号中描述了一种涉及靶顺序的非选择性扩增方法，其肯定要耗费很多时间去完成进一步的检测步骤，如进一步使用标记的顺序特异性寡核苷酸探针（其可区分小至单个核苷酸的顺序），和/或在少数产生或破坏酶识别顺序之点突变的情况下使用特异的限制性核酸内切酶，和/或对扩增的DNA直接进行顺序测定〔C.Wong et al.Nature 330，384（1987）〕。

现在需要有一种直接检测核酸（如基因组DNA）中的至少一个碱基差异的简便方法，其不仅检测步骤少，而且操作简单，精确又不需要进行过多的操作训练。

根据本发明的一个特征，其提供了一种检测样品中一个或多个核酸有或没有至少一个变异核苷酸的方法，该方法包括：

在杂交条件下，用合适的三磷酸核苷、三磷酸核苷聚合因子、用于靶碱基顺序之诊断部分的诊断引物一同或相继处理样品，所说的诊断引物的核苷酸顺序应与所说的诊断部分基本上互补，诊断部分的末端核苷酸则与可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸互补，从而当所说的诊断引物的末端核苷酸与靶碱基顺序中相应核苷酸互补时，便合成诊断引物的延伸产物，而当所说的诊断引物的末端核苷酸不与靶碱基顺序的相应核苷酸互补时，则不能合成诊断引物的延伸产物;而且可根据有无延伸产物来确定有无可疑的变异核苷酸。

虽然本发明的方法特别适用于检测是否存在点突变，但该方法也同样适用于检测是否存在缺失（包括一个以上核苷酸的缺失）以及是否存在多于一个核苷酸的取代。因此，知道相关的核苷酸，特别是相关的末端核苷酸是十分必要的;这样便可以根据情况设计适用的诊断引物。

可以检测以任何常规形式（如单或双链形式）形成的任何延伸产物。

必要时可按美国专利4，683，195号和4，683，202号中描述的聚合酶链反应（PCR）方法、国际专利申请（PCT）WO87/0670号和Biotechnology，Vol.6，October 1988中描述的Q-β复制酶方法、PCT-WO87/10315号中描述的基于Srska公司的转录基核酸扩增法或线性扩增法来扩增所得的延伸产物。本文中使用的术语“线性扩增”是指利用各诊断部分的单个引物在聚合因子和合适的三磷酸核苷存在下进行的扩增作用，从而使扩增作用受基于使用样品核酸之单链作为模板进行的引物延伸的影响。

在本发明的第一个和优选的实施方案中，该方法包括：

（1）在杂交条件下，用合适的三磷酸核苷、三磷酸核苷的聚合因子、靶碱基顺序之诊断部分的诊断引物及相应的扩增引物一同或相继处理样品。所说的诊断引物的核苷酸顺序基本上互补于所说的诊断部分，而诊断引物的末端核苷酸则互补于可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸，因此，当所说的诊断引物的末端核苷酸与靶碱基顺序中的相应核苷酸互补时，将合成诊断引物的延伸产物，而当所说的诊断引物的末端核苷酸不与靶碱基顺序中的相应核苷酸互补时，则不会合成诊断引物的延伸产物;从互补物上分离之后，任何已形成的诊断引物的延伸产物均可作为合成所说扩增引物之延伸产物的模板;

（2）在变性条件下处理样品，从形成延伸产物的模板上分离出引物延伸产物;

（3）使步骤（2）中产生的单链与合适的三磷酸核苷、三磷酸核苷的聚合因子、本文中限定的诊断引物及扩增引物一起或相继接触，从而有可能利用步骤（2）中产生的单链作为模板进一步合成延伸产物;

（4）连续重复步骤（2）和（3），以使合适的核苷酸顺序扩增到可检测的水平;以及

（5）根据是否存在步骤（4）中得到的扩增产物来确定有无可疑的变异核苷酸。

在本发明的第二个实施方案中，可用

（a）具有与第一个核酸顺序的诊断部分基本互补之顺序的第一个诊断引物、（第一个诊断引物有一个与可疑的变异核苷酸互补的末端核苷酸）、及具有与第二个核酸顺序的诊断部分基本互补之顺序的第二个诊断引物（第二个诊断引物有一个与可疑的变异核苷酸互补的末端核苷酸）一起或相继处理所说的样品;或者用

（b）具有与第一个核酸顺序的诊断部分基本互补之顺序的第一个诊断引物（该诊断引物有一个与可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸互补的末端核苷酸），以及具有与第二个核苷酸顺序的诊断部分基本互补之顺序的第二个诊断引物（该诊断引物具有一个与可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸互补的末端核苷酸）一起或相继处理所说的样品;

第一和第二个诊断引物的所说的末端核苷酸均是各自引物的5′或3′末端，而且第一个核苷酸顺序是第二个核苷酸顺序的反义链。

因此，该实施方案中的第二个诊断引物可被看作是上文和下文中提到的扩增引物。

第二个实施方案可使分辨率和特异性得以提高，因为在两个错配的寡核苷酸的相关末端（常常是3′末端），任何人为产物都需要引导，而不是只利用单个诊断引物的单一末端。

可按下文所述方法检测有无可疑的变异核苷酸。

在本发明的第三个实施方案中，对含有可疑之变异核苷酸的DNA样品进行扩增，可使用如下文限定的线性扩增法，或用美国专利4，683，195号和4，683，202号、国际专利申请WO87/06270号以及Biotechnology，Vol.6，October1988或WO88/10315号中描述的扩增方法进行，并在杂交条件下用合适的三磷酸核苷、三磷酸核苷的聚合因子和靶碱基顺序之诊断部分的诊断引物处理该扩增产物，其中所说的诊断引物的核苷酸顺序与所说的诊断部分基本互补，而该诊断引物的末端核苷酸则与可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸互补。

在本发明的第三个实施方案中，根据需要完成数次扩增循环，并将与诊断引物的杂交过程作为检测步骤前的最后一步。不必使用扩增引物。

第三个实施方案特别有利是因为可大大减少所需聚合因子的量（如至少减半），并可减少所用三磷酸核苷的量及所用聚合酶链反应（PCR）加热器的数目。因此，第三个实施方案可大量节约费用。此外，因为扩散步骤可在常规温度范围内完成，而没有造成不良影响，所以第三个实施方案只需在对温度更敏感的条件下，一次完成与诊断探针的杂交，这些便可减少了末端错配（通常是3′错配）之诊断引物假性引导的危险。为此，第三个实施方案提供了一个更为可靠和有价值的方法，该方法可供一般技术人员使用，并可避免出现操作误差。第三个实施方案省去了额外的聚合酶链反应对照步骤，因为已启动的扩增过程提供了其自身的内部对照。

必要时，诊断引物可携带一个信号或标记，其在如PCR那样的高温循环技术条件下亦不会有被破坏的危险。可利用合适的标记或信号部分（如已述及的碱性磷酸酶或棘根过氧化物酶）进行标记。

就使用热稳定性酶进行标记而言，使用得自Thermus aquaticus的磷酸酶是很有利的。

本发明的第四个和优选的实施方案是通过引进使用本发明第二个实施方案中所述的两个诊断引物而改进了本发明的第三个实施方案，其中第二个诊断引物可用作扩增引物。

本发明的第四个实施方案中，对含有可疑之变异核苷酸的DNA样品进行扩增，并可用：

a）一个具有基本上与第一个核苷酸顺序的诊断部分互补之顺序的第一个诊断引物-第一个诊断引物具有一个与所说的可疑变异的核苷酸互补的末端核苷酸，以及一个具有基本上与第二个核苷酸顺序的诊断部分互补之顺序的第二个诊断引物-该第二个诊断引物有一个与所说的可疑变异的核苷酸互补的末端核苷酸-一起或相继处理扩增的产物;或者用：

b）一个具有基本上与第一个核酸顺序的诊断部分互补之顺序的第一个诊断引物-第一个诊断引物有一个与所说的可疑变异的核苷酸相应之正常核苷酸互补的末端核苷酸，以及一个具有基本上与第二个核苷酸顺序的诊断部分互补之顺序的第二个诊断引物-第二个诊断引物有一个与所说的可疑变异的核苷酸对应之正常核苷酸互补的末端核苷酸-一起或相继处理扩增的产物;

所说的第一和第二个诊断引物的末端核苷酸均为各自引物的5′或3′末端，且第一个核苷酸顺序互补于第二个核苷酸顺序。

通常所说的第一和第二个诊断引物的末端核苷酸均在其各自引物的3′端。

本发明的第四个实施方案结合了本发明第二和第三个实施方案的优点，尤其是提高了特异性、减少了费用并且是深受使用者欢迎的有用技术。

可按下述方法来检测是否存在可疑的变异核苷酸。

最好用前述（a）或（b）一次处理扩增产物，或可根据需要进行一次或多次循环。多次循环完成后可得到进一步的产物，即诊断引物之延伸产物的杂交体。将根据原始PCR（聚合酶链反应）引物寡核苷酸与所加诊断引物寡核苷酸的相对比例，成比例地形成各种产物。

使用诊断和扩增引物或使用如本发明第一和第二个实施方案中所述的两个诊断引物完成扩增，或者作为EP-A237.362号中所述扩增方法的一部分，即（a）变性步骤以从其模板上分离出引物延伸产物和（b）使所得到的单链与合适的三磷酸核苷、三磷酸核苷的聚合因子及相关引物一起或相继接触，以进一步合成延伸产物。最好重复5次乃至无数次，尤其是当引物能耐受扩增并且对本发明无不利影响时。假如样品含有人基因组DNA，更为优选的是进行15～60次，如15～30次（循环）。假如样品含有细胞，最好在步骤（a）之前对其加热以使其中的核酸与试剂接触。该步骤省去了加入试剂前纯化核酸的过程。在这一点上，本发明较以前的方法有着明显的进步（即使是在进行扩增前就从样品中纯化DNA）。

在步骤（b）中，使步骤（a）中产生的单链与合适的三磷酸核苷、三磷酸核苷的聚合因子及引物（如诊断引物和/或扩增引物）接触将是很有利的，这可通过从模板分离引物延伸产物后向反应混合物中加入这些材料，或依靠已存在于反应混合物中的材料进行上述接触。事实上，任何一种或多种不同的三磷酸核苷和/或聚合因子和/或引物（如诊断引物和/或扩增引物）都可以在本发明方法的任何步骤中加入。

根据本发明的第五个和优选的实施方案，其提供了一种如上文中限定的方法，该方法是基于使用样品核酸单链作为模板的引物延伸来完成扩增的。

在该实施方案中，引物延伸是基于利用样品核酸的同一条链作模板完成的，而不存在扩增引物。因此，扩增是几何递增的，而不是指数递增的，通过聚合酶链反应（PCR）至少在理论上可达到指数扩增。本发明第五个实施方案（这里也称为线性扩增）的优点在于，如果产生了人工合成的产物，其本身便不能发生指数扩增。

