PT89980B

PT89980B - Processo para a deteccao de sequencias de nucleotidos

Info

Publication number: PT89980B
Application number: PT89980A
Authority: PT
Inventors: Alexander Fred Markham; Clive Robert Newton
Original assignee: Zeneca Ltd
Priority date: 1988-03-10
Filing date: 1989-03-10
Publication date: 1999-12-31
Also published as: AU3124689A; EP0332435B1; ES2039294T3; KR970003151B1; EP0332435A3; AU614584B2; ZW3388A1; EP0332435A2; YU49789A; DK118089D0; DK175527B1; JPH0242999A; PL278176A1; HUT52565A; IE61148B1; NO174825C; FI891126A; EP0332435B2; ES2039294T5; JP2853864B2

Description

A.,., *t -· * rspetidas um número de vezes suficiente para dar como resultado uma amplificação detectável do ácido nucleico que contém a variação de sequência ou as variações de sequências, se presentes; (d) fixar o produto da fase (c) a uma membrana; (©) tratar a membrana §ofo condições de hibridação com uma sonda oligonucleotídica de sequência específica marcado capaz de hibridar com a a sequência de ácido nucleico ajnplificada somente se uma sequência da sonda for complementar de uma região de sequência amplificada; e (f) detectar se a sonda hibridou para uma sequência am plificada na amostra de ácido nucleico. A détecção da presença ou d a ausência de pelo menos uma variação nucleótidica pode, em certas situações especiais, ser avaliada por técnicas diferentes. Assim, em casos não habituais em que a mutação pontual cria ou destrói um sitio de restrição (por exemplo anemia de células falciformes), a digestão por enzimas de restrição podem ser empregue quer antes quer depois da amplificação 7”F. F. Chehab et al Nature 329, 293, 1987)^7· Além disso, com respeito a sequências de ácidos nucleicos com supressões extensas podem ser preparadas iniciadores para amplificação para regiões dentro da supressão de que se suspeita tal como a supressão de 23 kb que causa α-talassemia; em tais casos a impossibilidade de amplificar sequência suprimida confirma a supressão e assim por exemplo constitui um diagnóstico de α-talassemia £F. F. Chehab et al, Nature 329, 293 (1987)_y. 0 processo de amplificação da Publicação de Patente Europeia Ns 237 362 proporciona determinada vantagens sobre o RFLP (polimorfismo de comprimento de frag- - 4 - r ι:

mento de restrição) e sobre técnicas de oligonucleótido específico alelo como descritas por exemplo por Kan e Dozy, Proceedings o£ the national Academy of Sciences (USA) 75, 5631 (1978), Robin e Kan, Lancet, 1985-1,75 (1985).

Cbnner et al, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 80, 78 (1983), Kidd et al., Nature, 304 230 (1983) e Piratsu et al, New EnÇland Journal of Medicine, 309, 284 (1983).

I

Contudo a Publicação de Patente Europeia N2. 237 362 descreve um processo que envolve a amplificação indiscriminada de uma sequência particular de interesse o que inevitavelmente tem como resultado a necessidade de um número maior de fases de detecção demoradas envolvendo quer o uso adicional de uma sonda oligonucleotídica de sequência específica marcada que pode necessitar de ser capaz de distinguir entre sequências que diferem nem que se^a por um único nucleótido e/ou o uso de uma endonuclease de restrição específica naqueles casos limitados em que a mutação pontual de interesse cria ou destrói a sequência de reconhecimento de enzima e/ou o uso de métodos de sequencia-ção directos no ADN amplificado / ver c* Wong et al Nature 330, 384 (1987) J?.

Existe uma necessidade de um processo simples para a detecção directa de pelo menos uma diferença de uma única base em ácidos nucleicos tal como ADN genómico no gual as fases da detecção são minimizados dando como resultado um processo que pode ser realizado rapidamente, com precisão e facilidades com conhecimentos mínimos do operador. A presente invenção é baseada na constatação de que pela selecção da sequência nucleotídica de um iniciador oligonucleotidico duma forma apropriada é possível atingir selectivamente a extensão do iniciador quer de uma sequência de que se suspeita que contenha um nucleotido variante quer da sequência correspondente que contém o nu- 5 ϊ

l *·»· ** · cleótido normal quer para prevenir tal extensão do iniciador simplificando deste modo substancialmente os processos de deteoção necessários.

De acordo com uma característica da presente invenção proporciona-se um processo para detectar a presença ou a ausência de pelo menos um nucleótido variante num ou mais em vários ácidos nucleicos contidos nua® amostra, processo este que compreende: tratar a amostra, em conjunto ou sequencialmente com trifosfatos de nucleósidos adequados, com um agente para polimerização dos trifosfatos de nucleósi-dos e com um iniciador de diagnóstico para uma porção de diagnóstico de uma sequência base alvo sob condições de hibrida-ção, sendo a sequência nucleotídica do referido iniciador da referida porção de diagnóstico, sendo o nucleótido terminal do iniciador de diagnóstico quer complementar do nucleótido variante suspeito quer do nucleótido normal correspondente, em que um produto de extensão do iniciador de diagnóstico é sintetizado quando o referido nucleótido terminal do iniciador de diagnóstico é complementar do nucleótido correspondente na sequência de base àlvo, não sendo sintetizado qualquer produto de extensão quando o referido nucleótido terminal do iniciador de diagnóstico não e complementar do nucleótido correspondente na sequência de base alvo; e detectar a presença ou a ausência do nucleótido variante suspeito a partir da presença ou d a ausência de um produto de extensão.

