JP5590781B2 - 標的核酸比率推定方法 - Google Patents
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Description
(1)被検核酸試料中の標的核酸と参照核酸の総量に対する標的核酸のモル比率を推定する方法であって、(a)標的核酸と参照核酸との総量に対する標的核酸の混合比率(モル比)が異なる標準核酸試料系列を調製する工程と、(b)前記工程(a)において調製した標準核酸試料系列のそれぞれの標準核酸試料に対して、下記工程(i)及び(ii)を行う工程と、(c)前記混合比率と前記工程(b)において得られた標的核酸に由来する増幅産物量との関係を近似する第1の連続微分可能関数と、前記混合比率と前記工程(b)において得られた参照核酸に由来する増幅産物量との関係を近似する第2の連続微分可能関数とを、それぞれ算出する工程と、(d)被検核酸試料に対して、下記工程(i)及び(ii)を行う工程と、(e)前記工程(d)において得られた標的核酸に由来する増幅産物量及び参照核酸に由来する増幅産物量、並びに前記工程(c)において得られた第1の連続微分可能関数及び第2の連続微分可能関数から、被検核酸試料中の標的核酸と参照核酸の総量に対する標的核酸の比率を推定する工程と、を有することを特徴とする標的核酸比率推定方法;(i)核酸試料と、標的核酸検出用プライマーと、参照核酸検出用プライマーとを含む反応溶液中で、PCR(Polymerase Chain Reaction)反応を行う工程と、(ii)工程(i)の後、標的核酸に由来する増幅産物量及び参照核酸に由来する増幅産物量を測定する工程、
(2)被検核酸試料中の標的核酸と参照核酸の総量に対する標的核酸のモル比率を推定する方法であって、(a)標的核酸と参照核酸との総量に対する標的核酸の混合比率(モル比)が異なる標準核酸試料系列を調製する工程と、(b)前記工程(a)において調製した標準核酸試料系列のそれぞれの標準核酸試料に対して、下記工程(i’)及び(ii)を行う工程と、(c)前記混合比率と前記工程(b)において得られた標的核酸に由来する増幅産物量との関係を近似する第1の連続微分可能関数と、前記混合比率と前記工程(b)において得られた参照核酸に由来する増幅産物量との関係を近似する第2の連続微分可能関数とを、それぞれ算出する工程と、(d)被検核酸試料に対して、下記工程(i’)及び(ii)を行う工程と、(e)前記工程(d)において得られた標的核酸に由来する増幅産物量及び参照核酸に由来する増幅産物量、並びに前記工程(c)において得られた第1の連続微分可能関数及び第2の連続微分可能関数から、被検核酸試料中の標的核酸と参照核酸の総量に対する標的核酸の比率を推定する工程と、を有することを特徴とする標的核酸比率推定方法;(i’) 核酸試料と標的核酸検出用プライマーとを含む反応溶液中、及び、核酸試料と参照核酸検出用プライマーとを含む反応溶液中で、別個にPCR反応を行う工程と、(ii)工程(i’)の後、標的核酸に由来する増幅産物量及び参照核酸に由来する増幅産物量を測定する工程、
(3)前記標的核酸検出用プライマー及び前記参照核酸検出用プライマーが、蛍光物質により標識されたプライマーであることを特徴とする前記(1)又は(2)記載の標的核酸比率推定方法、
(4)反応溶液中のPCR反応開始前の反応溶液中のプライマー量に対するPCR反応後の反応溶液中の増幅産物量のモル比率の測定を、蛍光相関分光法、蛍光強度分布解析法、及び蛍光偏光解析法からなる群より選択される1以上を用いて行うことを特徴とする前記(3)記載の標的核酸比率推定方法、
(5)前記標的核酸が、変異細胞が有する被検遺伝子由来の核酸であり、前記参照核酸が、正常細胞が有する前記被検遺伝子由来の核酸であることを特徴とする前記(1)〜(4)のいずれか記載の標的核酸比率推定方法、
(6)前記被検遺伝子が、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)遺伝子、JAK2遺伝子、及びBcr−Abl遺伝子からなる群より選択される1の遺伝子であることを特徴とする前記(5)記載の標的核酸比率推定方法、