可通过任何常规方法完成线性扩增，因而便可能在三磷酸核苷之聚合因子的存在下，使用互补的三磷酸核苷酸完成扩增，以产生不确定长度的引物延伸产物，其中在诊断引物和样品核酸之间有着足够程度的互补性。在使用所有互补三磷酸核苷时，最好用核酸内切酶消化样品核酸，所选用的限制性核酸内切酶应保证在足以形成有固定长度之引物延伸产物的位点上切断样品核酸。然而，线性扩增可在只有一种、较好是有两种、最好有三种三磷酸核苷存在下完成，从而使以其结合（即与样品核酸杂交）状态存在的诊断引物只有在允许的1、2或3种三磷酸核苷存在时方能延伸。一旦样品核酸中的三磷酸核苷没有其互补的三磷酸核苷时，引物延伸就会停止。

必要时可在顺序的熔点温度（Tm）下进行线性扩增。在这一温度下，与样品核酸中互补顺序杂交的诊断引物是与溶液中游离的诊断引物平衡的，从而诊断引物（最好是延伸形式的）便会很快地与样品核酸杂交并由此而变性。必要时可用热振荡法完成线性扩增。这种热振荡法通常包括在顺序熔解温度上下快速改变温度。

如果只有1、2或3种三磷酸核苷存在，则诊断引物只能就所存在的这些三磷酸核苷进行延伸。如上所述，当诊断引物的3′末端和样品核酸中相应的三磷酸核苷之间有一错配时，便不能发生引物延伸。然而，如果诊断引物的3′末端三磷酸核苷与样品核酸中相应的三磷酸核苷互补，则可以发生引物延伸。

当只使用1、2或3种三磷酸核苷，并且延伸之诊断引物的末端三磷酸核苷只被使用一次时，使用三磷酸二脱氧核苷作为三磷酸核苷可能更为有利，后者在使用中将构成诊断引物延伸产物的末端三磷酸核苷。这将有助于产生诊断引物的清晰地末端延伸。

必要时可用任何常规方法标记将掺入延伸产物内之反应混合物中的一种或多种三磷酸核苷。例如可用荧光标记法标记一种或几种三磷酸核苷。这种三磷酸核苷的标记是与完成本发明任务的第五个实施方案密切关联的，可通过检测已掺入延伸产物中的标记或加标志的三磷酸核苷来确定诊断引物之延伸产物的生成。没有发生掺入便没有延伸产物生成，并可将标记或加标志的三磷酸核苷洗去。更具体地说，本发明的第五个实施方案避免了人为产物的扩增问题，因此能较好地鉴别标记或加标志之三磷酸核苷的存在。使用PCR法进行扩增时，任何合成产物的生成均可导致该产物的扩增以及标记或加标志之三磷酸核苷的掺入，从而降低了分辨率。

除了上述者外，也希望诊断引物携带有免疫结合对的一个成分例如一个抗原或一个抗体，或形成结合对的复合物的一个成分，（如生物素），以与所说的结合对的另一成分结合或为了在固相上俘获之目的而形成结合对。

根据本发明的另一特征，其提供了一种检测含有一或多个核酸的样品中有无至少一个变异核苷酸存在的药盒，该药盒包括：

（1）一个适用于靶碱基顺序之诊断部分的诊断引物，各诊断引物的核苷酸顺序基本上互补于所说的诊断部分，诊断引物的一个末端核苷酸则与可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸互补，这样，当所说的诊断引物的末端核苷酸与靶碱基顺序中的相应核苷酸互补时，便可合成诊断引物的延伸产物;而当所说的诊断引物的末端核苷酸不与靶碱基顺序中的相应核苷酸互补时，便不能合成诊断引物的延伸产物;

（2）四种不同的三磷酸核苷;及

（3）使（2）中的三磷酸核苷聚合的因子。

本发明的药盒最好还包括与各诊断引物相对应的扩增引物，扩增引物的核苷酸顺序应使相应诊断引物的任何延伸产物均可在与互补物分离后用作合成扩增引物之延伸产物的模板。例如，本发明药盒可包括一套或两套与上述第二个实施例相关联的前已述及的诊断引物。

如果需要，本发明的药盒还可含有合适的内部调节引物。

然而，特别优选的是，本发明的药盒包含有与可疑的变异核苷酸相关的PCR（聚合酶链反应）引物和诊断引物（定义详见下文）。必要时，本发明的药盒还可包含一套或两套与本发明的第二个实施方案有关的诊断引物。

（1）、（2）和（3）中描述的材料和/或扩增引物可用常规方法分装在个别容器内，但最好将所有试剂结合在一个容器内，将待检物质加入其中，单个容器还应另外含有缓冲液。

本发明的药盒最好包含与上述本发明第二个实施方案有关的（a）和（b）两组诊断引物，尽管每组引物可以与（2）和（3）中所述的各材料和/或扩增引物一起存在于分开的容器内，但是两种引物不能一起放入一个容器内。可按照EP-A237.362号中所述方法首先对待测样品进行扩增，且最好在单个容器内包含PCR引物和诊断引物以及上面（2）和（3）中所述的材料。但如果需要时，可将诊断引物放在单独的容器中，以备扩增后使用。

术语“三磷酸核苷”在本文中是指存在于DNA或RNA中的核苷，因此它包括掺入了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶等碱基与脱氧核糖或核糖的核苷。通常脱氧核糖核苷与DNA聚合酶结合使用。然而，也可使用能与普通碱基（腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶）配对的修饰的碱基。这些经修饰的碱基包括8-氮杂鸟嘌呤和次黄嘌呤等。

文中使用的术语“核苷酸”是指DNA或RNA中的核苷酸，因此其包括掺入了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶等碱基和脱氧核糖或核糖的核苷酸。然而，本发明的诊断引物和扩增引物中也可使用能与普通碱基（腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶）配对的经修饰的碱基。这些经修饰的碱基包括8-氮杂鸟嘌呤和次黄嘌呤等。

本发明的方法最好用于检测是否存在与靶碱基顺序（其并不包含所有4种不同的核苷酸）相邻的可疑变异的核苷酸。必要时，可形成诊断引物和扩增引物的延伸产物，此时只要有合适的相应三磷酸核苷即可，而不必存在所要四种三磷酸核苷。

三磷酸核苷聚合因子可以是能完成引物延伸产物合成的化合物或***（包括酶）。为达到这一目的，可使用合适的酶，如大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、其他有用的DNA聚合酶、反转录酶及其他酶，包括热稳稳定性酶等。这里所说的“热稳定性酶”是指该酶对热有耐受力并且具有抗热性能，催化核苷酸以合适方式结合形成为一核苷酸链互补的引物延伸产物。通常从引物的3′末端开始合成，沿着模板链向5′方向进行，直到合成终止，产生不同长度的分子。然而，有些酶如热稳定性酶，在使用如上所述的同样方法时则从5′末端开始合成，并向另一方向进行。用于本发明方法的优选的热稳定性酶是从Thermus aquaticus中提取和纯化的。这种酶的分子量约为86，000～90，000道尔顿（见EP-A237，362和EP-A258，017）。可以不受限制地从美国典型培养物保藏中心（ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，USA）得到Thermus aquaticus菌株YT1（其登记号为ATCC 25，104）。

文中使用的术语“诊断部分”是指靶碱基顺序（定义详见下文）的一个部分，它含有可能变异的核苷酸作为末端核苷酸，该变异核苷酸是否存在将有待检测。变异核苷酸通常在诊断部分的5′端，因为如上所述，引物延伸产物合成一般是从各引物的3′末端开始的。但将被使用的聚合因子是从诊断引物的5′端起始合成并沿着模板链的3′方向进行时，合成过程终止于“诊断部分”，则变异核苷酸含在“诊断部分”的3′端。为此，可按下述方案适当地设计诊断引物。

文中使用的术语“靶碱基顺序”是指至少含有一个诊断部分（定义详见下文）的核苷酸顺序。例如在检测β-地中海贫血的单一试验中，靶顺序可含有多达60个，例如50个诊断部分，而每个诊断部分均含有一个潜在的变异核苷酸。

文中使用的术语“寡核苷酸”定义为含有两个或多个，最好3个以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。其实际大小决定于许多因素，如反应温度、盐浓度、甲酰胺的存在及有无其他相近突变（如镰状细胞HbC疾病），其本身又取于寡核苷酸的最终功能或应用。事实上，寡核苷酸的确切顺序还取决于如下文所述的许多因素。寡核苷酸可以是合成的或经分子克隆制得的。

文中使用的术语“引物”是指一种寡核苷酸，其可以是天然存在的并经限制性消化纯化得到的，或者是经人工合成的，当引物被置于适于合成引物延伸产物（后者互补于被诱导的核酸链）的条件下〔即存在合适的三磷酸核苷和核苷酸聚合因子（如DNA聚合酶），并置于合适的缓冲液（“缓冲液”包括pH、离子强度、辅助因子等）中和适当温度下〕时，其能够作为合成的起始点。

为使扩增达到最大效率，引物最好是单链的，但也可以是双链的。如果是双链的，在用于制备延伸产物之前应先处理引物以使其两条链分开。引物的长度必需足以使之在聚合因子存在下能合成延伸产物。引物的实际长度决定于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法等。根据靶顺序的复杂程度，典型的诊断和扩增引物应含有12～35（如15～35）个核苷酸，尽管它们亦可含有更多或稍少些的核苷酸。一般短引物分子需要在较低温度下与模板形成足够稳定的杂交体。

本文使用的术语“互补于”是指某一核苷酸将与另一个特定的核苷酸形成碱基配对。如三磷酸腺苷互补于三磷酸尿苷或三磷酸胸苷、三磷酸鸟苷互补于三磷酸胞苷。应明确的是，虽然三磷酸胸苷和三磷酸鸟苷在某些情况下能形成碱基配对，但就本发明的目的来说，还不能将它们看成是互补的。另外，虽然三磷酸胞苷和三磷酸腺苷在某些情况下可以碱基配对，但也不能看作是互补的。这一点也适用于三磷酸胞苷与尿苷之间的配对。

本文所说的引物“基本上”互补于将被扩增之特定顺序的不同链，是指引物必须是足以互补的，这样方可与个别链杂交。因此，引物顺序不必反映模板的确切顺序。例如，当诊断引物的3′末端核苷酸与可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸互补时，则在引物的5′末端可接有一个非互补的核苷酸片段，而引物顺序的其余部分则互补于靶碱基顺序的诊断部分。但引物一般都有精确的互补性，除非如前面所述的在预先确定的引物末端可能有非互补的核苷酸。