Deverá notar-se que enquanto o processo da presente invenção é de interesse particular na detec-ção da presença ou da ausência de mutações pontuais, o processo ó igualmente aplicável para detectar a presença ou a ausência de supressões, incluindo supressões de mais do que um nucleótido, bem como para detectar a presença ou a ausência de substituições de mais do que um nucleótido. Neste aspecto é simplesmente necessário conhecer os nucleótidos relevantes, especialmente os nucleótidos terminais relevantes, de modo que os iniciadores de diagnóstico necessários possa(m) - 6 -

ser projectado(s) adequadarnente.

Deverá notar-se que qualquer produto de extensão formado pode ser detectado em q ualquer forma conveniente, por exemplo na forma de cadeia simples ou dupla.

Deverá notar-se para além disso que qualquer produto de extensão obtido pode, se se desejar, ser amplificado pela reacção de caêeia de polimerase (PGR) como descrito nas Patentes dos E.U, N^s. 4683195 e 4683202, pelo uso da replicase Q-beta como descrito na Publicação de Patente PCT W087/06270 e em Biotechnology Vol. 6 Outubro de 1988, pelo uso da amplificação de ácidos nucleicos baseada na transcrição de Siska Corporation como descrito na Publicação de Patente PCT WO88/10315, ou pelo uso de amplificação linear. Neste contexto a expressão "amplificação linear" é aqui usada para fazer referência à amplificação que usa um iniciador único para cada porção de diagnóstico na presença de um agente para polimerização e trifosfatos de nucleótidos apropriados em que a amplificação é efectuada pela extensão do iniciador baseado no uso de uma cadeia simples do ácido nucleíco da amostra como molde.

Numa primêira forma de concretização especialmente preferida da presente invenção o processo compreende: 1) tratar a amostra em conjunto ou sequencialmente com trifosfatos de nucleósidos adequados, com um agente para polimerização dos trifosfatos de nucleósidos, com um iniciador de diagnóstico para uma porção de diagnóstico de uma sequência de base alvo e com um ini ciador de amplificação correspondente sob eondições d€ hibridação, sendo a sequência nucleótidica do referido iniciador de diagnóstico tal que e substancialmente complementar da referida porção de diagnóstico, sendo um nucleótido terminal do iniciador de dia- - 7 - .1 Λ

I

3 gnóstico quer complementar do nucleotido variante suspeito quer do nucleotido normal correspondente, em que um produto de extensão do iniciador de diagnóstico é sintetizado quando o referido nucleotido terminal do iniciador de diagnóstico é complementar do nucleotido correspondente na sequência de base alvo, não sendo sintetizado qualquer produto de extensão quando o referido nucleotido terminal do iniciador de diagnóstico não é complementar do nucleótidc correspondente na sequência de base alvo; sendo qualquer produto de extensão do iniciador de diagnóstico formado capaz de servir como molde para sintese dum produto de extensão do referido iniciador de amplificação depois da separação do seu complemento; 2) tratar a amostra sob condições de desnaturação para separar o produto de extensão do seu molde quando tal produto de extensão @ formado; 3) fazer contactar as cadeias simples produzidas na fase (2), quer em conjunto quer sequencialmente, com trifosfatos de nucleósidos apropriados, com um agente para polimerização dos trifosfatos de nucleósidos, com um iniciador de diagnóstico e com um iniciador de amplificação como aqui definido usando, quando possível, para sintetizar mais produtos de extensão as cadeias simples produzidas na fase (2) como moldes. 4) repetir as fases (2) e (3) um número de vezes suficiente para resultar numa amplificação detectável pare a sequência nucleotídiea adequada; e 5) detectar a presença ou a ausência do nucleotido variante suspeito a partir da presença ou da ausência de um produto de amplificação obtido na fase (4). - 8 -