(7)前記標的核酸が、遺伝子多型のうちの一のタイプを含む配列を有する核酸であり、前記参照核酸が、前記遺伝子多型のうちの前記タイプとは異なるタイプの多型部位を含む配列を有する核酸であることを特徴とする前記(1)〜(4)のいずれか記載の標的核酸比率推定方法、
(8)前記遺伝子多型が、一塩基多型であることを特徴とする前記(7)記載の標的核酸比率推定方法、
(9)前記遺伝子多型が、ミトコンドリアDNAにおける多型であることを特徴とする前記(7)又は(8)記載の標的核酸比率推定方法、
(10)前記標的核酸が寄生生物由来核酸であり、前記参照核酸が宿主生物由来核酸であることを特徴とする前記(1)〜(4)のいずれか記載の標的核酸比率推定方法、
(11)前記標的核酸が遺伝子組み換え植物由来核酸であり、前記参照核酸が非遺伝子組み換え植物由来核酸であることを特徴とする前記(1)〜(4)のいずれか記載の標的核酸比率推定方法、
を提供するものである。
また、本発明においては、遺伝子組み換え植物由来核酸を標的核酸とし、非遺伝子組み換え植物由来核酸を参照核酸とすることにより、被検核酸試料中の遺伝子組み換え植物由来核酸と非遺伝子組み換え植物由来核酸との総量に対する遺伝子組み換え植物由来核酸量の比、すなわち、遺伝子組み換え植物由来核酸含有率を求めることができる。参照核酸とする非遺伝子組み換え植物としては、遺伝子組み換え植物と同じ品種の植物であることが好ましい。例えば、天然のトウモロコシ由来核酸を参照核酸とし、遺伝子組み換えトウモロコシ由来核酸を標的核酸とすることにより、一定量中のトウモロコシにおける遺伝子組み換えトウモロコシの含有比率を求めることができる。
プライマー消費率 =[増幅産物量]/[初期プライマー量]
=[増幅産物量]/([増幅産物量]+[未反応のプライマー量])
本発明の標的核酸比率推定方法を用いて、腫瘍細胞において高頻度に検出されるJAK2遺伝子のV617F変異の変異率を推定した。この体細胞変異は、JAK2の617番目のバリンをコードするコドンGTGの3番目の塩基GがTに変異し、フェニルアラニンとなる変異である。図4に、JAK2遺伝子におけるV617Fの周囲の塩基配列を示す。塩基配列中、下線を付してある部位を、本実施例における標的塩基配列又は参照塩基配列とした。また、図中、[G/T]が変異部位であり、該変異部位がGである塩基配列を参照核酸とし、該変異部位がTである塩基配列を標的塩基配列とした。
図4に示す標的塩基配列を有する標的核酸と、参照塩基配列を有する参照核酸とを、混合比率(標的核酸と参照核酸の総量に対する標的核酸量の割合)がそれぞれ、0、0.05、0.1、0.2.0.5、0.8、0.9、0.95、1.0となるように、それぞれ混合し、9種類の標準核酸試料からなる標準核酸試料系列を調製した。なお、標準核酸試料の調製に用いた標的核酸及び参照核酸は、表1に示すフォワードプライマー(1st−Fw−Primer)とリバースプライマー(1st−Rv−Primer)を用いて、図4に示す塩基配列を有する核酸をPCR増幅し、得られた増幅産物の塩基配列を確認した後、プラスミドに導入したものを、それぞれ用いた。
具体的には、10μLの2×AmpliTaq Gold Master Mix(ABI社製)に、標的核酸と参照核酸の総量が4000コピー(ゲノムDNA約20ng相当量)となるように、標準核酸試料を添加し、さらに、最終濃度が0.5μMとなるように1st−Fw−Primerと1st−Rv−Primerとをそれぞれ添加し、milliQ水で最終容量が20μLとなるように調製したものを、反応溶液とした。該反応溶液を、95℃で10分間処理した後、95℃で30秒間、54℃で30秒間、72℃で30秒間を40サイクル行い、さらに72℃で10分間処理する工程からなる反応条件によりPCR反応を行った。なお、PCR反応は、サーマルサイクラーPTC−200(MJ社製)を用いて行った。このPCR反応後の反応溶液を、増幅処理後の標準核酸試料とした。
増幅処理後の標準核酸試料をテンプレートとし、5’末端がTAMRA標識された標的核酸検出用プライマー(T−Fw−Primer)と、5’末端がATTO647N標識された参照核酸検出用プライマー(G−Fw−Primer)とを含む反応溶液を調製し、PCRを行い、各プライマーのプライマー消費率を測定し、第1及び第2の連続微分可能関数を求めた。各検出用プライマーの塩基配列を表2に示す。なお、リバースプライマーは、いずれも、増幅処理後の標準核酸試料から反応溶液中に持ち込まれるRv−Primerを共通して用いた。