然而在某些情况下，甚至存在非互补的3′末端残基时，也可能诱导合成诊断引物延伸产物。这种人为结果可能是由于使用了太低的温度（在这种情况下可以提高温度）、太长的保温/退火时间（在这种情况下可以缩短时间）、过高的盐浓度（在这种情况下可以降低盐浓度）、过高的酶浓度、过高的三磷酸核苷浓度、不正确的pH或不正确的寡核苷酸引物长度。所有这些因素均已在EP-A 237，362中作过讨论。人为产物形成的主要原因可能是反应温度下降太快，从而致使反应的严格性太低，如通过从加热循环装置中除去反应混合物，甚至在第一个反应周期内便加入聚合因子（即Taq聚合酶）而造成的温度下降。除上述原因外，我们发现这种人为结果可能还起因于使用了富含G（鸟嘌呤）和C（胞嘧啶）残基的诊断引物。在这一点上，假如诊断引物作为整体富含G/C或在其相关部分（通常是3′末端）富含G/C，则该引物将会带来问题。再者，所用之诊断引物相关区域（通常是3′末端）碱基配对的精确特性，也可能是人为结果的原因。诊断引物的相关区域（通常是3′末端）碱基配对存在A（腺嘌呤）可改善特异性，而存在G（鸟嘌呤）则不能。另外，诊断引物之相关区域（通常是3′末端）内错配的精确性质也可能是能否得到人为结果的重要因素。例如，AA或CT错配通常不能导致杂交，但GT或AC错配则可导致足以形成人为产物的杂交。在诊断引物内精细地导入或缺失或***一个或多个错配的残基，使引物在杂交时进一步降低结合力以致不稳定，从而可避免人为结果。

可改变与末端错配相邻的一至十个（如6个）核苷酸，以引入进一步的错配。除末端错配外，还须有另一处错配，其位置应在离开末端错配1、2或3个碱基处。就α1抗胰蛋白酶基因之Z等位基因来说，确定正常纯合子、杂合子或受影响之纯合子存在与否时，我们发现如酸变3′末端的第3个核苷酸以产生错配，便可获得好的结果。例如我们已发现，以C代替诊断引物3′末端的第3个核苷酸A，使得Z等位基因的正常纯合子、杂合子和受影响之纯合子很容易被鉴别开。通过基于上述标准直接进行的实验可决定诊断引物的最好设计，这种实验是本领域内的熟练技术人员能够完成的。

文中使用的术语“诊断引物”是指该引物的核苷酸顺序有一个可与可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸互补的末端核苷酸，这样当诊断引物的末端核苷酸与靶碱基顺序之相应诊断部分的适当末端核苷酸互补时，即可合成诊断引物的延伸产物，但当诊断引物的末端核苷酸不与靶碱基顺序的相应诊断部分的适当末端核苷酸同源时，则不能合成该诊断引物的延伸产物。

文中使用的术语“扩增引物”是指能与核酸链杂交的引物，该核酸链互补于能与诊断引物杂交的核酸链，“扩增引物”有一个能与诊断引物延伸产物（在与其互补物分离之后）杂交的核苷酸顺序，借此诊断引物延伸产物即可作为合成扩增引物之延伸产物的模板，从而有利于扩增。

本发明至少是部分地改进了EP-A237，362号中描述的扩增方法，这种改进使其有可能选择性地扩增含有可疑变异之核苷酸的顺序，或含相应之正常核苷酸的顺序。这样便简化了检测程序，同时省去了相应的顺序测定、等位基因特异性寡核苷酸制备及限制性消化步骤。对于给定的核苷酸变异（如点突变），可通过下述手段检测其是否存在：1）设计有一个与可疑的变异核苷酸互补之合适末端核苷酸的诊断引物，这样，如有扩增产物合成即表示存在可疑的核苷酸变异，而如果没有扩增产物合成则表示没有可疑的核苷酸变异;或2）设计一个有可与相应正常核苷酸互补之合适末端核苷酸的诊断引物，这样，如有扩增产物合成，即表示没有可疑的核苷酸变异，而没有扩增产物则表示有可疑的核苷酸变异。中文使用的术语“合适的末端核苷酸”是指如果有可能，将会由之开始合成之引物的末端核苷酸。因为聚合因子通常在引物的3′端起始合成，所以合适的末端核苷酸通常应是3′末端核苷酸。

确定是否存在特定的点突变，可通过如上所述的途径（1）和途径（2）来完成。两种途径的结合提供了一种检测杂合子的方法，该方法在分析显性遗传条件和检测隐性遗传携带者中将是有价值的。

在一个优选的实施方案中，本发明可用于检测同一样品中是否存在一个以上可疑的变异核苷酸。本发明根据预测定的诊断引物的核苷酸顺序选择性地扩增顺序的能力，使得多次扩增产物得以简单、精确地分辨，且不需要受更多的操作训练，因此本发明提供了在单个样品中筛选多处核苷酸变异的有用技术。本发明的一个特殊优点是能在单个DNA或RNA样品中筛选出一组遗传状态，如遗传性疾病、素质及导致各种疾病的体细胞突变。可用Maniatis等人（Molecular Cloning，1982，P280～281）所述的种种技术从血液或组织材料（如绒毛膜绒毛或羊膜细胞）中提取这些DNA或RNA。另外，还可使用本发明的筛选技术，进一步了解其他遗传条件的分子基础。

可用多种技术鉴别多重扩增产物。例如可使用针对每个可疑之扩增产物的探针，其中每个探针带有一不同的和可辨别的信号或能够产生信号的残基。

这种信号和能产生信号的残基已在EP-A246，864号中作过详细讨论，但包括固相扩增***者则是由Wang C.G.描述的〔World Biotech.Report，1986，Vol.2，Part 2，pp，33～37，1986年11月在旧金山召开的诊断保健会议的会议录（Diagnostics Mealthcare Proceedings）〕，其中与许多选择的微量元素形成的微球是与探针联接的，可利用X射线荧光分析法检测特异性探针的存在。这些技术通常比较简单而且可直接使用，因为它仅仅要求检测是否存在扩增产物，而不是鉴别顺序间小至一个核苷酸的差异。

鉴别扩增产物的一个更为简单和优选的方法包括使所选择的扩增引物核苷酸顺序，在完成本发明方法时所形成的每个扩增产物的长度各不相同。就这一点来说，扩增产物中碱基对数目是由诊断和扩增引物的间距决定的。因此可设计扩增引物，使每一潜在的变异核苷酸与不同长度的潜在扩增产物相联系。

最好借助电泳技术来检测是否存在给定的潜在变异核苷酸，其中所得到的不同的扩增产物均按其分子量大小分布，从而可通过放射自显影或荧光技术进行鉴定。不同产物的长度可能只有一个核苷酸之差，但最好至少相差3个核苷酸。本发明的方法中，最好使用如溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓等嵌入染料进行染色，以便在紫外光照射下显示出桔黄色荧光。从而可以快速、精确并容易地检测出一个样品中是否存在许多潜在的变异核苷酸。必要时可用荧光团标志或标记诊断引物和/或扩增引物。这样，每个不同的诊断引物或扩增引物便可携带一个不同的荧光团，进而可用激光扫描仪从电泳凝胶上读出一系列检测结果，使本发明的方法实现自动化。另外，亦可使用能选择性地溶解三磷酸核苷的溶剂（但该溶剂并不能溶解核苷酸顺序，如DNA）以粗略地估计出是否有扩增产物存在。三氯乙酸（TCA）就是这类溶剂的一个例子。因此可用TCA沉淀扩增反应混合物，以确定是否存在扩增产物。在指数反应系列中掺入合适的磷酸核苷要比没发生诊断引物延伸时存在更多量的TCA不溶性物质。可用已知方法测定不溶性物质的量。例如可以标记三磷酸核苷（如用放射活性或荧光标志物），离心反应混合物，倾去液体并用适当检测技术（如放射计数法或荧光测定法）检测液体物和不溶性产物。

根据本发明的另一个特征，我们提供了用于本发明方法的一个约5至50bp的核苷酸顺序，所说的顺序的一个末端核苷酸互补于与已知的遗传性疾病相关联的可疑之变异核苷酸或相应的正常核苷酸，所说顺序的其余部分则基本上与相应的靶碱基顺序互补的（该靶碱基顺序与可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸相邻接），所说的核苷酸顺序在本发明的方法中被用作诊断引物，如诊断引物的所说的末端核苷酸与靶碱基顺序中的相应核苷酸互补时，即可合成诊断引物的延伸产物，而所说的诊断引物的末端核苷酸不与靶碱基顺序中的相应核苷酸互补时，则不会合成延伸产物。

与可疑的变异核苷酸或相应正常核苷酸互补的末端核苷酸通常是在核苷酸顺序的3′端。可疑的变异核苷酸最好是因相应正常核苷酸的点突变形成的。

所说的核苷酸顺序可有10至50个碱基对，如10至36个碱基对。

根据本发明的另一个特征，我们提供了如上文所限定的核苷酸顺序，其中该顺序的末端核苷酸与因相应正常核苷酸分别改变为（Ⅰ）A、（Ⅱ）G、（Ⅲ）C、（Ⅳ）T或u而产生的变异核苷酸互补。

根据本发明的另一个特征，我们提供了如上文限定的一组两个核苷酸顺序，其中一个顺序的末端核苷酸互补于与已知的遗传性疾病相联系的可疑的变异核苷酸，而另一个顺序的末端核苷酸则与相应的正常核苷酸互补。

根据本发明的另一个特征，其提供了含有前述之核苷酸顺序的探针，该探针携带有标记或加标志的成分。

借助对下列已知遗传性疾病的描述，显示了因突变导致的疾病及其突变的相关参考文献。上文中限定的核苷酸顺序和探针分别与下示遗传性疾病相关联，而相应的核苷酸顺序和探针的顺序则可从表中列示的参考文献中查到。

表：引起遗传性疾病的突变

常染色体

疾病突变参考文献

抗凝血酶Ⅲ缺乏症 CG→TG Duchange et al

Nucleic Acids Research

14：2408（1986）

淀粉样变性多发神经炎 CG→CA Maeda S.et al.，

Mol.Biol.Med，

329-338（1986）

AC→CG Wallace M R.et，al，

J.Clin.Invest

78：6-12（1986）

AG→GG Wallace M R.et al，

J.Clin.Invest

78：6-12（1986）

α1-抗胰蛋白酶缺乏症 TG→CG Nukiwa T.et al.，

J.Biol.Chem.

261：15989-15994（1986）

CG→CA Kidd VJ et al.，Nature

304：230-234（1983）

GAT→GTT Asp 256-Val，Exon Ⅲ;

unreported.

疾病突变参考文献

CTT→CTC deletion of codon 51

（normal）M Malton，in

press.

GGC→TGC Arg³⁹-Cys，Exon Ⅱ;Ⅰ

variant，unreported.

碱基对突变参考文献

腺苷脱氨酶缺乏症 CG→CA Bonthron DT.et al.，

J.Clin Invest

76：894-897（1985）

AA→AG Valerio D.et al

EMBO J 5：113-119（1986）

CT→CG ″ ″

脱辅基脂蛋白E缺乏症 GT→GC Cladaras et al

J.Biol.Chem.

262：2310-2315（1987）

碱基对突变参考文献

糖尿病（轻度） TC→CC Haneda M.et al.，

Proc.Natl.Acad.Sci.USA

80：6366-6370（1983）

TC→TG Shoelson S.et al.，

Nature 302：540-543

（1983）

TG→TT ″ ″

高歇氏病（2型） CT→CC Tsuji S.et al.，

N.Engl.J.Med.

316：570-575（1987）

高胰岛素血症（家族性） CG→CA Shibasaki Y.et al.，

J.Clin.Invest.