Numa segunda forma de concretização da presente invenção a referida amostra ê tratada# em con- j unto ou sequencialmente em alternativa com (a) um primeiro iniciador de diagnóstico que tem uma sequência substancialmente complementar duma porção de diagnóstico de uma primeira sequência de ácido nu-cleico iniciador de diagnóstico que tem um nucleótido terminal complementar do referido nucleótido variante suspeito e um segundo iniciador de diagnóstico que tem uma sequência substancialmente complementar de uma porção de diagnóstico de uma segunda sequência de ácido nucleico# tendo o segundo iniciador de diagnóstico um nucleótido terminal complementar para o nucleótido variante suspeito complementar; ou (b) um primeiro iniciador de diagnóstico que tem uma sequência substancialmente complementar de uma porção de diagnóstico de uma primeira sequência de ácido nucleico# tendo o primeiro iniciador de diagnóstico um nucleico terminal complementar do nucleótido normal o qual corresponde ao referido nucleótido variante suspeito e um segundo iniciador de diagnóstico que tem uma sequência substancialmente complementar de uma porção de diagnóstico de uma segunda sequência de ácido nucleico# téndo o segundo iniciador de diagnóstico um nucleótido terminal complementar para o nucleótido normal que corresponde ao referido nucleótido variante suspeito; estando o referido nucleótido terminal do primeiro iniciador de diagnóstico e o referido nucleótido terminal do segundo iniciador de diagnóstico situados quer ambos na extremidade 51 ou ambos na extremidade 3' dos respectivos iniciadores e estando a primeira sequência de ácido nucleico no sentido oposto à segunda sequência de ácido nucleico. 9 1

Nesta forma de concretização contudo, o segundo iniciador de diagnóstico pode ser considerado ser um iniciador de amplificação como referido acima e a seguir.

Esta segunda forma de concretização torna possível o aumento da descriminação e da especificação uma vez que qualquer produto que interfira produzido requer um iniciador para ocorrer numa extremidade relevante (geralmente a extremidade 3'-terminal) de dois oligonucleó- tidos desemparelhados em vez de numa extremidade simples como é o caso onde apenas se usa um único iniciador de diagnóstico. A detecção da presença ou da ausência de um nucleótido variante suspeito pode ser efectuada por exemplo conforme descrito a seguir.

Numa terceira forma de concretização da presente invenção, submete-se a amplificação uma amostra que compreende ADN que contém um nucleótido de variante suspeito, por exemplo por amplificação linear conforme definido na presente memória descritiva ou, por exemplo, como descrito nas Patentes US NSs 4 683 195 e 4 6 83 20 2, na Publicação de Patente PCT W087/06270, em Biotechnology Vol. 6, Outubro de 1988 ou na Publicação de Patente PCT W088/10315, e trata-se o produto da amplificação com um iniciador de diagnóstico para uma porção de diagnóstico de uma sequência de base alvo sob condições de hibridação, na presença de trifosfatos de nucleósidos adequados, e de um agente para polimerização de trifosfatos de nucleósidos sendo a sequência de nucleótidos do referido iniciador de diagnóstico tal que e substancialmente complementar da referida porção de diagnóstico, sendo o nucleótido terminal do iniciador de diagnóstico quer complementar do nucleótido de variante suspeito ou do nucleótido normal correspondente.

Assim nesta terceira forma de concretização da presente invenção pode ser realizada uma amplifica- - 10 -

ção no numero de ciclos desejado e a hibridação pode ser tentada com o iniciador de diagnóstico na fase seguinte antes da fase de detecção. Não é necessário utilizar qualquer iniciador de amplificação.

Esta terceira forma de concretização é de interesse uma vez que a quantidade de agente(s) requerida para a polimerização pode ser substancialmente reduzida (por exemplo pelo menos reduzida a metade) bem como a quantidade de trifosfatos de nucleósidos usada e o número de máquinas de aquecimento da Reacção de Cadeia de Polimerase (RCP). Esta terceira forma de concretização possibilita assim que se atinjam economias substanciais. Para além disso, uma vez que a fase de amplificação pode ser efectuada numa gama conveniente de temperatura sem desvantagem/ esta terceira concretização requer apenas que seja efectuadas em primeiro lugar a bibridação mais sensível à temperatura com a sonda de diagnóstico/ reduzindo assim ainda mais o risco de iniciaçao falsa de um iniciador de diagnóstico desemparelhado termfnal (geralmente desemparelhado 3'). Esta terceira forma de concretização proporciona assim um método potencialmente mais seguro e robusto para os não especialistas usarem e que é mais benevolente para com os erros do operador. Esta terceira concretização para além disso obvia o interesse por uma fase extra de controle da reacção de cadeia de polimerase uma vez que a amplificação inicial proporciona o seu próprio controle interno.

Se se pretender# o iniciador de diagnóstico pode conter um sinal ou uma marca que não estará em risco de destruição, por exemplo numa técnica de reciclagem de alta temperatura tal como RCP. Por exemplo a marcação pode ser efectuada usando uma fracção de marcação ou de sinalização adequada tal como fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano-bastardo, conforme descrito.

Neste aspecto, a aplicação de enzimas termoestáveis para marcação, como a fosfatase derivada de 11 1 τ

Thermus aquaticus, pode ser de interesse.

Uma quarta e preferida forma de concretização da presente i nvenção é constituída por uma modificação da terceira forma de concretização da presente inven ção por introdução da caracterização de usar dois iniciadores de diagnóstico como descrito na segunda forma de concretização da presente invenção, servindo potencialmente o segundo iniciador de diagnóstico como um iniciador de amplificação.