PCR反応後の反応溶液を、10mM Tris緩衝液で100倍に希釈し、蛍光相関分光装置MF−20(Olympus社製)を用いてFCS測定を行った。なお、測定は、1試料につき15秒3回行い、平均値を測定結果とした。測定の結果得られた拡散時間の短い成分を未反応のプライマーとし、拡散時間の長い成分を増幅産物として、両者の比率を求めた後、該比率からプライマーの消費率(K2%)を算出した。
図5は、算出された各プライマーのプライマー消費率(K2%)を混合比率(r)に対してプロットしたものである。図中、「◆」は標的核酸のプライマー消費率を、「◇」は参照核酸のプライマー消費率を、それぞれ示している。この測定結果を、下記に示す式でフィッティングし、標的核酸検出用プライマーのプライマー消費率K2%(T)の連続微分可能関数K2%(T)=F1(r)と、標的核酸検出用プライマーのプライマー消費率K2%(G)の連続微分可能関数K2%(G)=F1’(1−r)とを求めた。図5中、実線で記載がK2%(T)=F1(r)であり、点線がK2%(G)=F1’(1−r)である。
なお、測定値と下記の関数との相関は高く、フィッティング結果は表3のようになった。a(a’)、b(b’)、c(c’)の図形的な意味は、それぞれ、a:K2%の飽和する値、b:K2%が飽和の半分になる変異率、c:変異率0%のときのシグナルである。
上記で得られた曲線で示される混合比率、参照核酸量、標的核酸量の関係を用いて、実際に試料中の標的核酸比率が推定し得ることを確認するために、標的核酸比率既知の測定試料を用いて、得られた曲線から標的核酸比率を推定した。
標的核酸比率既知の測定試料は、シーケンシングにより標的核酸のみを含有することを確認した標的核酸溶液と、同じくシーケンシングにより参照核酸のみを含有することを確認した参照核酸溶液とを、標的核酸比率が0、0.05、0.1、0.2.0.5、0.8、0.9、0.95、1.0となるように、それぞれ調製したものを用いた。各測定試料のコピー数は、高濃度のストック溶液のUV吸収から測定した。
プライマー消費率(K2%)と混合比率(r)の関係を、実施例1とは異なる連続微分可能関数に近似させた場合であっても、本発明の標的核酸比率推定方法により標的核酸比率が推定し得ることを示した。
具体的には、実施例1の<第1及び第2の連続微分可能関数>において得られた各プライマーのプライマー消費率(K2%)を、図5と同様に混合比率(r)に対してプロットした後、下記に示す式でフィッティングし、標的核酸検出用プライマーのプライマー消費率K2%(T)の連続微分可能関数K2%(T)=F2(r)と、標的核酸検出用プライマーのプライマー消費率K2%(G)の連続微分可能関数K2%(G)=F2’(1−r)とを求めた。測定値と下記の関数との相関は高く、フィッティング結果は表4のようになった。得られた関数K2%(T)=F2(r)と関数K2%(G)=F2’(1−r)を用いて、図3と同様にして混合比率、参照核酸量、標的核酸量の関係を示す曲線を得た。
Claims (11)
- 被検核酸試料中の標的核酸と参照核酸の総量に対する標的核酸のモル比率を推定する方法であって、
(a)標的核酸と参照核酸との総量に対する標的核酸の混合比率(モル比)が異なる標準核酸試料系列を調製する工程と、
(b)前記工程(a)において調製した標準核酸試料系列のそれぞれの標準核酸試料に対して、下記工程(i)及び(ii)を行う工程と、
(c)前記混合比率と前記工程(b)において得られた標的核酸に由来する増幅産物量との関係を近似する第1の連続微分可能関数と、前記混合比率と前記工程(b)において得られた参照核酸に由来する増幅産物量との関係を近似する第2の連続微分可能関数とを、それぞれ算出する工程と、
(d)被検核酸試料に対して、下記工程(i)及び(ii)を行う工程と、
(e)前記工程(d)において得られた標的核酸に由来する増幅産物量及び参照核酸に由来する増幅産物量、並びに前記工程(c)において得られた第1の連続微分可能関数及び第2の連続微分可能関数から、被検核酸試料中の標的核酸と参照核酸の総量に対する標的核酸の比率を推定する工程と、