76：378-380（1985）

CA→GA Chan SJ.et al.，

Proc.Natl.Acad.Sci

USA 84：2194-2197

（1987）

疾病突变参考文献

免疫球蛋白k缺乏症 CT→CG Stavnezer-Nordgren J.

et al.，Science 230：

458-461（1985）

CG→TG ″ ″

LDL受体缺乏症 GG→GA Lehrman MA et al.，

Cell 41：735-743（1985）

成骨不全症（Ⅱ型） TG→TT Cohn DH et al.，

Proc Natl Acad Sci

USA 83：6045-6047（1986）

苯丙酮尿症 AG→AA Dilella AG et al

Nature 322：799-803

（1986）

CG→TG Dilella A G et al.，

Nature 327：333-336

（1987）

蛋白C缺乏症 CG→TG Romeo G.et al

Proc Natl Acad Sci USA

84：2829-2832（1987）

疾病突变参考文献

GG→GC ″

嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症 TG→TA Williams SR.et al.，

J.Biol.Chem.262：

2332-2339（1987）

镰状细胞性贫血 GAG→GTG Chang JC.and Kan YW.

Lancet 2，1127-9（1981）;

Orkin SH.et al.，New Eng.

J.Med.307，32-6（1982）;

and Conner BJ et al Proc.

Natl.Acad.Sci.USA.，80，

278-82（1983）.

丹吉尔病 AG→AT Law SW.Brewer HB J.Biol.

Chem.260：12810-128814（1985）

疾病

β-地中海贫血

突变体类别分型参考文献

a）非功能性mRNA无义突变体

（1）密码子17（A→T） O Chang JC et al

Proc.Natl.Acad.Sci.

USA 76：2886（1979）

突变体类别分型参考文献

（2）密码子39（C→T）O Trecartin RF et al

J.Clin.Invest.68：

1012（1981）

and Chehab，FF et al

Lancet i：3（1986）

（3）密码子15（C→A）O Kazazian HH et al

Eur.Molec.Biol.org.J.

3：593（1984）

（4）密码子37（G→A）O Boehm.CD et al

Blood 67：1185（1986）

（5）密码子121（G→T）O Kazazian HH et al.

Am.J.Hum.Genet.

38：A860（1986）

移码突变体

（6）-2 密码子8 O Orkin SH et al.，

J.Biol.Chem.256：

9782（1981）

突变体类别分型参考文献

（7）-1密码子16 O Kazazian HH et al

Eur.molec.Biol.org.

J.3：593（1984）

（8）-1密码子44 O Kinniburgh.AJ et al

Nucleic Acids Res

10：5421（1982）

（9）-1密码子8/9 O Kazazian HH et al

Eur.molec.Biol.org.

J.3：593（1984）

and Wong C et al

Proc.Natl.Acad.Sci.

USA 83：6529（1986）

（10）-4密码子41/42 O Kazazian，HH et al

Eur.molec.Biol.org.J

3：593（1984）

and Kimura，A et al

J.Biol.Chem.258：

2748（1983）.

（11）-1密码子6 O Kazazian HH et al

Am.J.Hum.Genet.35：

1028（1983）

突变体类别分型参考文献

（12）+1密码子71/72 O Cheng TC et al

Proc.Natl.Acad.Sci.

USA 81：2821（1984）

（b）RNA加工突变体

切接改变

（1）IVS 1位置1 GT→AT O Orkin，SH et al

Nature 296：627（1982）

and Treisman R，et al

Nature 302：591（1983）

（2）IVS 1位置1 GT→TT O Kazazian，HH et al

Eur.molec.Biol.org.

J.3：593（1984）

（3）IVS 2位置1 GT→AT O Orkin，SH et al，Nature

296，627（1982）

and Treisman，R et al

Cell 29：903（1982）

（4）IVS 1 3′端：-17bp O Bunn HF et al，

Haemoglobin：molecular

突变体类别分型参考文献

genetic and clinical

aspects，p.283（Saunders，

Philadelphia 1986）

（5）IVS 1 3′端：-25bp O Kazazian，HH et al.，

Eur.molec.Biol.org.J.，3：

593（1984）

and Orkin，SH et al.

J.Biol.Chem.258：

7249（1983）.

（6）IVS 2 3′端：AG→CG O Padanilam BJ，et al

Am.J.Hematol 22：259

（1986）

（7）IVS 2 3′端：AG→CG O Antonarakis SE，et al

Proc.Natl.Acad.Sci.USA

81：1154（1984）

and Atweh GF et al

Nucleic Acids Res.13：

777（1985）.

突变体类别分类参考文献

相符性改变

（8）IVS 1位置 5（G→C） + Kazazian，HH et al

Eur.molec.Biol.org.

J.3：593（1984）

and Treisman，R et al

Nature 302：591（1983）

（9）IVS 1位置（G→T） O Wong C et al

Proc.Natl.Acad.Sci.USA

83：6529（1986）

and Atweh，GF et al

Nucleic Acids Res.13：

777（1985）.

（10）IVS 1位置6（T→C） + Orkin，SH et al

Nature 296：627（1982）

and Atweh GF et al

Am.J.Hum.Genet.38：85

（1986）

内部IVS改变

（11）IVS 1位置110（G→A） + Westaway，D et al

Nucleic Acids Res.9：

1777（1981）

突变体类别分类参考文献

（12）IVS 2位置705（T→G） + Dobkin，C et al

Proc.Natl.Acad.Sci.

USA 80：1184（1983）

（13）IVS 2位置745（C→G） + Orkin，SH et al

Nature 296：627（1982）

and Treisman，R et al

Nature 302：591（1983）

（14）IVS 2位置654（C→T） O Cheng TC et al

Proc.Natl.Acad.Sci.USA

81：2821（1984）

（15）IVS 1位置116（T→G）？ Feingold EA et al

Ann.N.Y.Acad.Sci

445：159（1985）

编码区置换

（16）密码子26（G→A） β⁺，β^εThein SL et al

J.Med.Genet.

（in press 1986）

and Orkin SH et al

Nature 300：768

（1982）

突变体类别分型参考文献

（17）密码子24（T→A） + Goldsmith et al

Proc.Natl.Acad.Sci USA

88：2318（1983）

（18）密码子27（G→T）β⁺，βKnossos Orkin SH et al

Bolld 64：311（1984）

（c）转录突变体

（1）-88 C→T + Wong，C et al

Proc.Natl.Acad.Sci.USA

83：6529（1986）

Orkin SH et al，

J.Biol.Chem.259：

8679（1984）

（2）-87 C→G + Orkin SH et al

Nature 296：627（1982）

and Treisman R et al

Nature 302：591（1983）

（3）-31 A→G + Takihara Y et al

Blood 67：547（1986）

突变体类别分型参考文献

（4）-29 A→G + Antonarakis SE et al

Proc.Natl.Acad.Sci.USA

81：1154（1984）

and Wong C et al

Proc.Natl.Acad.Sci.USA

83：6529（1986）

（5）-28 A→C + Surrey S et al

J.Biol.Chem.260：6507

（1985）

（6）-28 A→G + Orkin SH et al

Nucleic Acids Res.

11：4727（1983）

（d）聚腺苷酸化突变体

（1）AATAAA→AAGAAA + Orkin SH et al

Eur.molec.Biol.org.J.

4：453（1985）

突变体类别分型参考文献

（e）缺失

（1）3′β（-619bp） O Spritz.RA et al

Nucleic Acids Res.

10：8025（1982）

and Orkin，SH et al

Proc.Natl.Acad.Sci.USA

76：2400（1979）

（2）5′β（-1.35kb） O HbF Padanilam.BJ et al

Blood 64：941（1984）

（3）β（-10kb） O HbF Gilman.JG et al

Br.J.Haemat.56：339

（1984）

+＝导致β球蛋白链生成减少的β地中海贫血突变体（β^-）

0＝导致β球蛋白链不能产生的突变体（β⁰）

疾病突变参考文献

磷酸丙糖异构酶缺乏症 AG→AC Daar IO.et al.，Proc.Natl.

Acad.Sci USA 83：7903-7907

（1986）

疾病突变参考文献

尿卟啉原脱羧酶缺乏症 GG→GA De Vernenil H.et al.，

Science 234：732-734（1986）

血友病A 因子Ⅷ CG→TG（24） Gitschier J.et al

Nature 315：427-430

（1985）

CG→TG（26） ″ ″

CG→TG（18） Antonarakis SE et al.，

N.Engl.J.Med.313842-

848（1985）

CG→CA（26） Gitschier J.et al

Science 232：1415

1416（1986）

CG→TG（18） Youssoufian H.et al.，

Nature 324：380-382

（1986）

CG→TG（22） ″ ″

血友病B 因子Ⅸ CG→CA Bentley AK et al.

Cell 45：343-348 1986

GT→TT Rees DJG et al.，

Nature 316：643-

645（1985）.

疾病基因突变参考文献

GA→GG Davis LM et al.，

69：140-143（1987）

有关缺失的例子可参见：

Forrest S M，Cross G C，Speer A，Gardner-Medwin D，Burn J，and Davies K E（1987）Preferential deletion of exons in Duchenne and Becker muscular dystrophies.Nature 320，638-640.

Koenig M，Hoffman E P，Bertselson C J，Monaco A P，Feener C and Kunkel L M（1987）Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy（DMD）cDNA and preliminary genomic organisation of the DMD gene in normal and affected individuals.Cell 50，509-517.

Malhotra S B，Hart K A，Klamut H J，Thomas N S T，Bodrug S E，Burghes A H M，Bobrow M，Harper P S，Thompson M W，Ray P N and Worton R G（1988）Frame-shift deletions in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy，Science 242，755-759.

Read A P，Mountford R C，Forrest S M，Kenwrick S J，Davies K E and Harris R（1988）Patterns of exon deletions inDuchenne and Becker muscular dystrophy.Hum.Genet.80，152-156.

Chamberlain J S，Gibbs R A，Ranier J E，Nguyen P N and Caskey C T（1988）Deletion screening of the DMD locus viamultiplex DNA amplification.Nuc，Ac.Res.16;23，11141-11156.

Roberts R G，Cole C G，Hart K A，Bobrow M and Bentley D R（1989）Rapid carrier and prenatal diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy，Nuc.Ac.Res.17;2，811.