Assim na quarta forma de concretização da presente invenção uma amostra compreendendo ADN que contém um nucleótido variante suspeito é submetido à amplificação e o produto amplificado é tratado em conjunto ou sequencialmente, como quert- a) um primeiro iniciador de diagnóstico que tem uma sequência substancialmente complementar de uma porção de diagnóstico de uma primeira sequência de ácidos nucleicos, tendo o primeiro iniciador de diagnóstico um nucleótido terminal complementar do referido nucleótido variante suspeito, e um segundo iniciador de diagnóstico que tem uma sequência substancialmente complementar de uma porção de diagnóstico de uma segunda sequência de ácidos nucleicos, tendo o segundo iniciador de diagnósticos um nucleico terminal complementar do nucleiótido que é complementar do referido nucleótido variante suspeito, ou (b) um primeiro iniciador de diagnóstico que tem uma sequência substancialmente complementar de uma porção de diagnóstico de uma primeira sequência de ácidos nucleicos, tendo o primeiro iniciador de diagnóstico um nucleótido terminal complementar do nucleótido normal que corresponde ao referido nucleótido variante suspeito, e um segundo iniciador de diagnóstico que tem uma sequência substancialrnente complementar da 12

porção de diagnóstico de urna segunda sequência de ácidos nucleicos, tendo o segundo iniciador de diagnóstico um nucleótido terminal complementar do nu-cleótido que e complementar do referido nucleótido normal que corresponde ao referido nucleótido variante suspeito; estando situados o referido nucleótido terminal do primeiro estando o iniciador de diagnóstico e o referido nucleótido terminal do segundo iniciador de diagnóstico ambos na extremidade 51 ou ambos na extremidade 3' dos respectivos iniciadores e sendo a primeira sequência de ácidos nucleicos complementar da segunda sequência de ácidos nucleicos.

Em geral o referido nucleótido terminal do primeiro iniciador de diagnóstico e o referido nucleótido terminal do segundo iniciador de diagnóstico esteio ambos situados na extremidade 3' dos seus respectivos iniciadores. A quarta forma de concretização da presente invenção combina assim as vantagens potenciais da segunda e da terceira formas de concretização da presente invenção acima definidas, sendo estas entre outras uma especificidade potencialmente aumentada, um custo reduzido e uma técnica facil mais robusta. A detecção da presença ou da ausência de um nucleótido variante suspeito pode ser efectuada por exemplo como descrito a seguir.

Deverá notar-se que um produto amplificado uma vez tratado com (a) ou com (b) como definido atrás pode ser submetido a um ou a vários ciclos finais como desejado. Quando se efectuam múltiplos ciclos obtem-se então um outro produto, sendo este um híbrido dos produtos de extensão dos iniciadores de diagnóstico. Os vários produtos formam-se 13

proporções que dependem das proporções relativas dos oli-gonucleótidos de iniciador de RGP original (reacção de cadeia de polimerase) e dos oligonucleótidos de iniciador adicionado.

Quando se efectua amplificação usando iniciadores de diagnóstico ou de amplificação ou usando dois iniciadores de diagnóstico por exemplo conforme descrito na primeira e na segunda forma de concretização da presente invenção ou como parte do procedimento de amplificação descrito na Publicação de Patente Europeia Ns 237 362, as fases de (a) desnaturar a fim de separar produtos de extensão de iniciadores do respectivo molde e (b) fazer contactar cadeias simples obtidas deste modo, quer em conjunto quer sequencialmente:, com trifosfatos de nucleósidos adequados, um agente para a polimeri.zação dos trifosfatos de nucleósidos e os iniciadores relevantes para a síntese de outros produtos de extensão? são de preferência repetidas pelo menos cinco vezes (ciclos) até um numero de vezes indefinido, especialmente quando o iniciadoré refractario à amplificação, sem detrimento da presente invenção. De modo especialmente preferido utilizam--se 15 a 60, por exemplo 15 a 30, vezes (ciclos) se a amostra contém ADN genómieo humano. Se a amostra contém células, de preferência estas são aquecidas antes da fase (a) a fim de expor os respectivos ácidos nucleicos aos reagentes. Esta fase evita a purificação dos ácidos nucleicos antes da adição do reagente. Neste aspecto, deverá notar-se que a presente invenção representa um aperfeiçoamento substancial sobre os processos anteriores mesmo se se leva a efeito a purificação do ADN da amostra antes da tentativa de amplificação.

Deverá notar-se que na fase (b) o contacto entre as cadeias simples produzidas na fase (a) e os trifosfatos de nucleósidos apropriados, um agente para a polime-rização dos trifosfatos de nucleósidos,o($) iniciador(es), por exemplo(s) iniciador(es) de diagnóstico e/ou o(s) iniciador (es) de amplificação poda ser levado a efeito por adição destes materiais à mistura de reacção seguida de separação 14 -

do produto de extensão dos iniciadores a partir dos seus moldes (fase a) ou pode-se recorrer aos materiais já presentes na mistura reaccional. Na realidade é possível adicionar em qualguer estágio do processo da presente invenção um ou vários trifosfatos de nucleósidos diferentes e/ou o agente para a polimerização e/ou o(s) iniciador (es), por exemplo o(s) iniciador(es) de diagnóstico e/ou o iniciador de amplificação.