を有することを特徴とする標的核酸比率推定方法。
(i)核酸試料と、標的核酸検出用プライマーと、参照核酸検出用プライマーとを含む反応溶液中で、PCR(Polymerase Chain Reaction)反応を行う工程と、
(ii)工程(i)の後、標的核酸に由来する増幅産物量及び参照核酸に由来する増幅産物量を測定する工程。 - 被検核酸試料中の標的核酸と参照核酸の総量に対する標的核酸のモル比率を推定する方法であって、
(a)標的核酸と参照核酸との総量に対する標的核酸の混合比率(モル比)が異なる標準核酸試料系列を調製する工程と、
(b)前記工程(a)において調製した標準核酸試料系列のそれぞれの標準核酸試料に対して、下記工程(i’)及び(ii)を行う工程と、
(c)前記混合比率と前記工程(b)において得られた標的核酸に由来する増幅産物量との関係を近似する第1の連続微分可能関数と、前記混合比率と前記工程(b)において得られた参照核酸に由来する増幅産物量との関係を近似する第2の連続微分可能関数とを、それぞれ算出する工程と、
(d)被検核酸試料に対して、下記工程(i’)及び(ii)を行う工程と、
(e)前記工程(d)において得られた標的核酸に由来する増幅産物量及び参照核酸に由来する増幅産物量、並びに前記工程(c)において得られた第1の連続微分可能関数及び第2の連続微分可能関数から、被検核酸試料中の標的核酸と参照核酸の総量に対する標的核酸の比率を推定する工程と、
を有することを特徴とする標的核酸比率推定方法。
(i’) 核酸試料と標的核酸検出用プライマーとを含む反応溶液中、及び、核酸試料と参照核酸検出用プライマーとを含む反応溶液中で、別個にPCR反応を行う工程と、
(ii)工程(i’)の後、標的核酸に由来する増幅産物量及び参照核酸に由来する増幅産物量を測定する工程。 - 前記標的核酸検出用プライマー及び前記参照核酸検出用プライマーが、蛍光物質により標識されたプライマーであることを特徴とする請求項1又は2記載の標的核酸比率推定方法。
- 反応溶液中のPCR反応開始前の反応溶液中のプライマー量に対するPCR反応後の反応溶液中の増幅産物量のモル比率の測定を、蛍光相関分光法、蛍光強度分布解析法、及び蛍光偏光解析法からなる群より選択される1以上を用いて行うことを特徴とする請求項3記載の標的核酸比率推定方法。
- 前記標的核酸が、変異細胞が有する被検遺伝子由来の核酸であり、前記参照核酸が、正常細胞が有する前記被検遺伝子由来の核酸であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の標的核酸比率推定方法。
- 前記被検遺伝子が、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)遺伝子、JAK2遺伝子、及びBcr−Abl遺伝子からなる群より選択される1の遺伝子であることを特徴とする請求項5記載の標的核酸比率推定方法。
- 前記標的核酸が、遺伝子多型のうちの一のタイプを含む配列を有する核酸であり、前記参照核酸が、前記遺伝子多型のうちの前記タイプとは異なるタイプの多型部位を含む配列を有する核酸であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の標的核酸比率推定方法。
- 前記遺伝子多型が、一塩基多型であることを特徴とする請求項7記載の標的核酸比率推定方法。
- 前記遺伝子多型が、ミトコンドリアDNAにおける多型であることを特徴とする請求項7又は8記載の標的核酸比率推定方法。
- 前記標的核酸が寄生生物由来核酸であり、前記参照核酸が宿主生物由来核酸であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の標的核酸比率推定方法。
- 前記標的核酸が遺伝子組み換え植物由来核酸であり、前記参照核酸が非遺伝子組み換え植物由来核酸であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の標的核酸比率推定方法。
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