已经发现，通常只需很少量的基因组DNA样品即可进行分析。在杂交分析法中，通过增加核苷酸顺序的拷贝数就能方便地估计诊断引物对相关正常或变异核苷酸顺序的特异性。例如，这可通过构建一个双链“暗盒”（“Cassette”）来完成，该“暗盒含有一个与变异顺序退火的正常顺序，相邻链上的两核苷酸间的错配最好存在于暗盒的中部。将暗盒***质粒受体，然后再复制质粒并分离所需顺序，即得到暗盒的拷贝，其中使用的所有技术都是已知的。这一技术图解显示于图10中。

为了便于更完整地理解本发明，下面通过实施例和附图作进一步的描述：

图1（a）和（b）图解显示了本发明的第一个实施方案，图1（a）显示该试验中所作电泳的典型结果;

图2（a）和（b）图解显示了本发明的单二个实施方案;

图3图解显示了鉴别多重扩增产物的优选方法;

图4（a）和（b）图解显示了本发明的第三个实施方案;

图5（a）、（b）和（c）图解显示了本发明的第四个实施方案;

图6（没按比例）显示人α1-抗胰蛋白酶基因的酶切图;

图7显示实施例1和2中所作凝胶电泳的可见结果;

图8显示一凝胶电泳的可见结果;其中1～4泳道代表实施例3的结果;5～8泳道显示实施例4的结果的一部分;9泳道显示分子量标志。

图9显示实施例4中所作凝胶电泳的可见结果。

图10图解显示使用暗盒质粒***扩增所需的DNA双螺旋;

图11图解显示本发明的第五个实施方案（线性扩增）;

图12显示实施例5中所作凝胶电泳的可见结果;

图13显示实施例6中所作凝胶电泳的可见结果。

图1图解说明了本发明的第一个实施方案的方法。图1（a）显示含有一正常核苷酸（N）的变性的基因组DNA链，其中正常核苷酸位置上可能存在作为遗传性疾病之结果的可疑的变异核苷酸。在杂交条件下，有合适的三磷酸核苷及三磷酸核苷的聚合因子存在时，使上述的核酸链与其中3′末端核苷酸互补于正常核苷酸（-N）的诊断探针接触，导致如图1所示之以3′方向进行的诊断引物的链延伸。但当所用的诊断引物的3′端核苷酸与可疑的变异核苷酸（-M）互补时，便不会发生这种链延伸。然后使诊断引物的链延伸产物变性，并使扩增引物（A）与之杂交，即可形成进一步的链延伸产物。再使该链延伸产物变性，并重复该方法以使之扩增。在图1（b）中，用诊断引物扩增的该基因组DNA区域被定名为DG。来自该区域的诊断产物在图1（c）中显示为DG带。作为对照，在该核酸链或另一核酸链（如人DNA的另一个染色体上）之分开的位点上使用了图1（a）中标示为P的PCR（聚合酶链反应）引物（P）。该分离的位点在图1（C）中示为PCR，来自该位点的PCR对照产物为图1（C）中标示PCR的带。标示为PCR的带所代表的产物比DG带所代表的产物更大或更小些。

图1（c）显示了图1（a）和1（b）中所示方法的结果，其中使用了-M或-N诊断引物作为合适引物，以用琼脂糖凝胶电泳中分辨的带来分析点突变引起的遗传紊乱。当受试者是遗传性疾病携带者（C）时，就可以看到涉及正常（N）核苷酸顺序和变异（M）核苷酸顺序的带。正常纯合子（N）只显示与正常核苷酸顺序相关联的带，但是没有与变异核苷酸顺序相关联的带〔图中示作（）〕，携带遗传性疾病的受试者的纯合子没有与正常核苷酸顺序相关联的带〔示作（）〕，但有与变异核苷酸顺序相关联的带。

图2图解说明了本发明的第二个实施方案。双链核酸的每条链使用一个诊断引物。尽管方法与图1中描述者相关，但如果存在相关的核苷酸，则由两个不同的诊断引物起始扩增。在这一实施方案中，第二个诊断引物等于图1中的扩增引物（A）。这样，图2（a）所示的扩增将由引物（-N和-M）起始，而不是由具有与变异核苷酸顺序（-M和-N）互补之3′末端核苷酸的诊断引物起始。图2（b）所示者，因为样品的核苷链中有变异顺序，故与上述情况相反。图2中所示的结果是以图1（c）所示结果的相似方式给出的，但其中所示的正常和变异（N和M）顺序相当于这些顺序匹配对象。图2中字母P代表用作对照的PCR引物。

图3显示了鉴别多重扩增产物的一种途径，借以能够检测单个RNA或DNA样品中存在的许多遗传条件。图中所示的样品DNA或RNA的两条链（变性的）含有编号为1、2、3的三个分离的位点。将由这些位点中去除的另一个区域用作PCR扩增的对照。就位点（1）来说，使用了20mer诊部引物（5′-N3′）连同另外20mer（3′N-5′）诊断引物。由于图中的3′末端核苷酸是正常的（如试验样品中的相应核苷酸一样），所以发生了扩增。相似地，如果试验样品的相关核苷酸是变异核苷酸，并且所使用的诊断引物也带有3′末端变异核苷酸，也可发生扩增。但是当样品中的相关核苷酸与诊断引物的3′末端核苷酸之间错配时，则不会发生这种扩增。如果发生扩增，所设计的诊断引物便可在位点（2）产生49mer扩增产物，而在位点（3）产生59mer扩增产物。因为从上面可以看出，扩增产物带的大小是两个诊断引物大小的总和减1，故有可能通过设计出对各有用位点特征化的个别诊断引物，而在一个反应容器中对单一样品进行多次试验。随着诊断引物大小总和的增加，这样就有可能在琼脂糖凝胶上分辨出扩增产物。如果对诊断引物进行标记或加以标志（如可用任何方便的方法），便可以改善分辨率，使之在丙烯酰胺凝胶上显示出来。图3中的字母P代表作为对照的PCR引物。

图4图解显示了本发明的第三个实施方案，其中对可能有可疑之变异核苷酸的位置上含有正常核苷酸的核酸顺序进行扩增，如可使用常规的PCR引物。相似地，如果以可疑的变异核苷酸取代正常核苷酸，也能发生常规扩增。该扩增引物与上述诊断引物接触与本发明的第三个实施方案有关。扩增产物包括一个含有上述正常核苷酸的核酸顺序，并使用了具有3′末端正常核苷酸的诊断引物，当提供合适的三磷酸核苷和三磷酸核苷的聚合因子时，即可形成诊断引物的延伸产物〔使用由常规PCR扩增法产生的核苷酸顺序（这里称之为PCR对照产物）作模板〕。因为用于产生诊断引物延伸产物的模板已被扩增，所以不必使用扩增引物。可使用电泳技术来检测是否存在诊断引物延伸产物（在图4（b）中示为DG）及PCR对照产物（在图4（b）中示为PCR）。

当对照产物含有变异核苷酸，且所用的诊断引物具有一个互补于变异核苷酸的3′末端时，也能形成诊断引物延伸产物。

所得到的产物带是可以看到的，此如图4（b）所示。图中符号N-，M-，C-，N，D，DG和PCR的定义如图1（c）所示。然而，诊断引物延伸产物带的分子量比PCR对照带的分子量要低些（如图4（b）所示）。在这种情况下，对照带代表一个真正的内部对照，因为PCR引物之一是用作诊断引物延伸产物扩增之扩增引物的。当PCR对照产物含有变异核苷酸，并且诊断引物具有-3′末端正常核苷酸时，便没有延伸产物生成。

如果需要，可在检测开始时使待检样品不仅与PCR引物而且也与诊断引物接触，以完成本发明的第三个实施方案。在PCR对照产物的扩增达到预定程度之前，不必延迟使用诊断引物。事实上，诊断引物可与PCR引物一起使用，或在使用PCR引物后的任何时间使用。所以，将待检样品简单地加到一个容器中即可进行检测，其中容器内包含有PCR引物、诊断引物、合适的三磷酸核苷和三磷酸核苷的聚合因子。所得到的产物和所看到的产物带与上述的并在图4中显示者是一样的。

图5图解说明了本发明的第四个实施方案，其中的常规扩增是按图4中所示的步骤完成的。然后，在杂交条件下使所得到的扩增产物与a）两个上文中已限定的含3′末端正常核苷酸的分离的诊断引物或b）两个上文中已限定含3′末端变异核苷酸的诊断引物接触（见图5a）。一次循环后形成延伸产物即可证明样品核酸中是否含有正常或可疑的变异核苷酸，电泳技术产生的带型与图5b中所示者相似。但在使用两个诊断引物时，一个诊断引物是作为另一个诊断引物的扩增引物。因此，必要时所得到的任何延伸产物本身也可进行扩增。这样，经数次循环后，如图5（c）附加带所显示的低分子量产物将会根据原始PCR引物寡核苷酸和所加诊断引物的相对比例而成比例地形成。例如可根据基因组上PCR引物结合位点间的距离的增加或减小，很容易地从诊断引物延伸扩增产物中鉴别出PCR扩增产物。

根据需要，可使待测样品在检测开始时不仅与PCR引物而且与诊断引物接触，以完成本发明的第四个实施方案。因此在PCR对照产物的扩增达到预定程度之前，不必延迟使用诊断引物。事实上，诊断引物可与PCR引物一起或在使用PCR引物后的任何时间使用。所以，如通过将待测样品简单地加入一个容器即可进行检测，所说的容器须含有PCR引物、诊断引物、合适的三磷酸核苷和三磷酸核苷的聚合因子。如果检测是以这种方式进行的，则可形成上述的低分子量产物，从而产生图5中所示的附加带。

图6（不是按比例绘出的）显示的人α1抗胰蛋白酶基因是本领域中已知的〔Long G.L.et al.Biochemistry Vol.23，p4828～4837、（1984）〕、图中突出显示了分别携带可能的α1抗胰蛋白酶S和Z突变之外显子Ⅲ和Ⅴ的相对位置。图中特别示出了α1抗胰蛋白酶基因的外显子Ⅲ，并显示了S变异的位置，其中的密码子GAA突变为GTA，导致氨基酸264的谷氨酸残基被缬氨酸残基所取代。引物Ⅰ的顺序为：

5′CCCACCTTCCCCTCTCTCCAGGCAAATGGG 3′ Ⅰ

它与α1抗胰蛋白酶基因的7440-7469位杂交;具有下列顺序的引物Ⅱ：

5′GGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGGTG 3′ Ⅱ

或与具有下示顺序的引物Ⅱa（基于引物Ⅱ有-CT3′错配）：

5′GGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGGTT 3′ Ⅱa

则是根据α1抗胰蛋白酶基因的位置7770-7799而设计的，并可方便地使用之。

图中进一步显示了α1抗胰蛋白酶基因的外显子Ⅴ，并显示了Z变异的位置，该变异是密码子GAG突变为AAG，导致342位的谷氨酸残基被赖氨酸残基所取代。引物Ⅲ的顺序为：

5′TGTCCACGTGAGCCTTGCTCGAGGCCTGGG 3′ Ⅲ

它与α1抗胰蛋白酶基因的位置9890-9919杂交;引物Ⅳ的顺序为：

5′GAGACTTGGTATTTTGTTCAATCATTAAG 3′Ⅳ

它与α1抗胰蛋白酶基因的位置10081-10109杂交，且可方便地使用这些引物。上述的碱基序数是参照Biochem.23，4828-4837（1984）而定的。

图7显示了实施例1和2所得凝胶的可见结果。泳道1代表用AluⅠ裂解的含外显子Ⅴ的质粒;泳道2代表用HaeⅢ裂解的噬菌体φX174DNA分子量标志物;泳道3显示外显子Ⅲ与上述之引物Ⅰ和Ⅱ扩增，以及外显子Ⅴ与上述之引物Ⅲ和Ⅳ扩增，在同一反应混合物中分别产生360bp和220bp的产物。泳道4显示使用上述引物Ⅰ和Ⅱa未发生外显子Ⅲ的扩增，但有外显子Ⅴ与上述引物Ⅲ和Ⅵ的扩增。泳道5显示阴性对照，其中在有效地促进扩增的条件下存在引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，但没有基因组DNA。