De acordo com uma quinta forma de concretização da presente invenção que se considera preferida proporcbna-se um método conforme definido anteriormente na presente memória descritiva no qual a amplificação é efectua-da por uma extensão por iniciador baseada na util ização de uma cadeia simples de um ácido nucleico amostra como molde.

Deste modo, nesta forma de concretização, efectua-se a extensão por iniciador com base na utilização da mesma cadeia de ácido nucleico amostra como molde, não estando presente qualquer iniciador de amplificação.

Deste modo a amplificação é aritmética em vez de ser exponencial, enquanto que se consegue uma amplificação exponencial, pelo menos em teoria, com as reacçães de cadeia de polimerase (RCP). A vantagem desta quinta forma de concretização da presente invenção (também referida na presente memória descritiva como de amplificação linear) reside em que os produtos não naturais, se produzidos, não podem e les mesmos ser ob-jecto de amplificação exponencial. A amplificação linear pode ser levada a efeito por qualquer meio conveniente e portanto pode ser levada a efeito utilizando trifosfato de nucleóeidos complementares na presença de um agente de polimerização dos trifosfatos de nucleósidos a fim de produzir produtos de extensão por iniciador de comprimento indeterminado quando existe um grau de complementaridade suficiente entre o iniciador de diagnóstico e o ácido nucleico da amostra. De preferência quando se pretende utilizar todos os trifosfatos de nucleósi- 15 -

i dos complementares submetendo-se o ácido nucleico da amostra a digestSo por endonuclease, sendo as endunucleases de restrição seleccionadas de modo a assegurar que a cisão do ácido nucleico da amostra se efectua no local adequado a fim de permitir a formação de produtos de extensão por iniciador de comprimento fixo. De modo vantajoso, no entanto, é possível efectuar a amplificação linear na presença de apenas 1, de modo vantajoso apenas 2 ou de preferência apenas 3, trifosfatos de nucleósidos de tal modo que o iniciador de diagnóstico no seu estado ligado (isto ó, hibridado com o ácido nucleico da amostra) apenas pode sofrer extensão na medida em que a presença de apenas 1, 2 ou 3 trifosfatos de nucleósidos o permita. Uma vez que esteja presente um trifosfato de nucleósido no ácido nucleico da amostra para o qual não esteja presente qualquer trifosfato de nucleósido complementar, então a extensão por iniciador cessará.

Se assim se pretender, a amplificação linear pode ser levada a efeito à atmosfera de fusão (Tf) da sequência. A esta temperatura o iniciador de diagnóstico hibridado com a sequência complementar no ácido nucleico da amostra encontra-se em equilíbrio como o iniciador de diagnóstico livre na solução e deste modo o iniciador de diagnóstico (opcionalmente sob a forma ampliada) está sendo rapidamente hibridado com o ácido nucleico da amostra e desnaturado a partir deste. Se assim se pretender, a amplificação linear pode também ser levada a efeito por oscilação térmica. Esta técnica de oscilação térmica envolve geralmente uma flutuação rápida de temperatura na vizinhança da temperatura de fusão da sequência.

Se apenas estão presentes 1, 2 ou 3 trifosfatos de nucleósidos, então o iniciador de diagnóstico apenas sofrerá entensão na medida em que a presença destes trifosfatos de nucleósidos o permite. Conforme indicado acima, guando existe um desemparelhamento entre por exemplo a extremidade 3’ terminal do iniciador de diagnóstico e o trifosfato 16 -

de nucleósido correspondente no ácido nucleico da amostra não se efectuará qualquer extensão por iniciador. Quando, no entanto, o trifosfato de nucleósido 3' terminal é complementar do trifosfato de nucleósido correspondente no ácido nucleico da amostra, tem lugar extensSes por iniciador.

Quando se usam apenas 1, 2 ou 3 trifos-fatos de nucleósidos e na utilização o trifosfato de nucleósido terminal do iniciador de diagnóstico que sofreu extensão é empregue apenas uma vez, então pode ser vantajoso usar para trifosfato de nucleósido um trifosfato de nucleósido didesoxi que constitui o trifosfato de nucleósido terminal do produto de extensão de iniciador de diagnóstico. Esta circunstância auxiliará a produção de uma extensão nitidamente terminada do iniciador de diagnóstico.

Se assim se pretender, um ou vários dos trifosfatos de nucleósidos presentes na mistura de reacção para a finalidade de incorporação no(s) iniciador(es) podem ser etiquetados ou marcados de qualquer modo conveniente.