图8的泳道1-3中显示了实施例3的结果，泳道5-8中显示了根据实施例4使用正常或突变诊断引物（其中没有不稳定化作用的影响）的结果，泳道9显示分子量标志物噬菌体φX174DNA。泳道1显示使用核苷酸顺序：

5′TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTT Ⅴ作为诊断引物及以上述寡核苷酸Ⅰ作为扩增引物所作分析的结果。所用的人基因组DNA来自于在人α1抗胰蛋白酶基因的潜在S突变点上具有正常核苷酸（A）的正常纯合子。预期的267bp扩增产物清晰可见。泳道2显示使用核苷酸顺序：

5′TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTA Ⅵ

作为诊断引物，以如上定义的寡核苷酸Ⅰ作为扩增引物所作分析的结果。所用的人基因组DNA来自于在人α1胰蛋白酶基因的潜在S突变点上具有正常核苷酸（A）的正常纯合子。存在A-A错配时，则不形成267bp扩增引物。泳道3显示基于使用顺序为

AATGAATTTATCAGCCAAAACTTTTACAGG Ⅻ

和CTCTGGGAGCACAGTACGAAAAACCACTT ⅩⅣ

的脱辅基脂蛋白B基因的对照带。泳道4为空白对照。泳道5显示使用核苷酸顺序

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACG 3′ Ⅶ

作为实施例4中的诊断引物所作分析的结果。诊断引物在潜在Z突变点上携带能与正常核苷酸（C）碱基配对的3′末端核苷酸（G），它可与样品DNA完全互补。所用的样品DNA来自在人α1抗胰蛋白酶基因之潜在Z突变点上具有正常核苷酸的正常纯合子。泳道6显示在实施例4中使用核苷酸顺序：

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACA 3′ Ⅷ

作为诊断引物所作分析的结果。诊断引物有一个3′末端核苷酸（A）能与Z突变点的突变核苷酸（T）配对，但它却与样品DNA完全互补。所用的样品DNA来自人α1胰蛋白酶基因的潜在Z突变点上有正常核苷酸（C）的正常纯合子。

泳道7显示在实施例4中使用式Ⅶ的核苷酸顺序作为诊断引物的分析结果。所用的样品DNA来自患有人抗胰蛋白酶遗传紊乱并在Z突变点有突变核苷酸（T）的纯合子。泳道8显示实施例4中使用式Ⅷ的核苷酸顺序作为诊断引物的分析结果。所用的样品DNA来自患有人抗胰蛋白酶遗传紊乱并在Z突变点有突变核苷酸（T）的纯合子。泳道5～8显示了各试验中所用扩增引物之核苷酸顺序为如上文限定的顺序Ⅳ。可以看出，150bp扩增产物的合成没有因存在A-C错配而被完全抑制（泳道6），但其受到了GT错配的少许影响（泳道7）。

图9显示了实施例4中所作凝胶电泳的可见结果。泳道1和14显示用HaeⅢ裂解的标志物噬菌体X174DNA;泳道2显示使用核苷酸顺序：

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATAGACG 3′ Ⅸ

作为诊断引物，並在人α1抗胰蛋白酶基因（来自正常纯合子）的潜在Z突变点有正常样品DNA之样品DNA存在下所作分析的结果。在3′端第五个核苷酸处诊断引物有细微改变（顺序Ⅸ中下划处-A代替C），但是其3′末端核苷酸（G）则能够与潜在Z突变点的正常核苷酸碱基配对。泳道3显示在人α1抗胰蛋白酶基因之潜在Z突变点的正常样品DNA（来自正常纯合子）存在时，使用核苷酸顺序：

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATAGACA 3′ Ⅹ

作为诊断引物所作分析的结果。在3′末端的第五个核苷酸处，诊断引物有一细微取代（顺序X下划线处-A取代C），且其3′末端核苷酸可与潜在Z突变点的突变核苷酸（T）碱基配对;泳道4显示在来自Z突变杂合子和人α1抗胰蛋白酶缺乏性遗传紊乱携带者的样品DNA存在下，用顺序Ⅸ（如上文中所限定的）作为诊断引物所作分析的结果;泳道5显示在来自Z突变杂合子、人α1抗胰蛋白酶缺乏性遗传紊乱携带者的样品DNA存在下，用顺序X（如上文中限定的）作为诊断引物时所作分析的结果;泳道6显示在来自人α1抗胰蛋白酶遗传紊乱者纯合子的样品DNA存在下，用顺序Ⅸ（如上文中所定义的）作为诊断引物时所作分析的结果;泳道7显示在来自人α1抗胰蛋白酶遗传紊乱者纯合子之样品DNA存在下，以顺序Ⅹ（如上文所限定的）作为诊断引物所作分析的结果。

泳道8显示在人α1抗胰蛋白酶基因之潜在突变点处为正常核苷酸（C）的样品DNA（来自正常纯合子）存在下，使用核苷酸顺序：

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGCCG 3′ Ⅺ

作为诊断引物所作分析的结果。在3′末端第3个核苷酸处，诊断引物有一细微改变（顺序Ⅺ下划线处-C替代A），但3′末端核苷酸（G）能与潜在Z突变点的正常核苷酸（C）碱基配对;泳道9显示在潜在Z突变点为正常核苷酸的样品DNA（来自正常纯合子）存在下，使用核苷酸顺序：

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGCCA 3′ Ⅻ

作为诊断引物所作分析的结果。诊断引物在3′端第3个核苷酸处有一细微的改变（顺序Ⅻ的下划线处-C取代A），且其3′末端核苷酸（A）与潜在的Z突变点的突变核苷酸（T）（假如存在的话）碱基配对;泳道10显示来自有Z突变的人α1抗胰蛋白酶缺乏性遗缺紊乱者的杂合子样品DNA存在下，使用核苷酸顺序Ⅺ（如上文所限定的）作为诊断引物所作分析的结果;泳道11显示在来自有Z突变之人α1抗胰蛋白酶遗传紊乱者的杂合子样品DNA存在下，以核苷酸顺序Ⅻ（如上文所限定的）作为诊断引物所作分析的结果;泳道12显示在来自抗胰蛋白酶缺乏性遗传紊乱者纯合子之样品DNA存在下，以核苷酸顺序Ⅺ（如上面中受限定的）作为诊断引物所作分析的结果;泳道13显示在来自人抗胰蛋白酶遗传缺陷之纯合子的样品DNA存在下，以核苷酸Ⅻ（如上文所限定的）作为诊断引引物所作分析的结果。

在泳道2-13中，以式Ⅳ的核苷酸顺序作为扩增引物，并用式ⅩⅢ所示的核苷酸顺序

AATGAATTTATCAGCCAAAACTTTTACAGG ⅩⅢ

和式ⅩⅣ的核苷酸顺序

CTCTGGGAGCACAGTACGAAAAACCACTT ⅩⅣ

作为对照。图9中，相应于对照的带标示为（C），并相当于从人脱辅基脂蛋白B基因之外显子26开始的510bp扩增产物。

图10图解说明了暗盒质粒***的使用。质粒pAT153具有贡献氨苄青霉素（Ap^r）和四环素（Tc^r）抗性的区域，并且具有被EcoRⅠ和BamHⅠ消化的限制性位点EcoRⅠ、BamHⅠ和SalⅠ位点。将合成的暗盒〔其含有一个因存在正常和突变顺序而产生的错配核苷酸（在中央部分）的DNA双螺旋〕用T4DNA连接酶连接到所示的质粒宿主中。然后按所述方法复制并选择该质粒。

对该***作更详细地描述如下：制备合成的DNA载体，其各包含两个具有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性末端的退火的65mer，及由于存在变异核苷酸所致的中间碱基对错配。将这些暗盒引入上述pAT153质粒宿主中，转化后分离四环素敏感性克隆并提取质粒。然后将质粒用于第二次转化，以得到有正常或变异***段的克隆。为了证明克隆含有完整的正常或突变顺序，各取2μg，用NaOH变性处理后，使用T4DNA聚合酶（Seguenase，US Biochemicals）和³²P末端标记的引物测定其核苷酸顺序。如已发现每种类型的至少一个正常的或变异的核苷酸顺序，即将各有代表性的克隆进行大量增殖、提取质粒并使用CsCl梯度纯化之。然后用SalⅠ消化暗盒，用苯酚/氯仿提取、沉淀并用70%乙醇洗。如此得到的暗盒即可用于聚合酶链反应，以检测各种寡核苷酸的敏感性和特异性。

图11图解说明了本发明的第五个实施方案。a）中显示了正常基因组DNA顺序及两个诊断引物：其中一个的3′末端互补于正常基因组DNA顺序，而第二个引物的3′末端核苷酸则与可疑的变异核苷酸互补;b）中显示了变异的基因组DNA顺序及两个同样的诊断引物。当于允许互补杂交的条件下，各基因组DNA顺序与引物接触时，均可发生杂交。在允许引物延伸的条件下加入所有四种三磷酸，只有在a）加入正常顺序引物和b）变异顺序引物的情况下形成延伸的产物，其他引物的延伸则因错配受到阻止。此外如3）中所示，在只加入三种或不到三种适当的三磷酸核苷时，则在在给定点上的适当引物的延伸因缺少适当的三磷酸核苷而受到阻止。

图12显示了实施例5中所得凝胶的可见结果。

泳道1和2相当于正常纯合子的DNA，泳道3和4为杂合子（MS）DNA，泳道5和6相当变异之纯合子（SS）的DNA。泳道1，3和5中使用了寡核苷酸ⅩⅫ（正常的），泳道2，4和6使用了寡核苷酸ⅩⅪ（变异的）。泳道2或5中没有出现预期的寡核苷酸延伸。检测到的产物带用Ⅴ形符号标示。

图13显示了实施例6中所得凝胶的可见结果。

最左边的泳道显示大小标志物，用以确定所得产物的大小。泳道1和2相当于得自正常纯合子（MM）的DNA，泳道3和4相当于得自杂合子（MZ）的DNA，泳道5和6相当于得自变异之纯合子的DNA。泳道1、3和5使用了引物ⅪⅩ和Ⅺ;泳道2、4和6使用用了引物Ⅻ和ⅩⅩ。泳道2或5中未显示有预期的引物延伸。检测到的产物带用Ⅴ形符号标示。

α1-抗胰蛋白酶S座位（外显子Ⅲ）的顺序

下面给出碱基为各座位的正常顺序。引物中划下线的碱基显示有明确的错配，以致使引物失去稳定。其等同物是由Long等人（1984）（Biochemistry 23：4828-4837）标记的。

5′GCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGT ⅩⅪ

5′GCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGA ⅩⅫ

5′CTTCCTGCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGa

AAGGACGGACTACTCCCCTTTGATGTCGTGGACCt

aAAATGAACTCACCCACGATATCATCACCAAGTTCCTGGA

tTTTACTTGAGTGGGTGCTATAGTAGTGGTTCAAGGACCTTT 5′

TTTTACTTGAGTGGGTGCTATAGTAGTGGT 5′ⅩⅩⅢ

ATTTACTTGAGTGGGTGCTATAGTAGTGGT 5′ⅩⅩⅣ

CACACCTCTTAGCCATGTTGGGACTGAGGCCCATCAGGACTGGC 3′

GTGTGGAGAATCGGTACAACCCTGACTCCGGGTAGTCCTGACC

GTGGAGAATCGGTACAACCCTGACTCCGGG 5′

TTGGAGAATCGGTACAACCCTGACTCCGGG 5′

α1-抗胰蛋白酶Z座位（外显子Ⅴ）的顺序

下一列所示的碱基为各座位的正常顺序。引物中划下线的碱基显示***了明确的错配，致使引物失去稳定。

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCCTCGACA ⅩⅥ

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCCTCGACG ⅩⅤ

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATAGACA Ⅹ

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATAGACG Ⅸ

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGCCA Ⅻ

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGCCG Ⅺ

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACA Ⅷ

5′CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACG Ⅶ

5′TCCAGGCCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACg

GGTCCGGCACGTATTCCGACACGACTGGTAGCTGc

gAGAAAGGGACTGAAGCTGCTGGGGCCATGTTTTTAGA

cTCTTTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTACAAAAATCTCCGG 5′

CTCTTTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTAC 5′ ⅩⅦ

TTCTTTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTAC 5′ⅩⅧ

CTCATTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTAC 5′ⅩⅨ

TTCATTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTAC 5′ⅩⅩ

下列实施例旨在阐明而不是限定本发明。实施例中除个别指出者外，所用材料的量或浓度如下：

底物DNA：1μg人基因组DNA;

寡核苷酸：100pM合适的寡核苷酸;

三磷酸脱氧核苷：终浓度均为1.5mM;

缓冲液（在反应混合物中的终浓度）：

67mM Tris（pH8.8，加有Hcl），

16.6mM硫酸铵，

6.7mM氯化镁，

10mM β-巯基乙醇，

6.7μM EDTA

装添缓冲液：35%Ficoll 70（Ficoll 70是使蔗糖和表氯醇共聚而得到的合成的聚合物，共聚体的平均分子量为

70，000，其为Pharmacia公司的产品）

200mM Tris-乙酸盐

100mM乙酸钠

5mM DETA

0.2%溴酚兰

大小标志物：用HaeⅢ裂解的噬菌体φX174DNA;以碱基

对数表示的带的大小为：1353、1078、8、603、310、281、271、234、194、118和72。

实施例1

在1.5ml有螺旋盖的小离心管中混合加入1μg人基因组DNA、各100pM前述寡核苷酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ、各1.5mM四种三磷酸脱氧核苷及缓冲液（其最终浓度如前所述），并加无菌蒸馏水将总体积调到100μl。封盖离心管并在沸水浴中放置5分钟。加入1μl含1个酶单位的Taq聚合酶（Anglian Biotech batch 3，用上述缓冲液稀释至1单位/μl）起始反应。将离心管于58℃保温4分钟，再于91℃保温5分钟。以58℃/91℃加热/冷却方式处理反复进行5次，然后加入1单位酶（见上述）。再进行58℃/91℃加热/冷却处理反复6次，然后加入1单位酶（见上述）。再进行58℃/91℃加热/冷却处理反复6次，然后加入1单位酶（见上述）。再作上述处理反复5次，然后加入1单位酶。再重复2次然后加入1单位酶（见上述）。继之于58℃保温20分钟。

取15μl反应混合物与单独的5μl凝胶装添缓冲液混合，然后在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓（2μg/ml）的琼脂糖凝胶（3%“NuSieve”）上电泳以检测扩增产物。用分子大小标志物作对照电泳，以确定扩增产物的分子大小。在透射器（300nm波长）上观察凝胶并摄取偏振照片。图7的泳道3显示了这一观察的结果。从中可以看出外显子Ⅲ与上述引物Ⅰ和Ⅱ扩增产生了一个360bp产物，外显子Ⅴ与上述引物Ⅲ和Ⅳ扩增产生了一个220bp产物。

实施例2

重复实施例1，但其中用前述引物Ⅱa代替引物Ⅱ。图7中泳道4显示该实施例中所得凝胶的可见结果。从中可以看出，使用前述的引物Ⅰ和Ⅱa，没有发生外显子Ⅲ的扩增，但使用前述引物Ⅲ和Ⅳ则发生了外显子Ⅴ的扩增，并得到如实施例1中所述的同样的220bp产物。

因此，实施例2证明了寡核苷酸引物3′末端的错配阻止或至少基本上抑制了聚合酶活性的发挥。

实施例3

人α1-抗胰蛋白酶的S等位基因

在1.5ml有螺旋盖的微量离心管中混合加入1μg人基因组DNA、各100pM下述的寡核苷酸、各1.5mM（终浓度）四种三磷酸脱氧核苷酸和上述终浓度的缓冲液，并用无菌蒸馏水将总体积调至100μl。盖紧离心管并置于沸水浴中5分钟。加入1μl含1个酶单位的Tag聚合酶（Anglian Biotech批号3，用上述缓冲液稀释至1单位/μl）起始反应。将离心管于58℃保温4分钟，再于91℃保温2分钟。于58℃/91℃加热/冷却反复5次后加入1单位酶（见上述）。再于58℃/91℃加热/冷却反复进行6次，之后加入1单位酶（见上述）。将上述加热/冷却程序再反复进行6次，之后再加入1单位酶（见上述），再反复加热/冷却5次后加入1单位酶（见上述），再反复两次然后加入1单位酶（见上述）。经上述处理后，于58℃保温20分钟。

基于上述程序进行下列试验：

a）所使用的寡核苷酸是

5′TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTT Ⅴ

和上文定名为Ⅰ的寡核苷酸。所用的人基因组DNA得自不患人α1抗胰蛋白酶遗传紊乱者的正常纯合子;以及

b）所用的寡核苷酸是

TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTA Ⅵ

和上文中定名为Ⅰ的寡核苷酸。所用的人基因组DNA得自于不患有人α1抗胰蛋白酶遗传紊乱者的正常纯合子。

将15μl反应混合物与分开的5μl凝胶装添缓冲液合并，然后在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓（2μg/ml）的琼脂糖凝胶（3%“NuSieve”）上电泳，以检测扩增产物。同时对分子大小标志物（图8中的泳道9）进行电泳以确定扩增产物的实际分子大小。在透射器（300nm波长）上观察并制取偏振照片。图8中的泳道1和2显示了这一观察的结果。图泳道1显示所用之式Ⅴ的核苷酸顺序具有与样品中潜在的S突变点上相应核苷酸互补的3′末端核苷酸，并且形成了一个267bp的扩增产物。但泳道2则显示因诊断引物之3′末端的错配而没有发生扩增，其中所用诊断引物具有与正常纯合子DNA样品之潜在S突变点上的核苷酸错配的3′末端核苷酸。

实施例4

Z等位基因

在1.5ml加有螺旋盖的微量离心管内混合1μg人基因组DNA、各100pM下文所述的寡核苷酸、各1.5mM（终浓度）四种三磷酸脱氧核苷和上述终浓度的缓冲液，并用无菌蒸馏水将总体积调到100μl。盖紧管口并于沸水浴中放置5分钟。加入1μl含0.5个酶单位的Taq聚合酶（Anglian Biotech批号9，用上述缓冲液稀释至0.5单位/μl）。将离心管于60℃保温4分钟，然后于91℃保温2分钟。于60℃/91℃反复加热/冷却5次，然后加入0.5单位酶（如上述者）。再于60℃/91℃反复加热/冷却6次，然后再加入0.5单位酶（如上述者），将上述加热/冷却过程再重复6次，然后再加入0.5单位酶（如上述者）。再重复5次后再加入0.5单位酶（如上述者），然后再重复3次后再加入0.5单位酶（如上述者）。该处理过程后于60℃保温20分钟。

基于上述方法进行下述检测试验：

a）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅸ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于未患人α1抗胰蛋白酶遗传紊乱者的正常纯合子;

b）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅹ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于未患人α1抗胰蛋白酶遗传紊乱者的正常纯合子;

c）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅸ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于人α1抗胰蛋白酶Z等位基因的杂合子;

d）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅹ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于人α1抗胰蛋白酶Z等位基因的杂合子;

e）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅸ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于患有α1抗胰蛋白酶紊乱者的纯合子（ZZ）;

f）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅹ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于患有α1抗胰蛋白酶紊乱者的纯合子;

g）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅺ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于未患人α1抗胰蛋白酶遗传紊乱者的正常纯合子;

h）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅻ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于未患人α1抗胰蛋白酶遗传紊乱者的正常纯合子;

i）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅺ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于人α1抗胰蛋白酶Z等位基因的杂合子;

j）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅻ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于人α1抗胰蛋白酶Z等位基因的杂合子;

k）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅺ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于患有α1抗胰蛋白酶紊乱者的纯合子;

l）所用寡核苷酸为上文中限定的Ⅻ和Ⅳ，所用的人基因组DNA得自于患有α1抗胰蛋白酶紊乱者的纯合子。

各试验中均使用式ⅩⅢ和ⅩⅣ的核苷酸顺序作为扩增对照。

将15μl反应混合物与5μl分开的凝胶装添缓冲液混合，然后在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓（0.5μg/ml）的1.4%琼脂糖凝胶上电泳，以检测扩增产物。同时对上述分子大小标志物作平行电泳以确定扩增产物的确切大小。在透射器（300nm波长）上观察凝胶并作偏振照象。图9的泳道2-13显示了所作观察的结果，泳道1和14代表分子大小标志物的带。泳道2-7显示因改变3′末端的第5个核苷酸造成的诊断引物不稳定化，并不能在这些反应条件下使引物得以有效地鉴别正常和突变的DNA样品。但泳道8-13则显示改变诊断引物3′末端的第3个核苷酸能够使引物更有效地鉴别正常和突变的DNA样品，因而能得以诊断正常纯合子、患有人α1抗胰蛋白酶紊乱者的杂合子（携带者）或ZZ纯合子。

另外还使用其中没有不稳定化核苷酸改变的诊断引物进行了本实施例的上述实验，所说的诊断引物中3′末端的第七个核苷酸已发生改变（A变化C），从而影响到不稳定化作用。在各情况下，诊断引物并不能完全有效地鉴别正常和突变的DNA样品，图8的泳道5-8已通过对没有附加去稳定化核苷酸改变之诊断引物的分析说明了这一事实。

实施例5

使用寡核苷酸ⅩⅫ（正常的）和ⅩⅪ（变异的）作为引物。本实施例中，在需要三磷酸核苷C之前，A、G和T的dNTP混合物将在模板上形成七个碱基的延伸引物。使用公式Tm＝4（G+C）和2（A+T）计算这些寡核苷酸的Tm为94℃，但据信这只是对多达23mer的寡核苷酸而言，故一般多选用75℃。