Dsste modo, por exemplo, um ou vários dos trifosfatos de nucleósidos podem ser etiquetados por fluorescência. Esta eti-quetagem dos trifosfatos de nucleósidos é de interesse particular em relação com a quinta forma de concretização da presente invenção quando se pode detectar a produção de um produto de extensão do iniciador de diagnóstico por detecção do(s) trifosfato (os) de nucleósido (s) etiquetado (s) ou marcado (s) incorporado(s) no produto de extensão. Quando não se forma qualquer produto de èxtensão não tem lugar qualquer incorporação e os trifosfatos de nucleósidos etiquetados ou marcados podem ser por exemplo eliminados por lavagem. De um modo mais especial, a quinta forma de concretização da presente invenção evita o problema da amplificação dos produtos não naturais e deste modo permite conseguir uma boa discriminação na presença do(s) trifosfato(s) de nucleósido (s) etiquetado(s) ou marcado(s). Quando a amplificação e levada a efeito por exemplo usando RCP qualquer produção - 17 - % &Λ1 de um produto não natural pode ter como resultado a amplificação deste produto e a consequente incorporação do tri-fosfato de nucleósido etiquetado ou marcado reduzindo deste modo a discriminação.

Para além do exposto, pode ser desejável que o iniciador de diagnóstico contenha um membro de um par de ligação imunológica, por exemplo um antigene ou um anticorpo, ou um membro de um par de formação de um complexo por exemplo biotina, para a ligação ao outro membro do referido par de ligação ou par de formação com a finalidade de captura numa fase sólida.

Dq acordo com um outro aspecto da presente invenção proporciona-se um conjunto de análise ("kit") para a detecção de presença ou da ausência de pelo menos um nucleótido variante num ou em vários ácidos nucleicos contidos na amostra, conjunto este que compreende: (1) um iniciador de diagnóstico para cada porção de diagnóstico de uma sequência de bases alvo, sendo a sequência nucleótidica de cada iniciador de diagnóstico tal que é substancialmente complementar da referi ca porção de diagnóstico, sendo um nucleótido terminal do iniciador de diagnóstico complementar do nucleótido variante suspeito ou do nucleótido normal correspondente de tal modo que na utilização se sintetiza um produto de extensão do iniciador de diagnóstico quando o referido nucleótido terminal do iniciador de diagnóstico é complementar do nucleótido correspondente na sequência de bases alvo, não sendo sintetizado qualquer produto de extensão quando o referido nucleótido terminal do iniciador de diagnóstico não é complementar do nucleótido correspondente na sequência de bases alvo; 18 - (2)

todos os quatro difeimtes trifosfatos de nucleósi-dos? e (3) um agente para a polimerização dos trifosfatos de nucleósidos em (2).

De modo vantajoso o conjunto de análise da presente invenção compreende adicionalmente um iniciador de amplificação correspondente a cada iniciador de diagnóstico/ sendo a sequência de nucleótidos do iniciador de amplificação tal que qualquer produto de extensão do iniciador de diagnóstico correspondente pode, após separação do seu complemento, servir de molde para a sintese de um produto de extensão do iniciador de amplificação. P0r exemplo o conjunto de análise da presenteinvenção compreende qualquer ou ambos dos conjuntos de iniciadores de diagnóstico descritos anteriormente em relação com a segunda forma de concretização da presente invenção conforme definido anteriormente. 0 conjunto de análise da presente invenção pode incluir também, se se pretender, os iniciadores de controle internos, quando apropriados. É especialmente preferido, no entanto, que o conjunto de análise da presente invenção contenha iniciadores de RCP (reacção de cadeia de polimerase) e um iniciador de diagnóstico (conforme definido seguidamente na presente memória descritiva) com respeito a cada nucleó-tido variante suspeito. Se se pretènder, o conjunto de análise pode adicionalmente conter qualquer ou um ou ambos os conjuntos de iniciadores de diagnósticos descritos em pormenor anteriormente em relação com a segunda Jorma de concretização da presente invenção.

Cada um dos materiais descritos em pormenor em (l), (2) e (3) e/ou o iniciador de amplificação 19 9 r

podem ser de modo conveniente embalados num recipiente separado# mas de preferência são todos combinados num único recipiente ao qual se adiciona o material a ser analisado. De modo vantajoso# o único recipiente contem adicionalmente um tampão.

I

Deverá notar-se que quando o conjunto de análise da presente invenção contém os dois conjuntos de iniciadores de diagnostico(a) e (b) descritos anteriormen-te em relação com a segunda forma de concretização da presente invenção# os dois conjuntos de iniciadores de diagnóstico não estarão presentes em conjunto num único recipiente# embora cada conjunto de iniciadores possa estar presente em conjunto com cada um dos materiais descritos em (2) e (3) e/ou com os iniciadores de amplificação em recipientes separados. Quando a amostra a ser analisada deve ser amplificada em primeiro lugar de acordo com a publicação da Patente Europeia N2 237 362# pode ser vantajoso incluir os iniciadores de RCP bem como o(s) iniciador(es) de diagnóstico num único recipiente em conjunto com os materiais (2) e (3) anteriores. Se se pretender, no entanto# o(s) iniciador (s) podem estar presentes num recipiente separado para utilização posterior depois de se ter efectuado a amplificação. 0 termo "tri fosfato de nucleósido" é usado na presente memória descritiva a fim de referir nucleósidos presentes tanto no ADN como no ARN e deste modo inclui nucleósidos que contém como bases adenina, citosina# guanina. timina e uracilo# sendo a fracção de açúcar constitui da por desoxirribose ou por ribose. Em geral os desoxirri-bonucleósidos serão utilizados em combinação com uma polime-rase de ADN. Deverá notar-se no entanto que podem ser utilizados outras bases modificadas capazes de emparelhamento de bases com uma das bases habituais adenina# citosina. guanina, timina ou uracilo. Estas bases modificadas incluem por exemplo 8-azaguanina e hipoxantina. 20 r τ %