在80μl含有5mM Tris-Hcl（pH7.6）、10mM MgCl₂、5mMDTT、100μM亚精胺和100μMEDTA的反应混合物中，使用d³²P ATP（Amersham 2μCi）和T₄多核苷酸激酶（4单位）在5′末端羟基上标记寡核苷酸（各8pmole）。激酶反应于37℃下进行20分钟，然后在15%聚丙酰酰胺变性凝胶/8M尿素上经电泳（500V预电泳1小时，800V主电泳4小时）检查标记的寡核苷酸。

使用两种质粒，一种含有人α1抗胰蛋白酶基因外显子Ⅲ之S座位的正常顺序（MM），另一种则含有相应于变异纯合子（SS）的变异顺序。准备六个试管，每种可能类型的DNA用2个试管。1fmole适当质粒用于纯合子，但杂合子则使用两种质粒各0.5fmole。在各试管中，对每一类型质粒各加入200fmole（2μl标记的溶液）正常（ⅩⅫ）或变异（ⅩⅪ）的寡核苷酸，产生出200倍过量的标记之寡核苷酸。在20μl含有6.7mM EDTA、6.7mM MgCl₂、67mM Tris-Hcl（pH8.8）、10mM巯基乙醇和16.6mM硫酸铵的反应体积中，向各试管所加3种dNTP（A、G和T）的终浓度各为5mM。每种情况下均使用3倍反应体积即60μl，以减小因蒸发造成的影响。将试管煮沸5分钟后置于冰上，然后向各管内加入3单位Taq聚合酶（用1.5mM MgCl₂、50mM Kcl、10mM.Tris（pH8.3）和0.01%明胶将Cetus 1稀释5倍，达到浓度为1单位/μl）。然后将试管以13000rpm离心2分钟，取出2μl并加入5μl甲酰胺/溴酚兰染料。然后将试管置于75℃水浴中。4小时后取出试管，以13000rpm离心1分钟，再取2μl并加入5μl染料。然后再置于75℃水浴中。6小时后取出试管并向各管内再加入3单位Taq聚合酶，以13000rpm离心1分钟并加入1滴轻质矿物油（Sigma）以减少蒸发。然后将试管于75℃放置过夜。从初次离心完毕算起24小时后由水浴中取出试管，离心1分钟并取2μl等分样品加至5μl染料中。所有等分样品均用15%变性的聚丙烯酰胺凝胶/8M尿素〔在1XTBE缓冲液（0.089MTris硼酸盐、0.089M硼酸、0.002MEDTA）中〕以880V电泳5.5小时（此前先以500V预电泳1小时）。然后于室温下，在没有屏敝的慢速曝光胶片上进行过夜放射自显影。结果示于图12中。

泳道1和2相当于正常纯合子（MM）的DNA;泳道3和4相当于杂合子（MS）的DNA;泳道5和6相当于变异纯合子（SS）的DNA。泳道1，3和5中使用寡核苷酸ⅩⅫ（正常的），泳道2、4和6中使用寡核苷酸ⅩⅪ（变异的）。泳道2或5中未出现预期的寡核苷酸延伸。检测到的产物带在图中用Ⅴ形符号标示。

实施例6

在1.5ml容积的加有螺旋盖的微量离心管中混合加入1ng暗盒质粒DNA、各100pmole寡核苷酸引物

TTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAA和

TATGCGACTCCCTGCATTAGGAGCAGCCCA，

各1.5mM（终浓度）四种三磷酸脱氧核苷和有上述终浓度的缓冲液，并用无菌去离子水（Milli-Q）将体积调至100μl。盖紧离心管并于沸水中放置5分钟。加入2单位Taq聚合酶（Cetus）起始反应并用轻质矿物油（Sigma）封闭混合物以防止蒸发。将各管于60℃保温4分钟，然后于90℃保温2分钟。该步骤重复进行三十次。

然后除去60μl反应混合物，并向其中加入60pmole引物ⅩⅨ和Ⅺ（正常的）或引物Ⅻ和ⅩⅩ（变异的）。再加入1单位Taq聚合酶（Cetus）以再次进行反应。将混合物于92℃保温2分钟，然后于60℃保温4分钟。该步骤重复进行4次。使反应混合物的10μl等分样品与凝胶装添“缓冲液”混合然后在含有0.5μg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的3%琼脂糖凝胶（“Nu Sieve”，FMC Bioproducts）上电泳，以检测扩增产物。在透射器（300nm波长）上观察凝胶并进行偏振照相。结果示于图13中。最左侧的泳道为分子大小标志物，用于确定所得产物的分子大小。泳道1和2相当于得自正常纯合子（MM）的DNA，泳道3和4相当于杂合子（MZ）的DNA，泳道5和6相当于得自变异之纯合子（ZZ）的DNA。泳道1、3和5中使用了引物ⅩⅨ和Ⅺ;泳道2、4和6使用了引物Ⅻ和ⅩⅩ。泳道2或5中没有呈现预期的引物延伸。所检测到的产物带在图中用Ⅴ形符号标示。

Claims

1、一种检测含一种或多种核酸的样品中是否存在至少一种变异核苷酸的方法，该方法包括：

在杂交条件下用合适的三磷酸核苷、三磷酸核苷的聚合因子及用于靶碱基顺序之诊断部分的诊断引物一起或相继地处理样品，所说的诊断引物的核苷酸顺序基本上互补于所说的诊断部分，诊断引物的末端核苷酸互补于可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸，因而当所说的诊断引物的末端核苷酸互补于靶碱基顺序中的相应核苷酸时即可合成诊断引物的延伸产物，而所说的诊断引物的末端核苷酸不与靶碱基顺序中的相应核苷酸互补时则不能合成延伸产物；并根据是否存在延伸产物来确定是否有可疑的变异核苷酸。

2、根据权利要求1的方法，其包括：

1）在杂交条件下，用合适的三磷酸核苷、三磷酸核苷的聚合因子、用于靶碱基顺序之诊断部分的诊断引物和相应的扩增引物一起或相继地处理样品，其中所说的诊断引物的核苷酸顺序基本上互补于所说的诊断部分，诊断引物的末端核苷酸则互补于可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸，从而当所说的诊断引物的末端核苷酸互补于靶碱基顺序中的相应核苷酸时即可合成诊断引物的延伸产物，而当所说的诊断引物的末端核苷酸不与靶碱基顺序中的相应核苷酸互补时则不能合成延伸产物;在与其互补物分离之后，所形成之诊断引物的延伸产物即可作为合成所说扩增引物之延伸产物的模板;

2）在变性条件下处理样品，以由形成延伸产物的模板上分离出引物延伸产物;

3）使合适的三磷酸核苷、三磷酸核苷的聚合因子、文中限定的诊断引物和扩增引物一起或相继地与步骤（2）中产生的单链接触，以在可能时使用步骤（2）中产生的单链作模板合成进一步的延伸产物;

4）重复步骤（2）和（3）若干次，以使适当核苷酸顺序的扩增达到可检测的程度;

5）根据是否存在步骤（4）中得到的扩增产物来确定是否有可疑的变异核苷酸。

3、根据权利要求1的方法，其包括用

（a）具有基本上互补于第一个核酸顺序诊断部分之顺序的第一个诊断引物-该第一个诊断引物具有一个互补于所说之可疑变异核苷酸的末端核苷酸，和具有基本上互补于第二个核苷酸顺序诊断部分之顺序的第二个诊断引物-该第二个诊断引物具有一个互补于互补性可疑变异核苷酸的末端核苷酸;或

（b）具有基本上互补于第一个核酸顺序诊断部分之顺序的第一个诊断引物-该第一个诊断引物具有一个与相应于所说的可疑变异之核苷酸的正常核苷酸互补的末端核苷酸，以及具有基本上互补于第二个核酸顺序诊断部分之顺序的第二个诊断引物-该第二个诊断引物具有一个与相应于所说的可疑变异之核苷酸的正常核苷酸互补的末端核苷酸;

所说的第一个诊断引物的末端核苷酸和所说的第二个诊断引物的末端核苷酸均在各自引物的5′端或3′端，且第一个核酸顺序与第二个核酸顺序是反义的。一起或相继地处理样品。

4、根据权利要求1的方法，其包括首先至少扩增含可疑变异核苷酸之样品核酸的一部分，并使用如此得到的扩增产物作为待处理的样品。

5、根据权利要求3的方法，其包括首先至少扩增含可疑变异核苷酸之样品核酸的一部分，并使用如此得到的扩增产物作为待处理的样品。

6、根据权利要求1的方法，其还包括至少重复处理一次样品核苷酸，从而使用同一靶碱基顺序作模板完成延伸产物的线性扩增。

7、根据前述权利要求中任一项的方法，其中互补于可疑之变异核苷酸或相应之正常核苷酸的诊断引物的末端核苷酸处于诊断引物的3′端。

8、根据权利要求6的方法，其中用1、2或3种三磷酸核苷处理样品，从而将形成的延伸产物只能就所存在的1、2或3种三磷酸核苷进行延伸。

9、根据权利8的方法，其中用三种三磷酸核苷处理样品。

10、一个用于本发明之方法的5至50bp的核苷酸顺序，所说的顺序的末端核苷酸互补于与已知的遗传性疾病相关联的可疑变异的核苷酸或相应的正常核苷酸，所说的顺序的其余部分基本上互补于与可疑之变异核苷酸相邻的相应靶碱基顺序或相应的正常核苷酸，当所说的核苷酸顺序在本发明的方法中用作诊断引物时，如果所说的诊断引物的末端核苷酸互补于靶碱基顺序中的相应核苷酸即可合成诊断引物的延伸产物，如果所说的诊断引物的末端核苷酸不与靶碱基顺序中的相应核苷酸互补，则不能合成延伸产物。

11、根据权利要求10的核苷酸顺序，其中末端核苷酸是在核苷酸顺序的3′端。

12、根据权利要求10或11的核苷酸顺序，其中可疑的变异核苷酸是因相应的正常顺序的点突变而形成的。

13、根据权利要求10-12中任一项的一组两个核苷酸顺序，其中一个顺序的末端核苷酸互补于与已知的遗传性疾病相关联的可疑的变异核苷酸，而另一个顺序的末端核苷酸则与相应的正常核苷酸互补。

14、用于检测含一或多种核酸的样品中是否存在至少一个变异核苷酸的药盒，该药盒包括：

（1）适于靶碱基顺序之各诊断部分的诊断引物，各诊断引物的核苷酸顺序基本上互补于所说的诊断部分，诊断引物的末端核苷酸互补于可疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸，这样当所说的诊断引物的末端核苷酸互补于靶碱基顺序中的相应核苷酸时即可合成诊断引物的延伸产物，而当诊断引物的末端核苷酸不与靶碱基顺序中的相应核苷酸互补时，便没有延伸产物合成;

（2）所有四种不同的三磷酸核苷;以及

（3）（2）中三磷酸核苷的聚合因子。

15、根据权利要求14的药盒，其包括一组两个适用于靶碱基顺序中各诊断部分的诊断引物，一个诊断引物的末端核苷酸互补于与已知的遗传性疾病相关联之可疑的变异核苷酸，而另一个诊断引物的末端核苷酸则与相应的正常核苷酸互补。