0 termo "nucleôtido" é usado na presente memória descritiva a fim de referir nucleótidos i presentes no tanto no ADN como no ARN e deste modo inclui nucleótidos que contém como base adenina, eitos ina, guanina. timina e uracilO/ sendo a fraeção de açúcar constituída por desoxirribose ou por ribose. Devera notar-se no entanto que podem ser utilizados outras bases modificadas capazes de empar elhamento de bases com uma das bases habituais adenina, citosina, guanina. timina ou uracilo. Estas bases modificadas incluem por exemplo 8-azaguanina e hipoxantina.

Devera notar-<3a que guando o processo da presente invenção se destina a ser usado para a detec-ção da presença ou da ausência de um nucleótido variante suspeito o qual é adjacente à porção da sequência de bases alvo que não contém todos os quatro nucleótidos diferentes, então pode ser formado um produto de extensão do iniciador de diagnóstico e, se se pretender, um produto de extensão do iniciador de amplificação na presença de apenas os tri-fosfatos de nucleôsidos correspondentes apropriados e não serão necessários todos os quatro trifosfatos de nucleôsidos diferentes.

I 0 agente para a polimerização dos trifosfatos de nucleôsidos pode ser qualquer composto ou sistema que funcione para realizar a siíntese dos produtos de extensão por iniciador, incluindo enzimas. As enzimas adequadas para este fim incluem, por exemplo, polimerase I de ADN de E. coli, fragmentos de Klenow de polimerase I de ADN de E. coli, polimerase de ADN T4, outras polimerases de ADN obteníveis, transcriptase reversa e outras enzimas, incluindo enzimas termoestáveis. 0 termo "enzima termoestável" conforme usado na presente memória descritiva refere-se a uma enzima que é estável ao aquecimento e que é resistente ao calor e que catalisa (facilita) a combinação dos nucleótidos de modo adequado a fim de formar os produtos de extensão por iniciador que são complementares de cada cadeia de 21

ácidos nucleicos. Geralmente, a síntese é iniciada na ex-trimidade 3' de cada iniciador e continua na direcção de 5' ao longo da cadeia molde até a síntese terminar, produzindo moléculas de diferentes comprimentos. Podem existir enzimas, por exemplo enzimas termoestáveis, no entanto, que iniciam a sintese na extremidade 5' continuando na direcção oposta segundo um processo análogo ao descrito anteriormente. Uma enzima termoestável preferida que pode ser usada no processo da presente invenção é uma enzima que pode ser extraída e purificada a partir de l"hermus aquaticus. Esta enzima tem um peso molecular de cerca de 86 000 a 90 000 Daltons, conforme descrito na publicação de Patente Europeia Nõ 237 362 (ver também puMicação de Patente Europeia N2 258 017). A estirpe Thermus aquaticus ΪΤ1 pode ser obtida sem qualquer restrição a partir de American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryiand, EUA, sob o número ATCC 25 104. A expressão "porção de diagnóstico" conforme usado na presente memória descritiva significa a porção da sequência de bases alvo (conforme definido anterior-mente) que contém para nucleótido terminal o nucleótido variante potencial, cuja presença ou ausência se pretende detectar. Geralmente o nucleótido variante potencial e stá na extremidade 5'-terminal da porção de diagnóstico uma vez que em geral a síntese dos produtos de extensão por iniciador se iniciará na extremidade 31 de cada iniciador, conforme descrito anteriormente. Quando, no entanto, se pretende usar um agente para a polimerização que inicia a sintese na extremidade 5· do iniciador do diagnóstico e continua na direcção 3' ao longo da cadeia molde até que a síntese termina, a "porção de diagnóstico" contém o nucleótido variante potencial na sua extremidade 3*. Os iniciadores de diagnóstico são também projectados de modo adequado para este efeito, conforme se descreve seguidamente. 22 -

A expressão "sequência de bases alvo" conforme usado na presente memória descritiva significa uma sequência nucleótidica que compreende pelo menos uma porção de diagnóstico (conforme anteriormente definido). Deste modo por exemplo num teste simples para p-talassemias a sequência alvo podá conter até 60 porções de diagnóstico# por exemplo 50# contendo cada porção de diagnóstico um único nucleótido variante potencial. 0 termo "oligonucleótido" conforme usado na presente memória descritiva é definido como uma molécula constituida por dois ou mais desoxirribunucleótidos ou ribonucleótidos# de preferência mais de três# A sua dimensão exacta depende de muitos factores# como sejam a temperatura reaccional# a concentração salina# a presença de formamida e a presença de outra mutação (ou de outras mutações) estreitamente relacionadas, como por exemplo na doença de células falciformes Hb c# a qual por seu turno depende da função final ou do uso do oligonucleótido. Realmente# a sequência exacta do oligonucleótido pode também depender de vários factores conforme descrito anteriormente. 0 oligonucleótido pode ser derivado sinteticamente ou por clonagem. 0 termo "iniciador" conforme usada na presente memóriia descritiva refere-se a um oligonucleótido seja de ocorrência natural# proveniente de uma digestão de restrição purificada ou produzido sinteticamente, e que possui a capacidade de actuar como um ponto de inicio da sintese quando colocado sob condições nas quais é induzida a sintese de um produto de extensão por iniciador que é complementar da cadeia de ácido nucleico# isto é# na presença de trifosfatos de nucleósidos e de um agente para a polimeri-zação# como seja polimerase de ADN# num também apropriado ("tampão" inclui pH# força iónica# cofactores# etc.) e a uma temperatura apropriada. 23 0 iniciador é de preferencia de cadeia simples para uma eficiência máxima na amplificação, mas em alternativa ser de cadeia dupla. Se for de cadeia dupla, o iniciador é em primeiro lugar tratado a fim de separar as suas cadeias antes de ser usado para preparar produtos de extensão. De preferência o iniciador e um oligo-desoxirribonucleótido. 0 iniciador deve ser suficientemente comprido para iniciar a sintese de produtos de extensão na presença do agente de polimerização. Os comprimentos exactos dos iniciadores dependem de muitos factores, incluindo a temperatura e a origem do iniciador e a utilização do método. Por exemplo, dependândo da complexidade da sequência alvo, os iniciadores de diagnósticos e de amplificação contém tipicamente 12 a 35 nucleótidos, por exemplo 15 a 35 nucleótidos, se bem que possam conter mais ou menos nucleótidos. As moléculas de iniciadores curtos geralmente necessitam de temperaturas mais baixas a fim de formar complexos inibidores suficientemente estáveis com o molde. 0 termo "complementar" é usado na presente memória descritiva para significar um nucleótido que se pode emparelhar base a base com outro nucleótido específico. Deste modo o trifosfato de adenosina é complementar do trifosfato de uridina ou do trifosfato de timina e o trifosfato de guanosina é complementar do trifosfato de citi-dina. Deve notar-se que embora o trifosfato de timidina e o trifosfato de guanosina se possam emparelhar em certas circunstâncias não são considerados complementares para finalidade da presente memória descritiva. 0 mesmo suplica-se ao trifosfato de citosina e ao trifosfato de uracilo.

Os iniciadores para a presente invenção sao seleccionados de modo a serem "substancialmente" complementares das diferentes cadeias de cada sequência específica a ser amplificada. Isto significa que os iniciadores devem ser suficientemente complementares a fim de que hibri-dem com as respectivas cadeias. For conseguinte, a sequência 24 i Vi.to iniciadores não necessita de reflectir a sequência exacta do molde. Por exemplo quando o iniciador de diagnóstico compreende uma sequência nucleótidica na qual o nucleótido 3·-terminal é completamentar tanto do nucleótido variante suspeito como do nucleótido normal correspondente é possível ligar-se um fragmento nucleótidico não complementar à extremidade 5' do iniciador, sendo a parte restante da sequência do iniciador complementar da porção de diagnóstico da sequência de bases alvo. Ê comum, no entanto, que os iniciadores tenham uma complementaridade exacta excepto na medida em que estejam presentes nucleótidos não complementares numa extremidade terminal pré-determinado do iniciador conforme descrito anteriormente.

Devera notar-se, no entanto, que em certas circunstâncias podem ser induzida a ocorrência de sínteses de um produto de extensão do iniciador de diagnóstico mesmo na presença de um resíduo 3'-terminal não complementar. Este resultado de interferências pode resultar da utilização de uma temperatura demasiado baixa, em cujo caso a temperatura pode ser aumentada, de um tempo de incu-bação/têmpera demasiado longo, em cujo caso o tempo pode ser reduzido, de uma concentração salina demasiado alta. em cujo caso é possível reduzir a concentração salina, de um pH incorrecto ou de um comprimento incorrecto do olu-gonucleótido. Todos estes factores estão discutidos na Publicação de Patente Europeia Ns 237 362. Oma origem importante de produtos de interferência é provavelmente provocada por se deixar a temperatura descer demasiado, permitindo deste modo condições demaèiadamente pouco críticas, por exemplo remoção da mistura de reacção do dispositivo de ciclagem de aquecimento, mesmo por pouco tempo por exemplo para adicionar o agente para a polimerização (por exemplo, polimerase Taq) especialmente no primeiro ciclo de reacção. Para além do referido verificamos que estes resultados de interferências podem também ser originados pela utilização de um iniciador de diagnóstico que seja particularmente rico 25

em resíduos de G' (Guanosina) e de C (citidina). Um iniciador de diagnóstico pode dar origem a dificuldades neste aspecto se é rico em G/G no seu conjunto ou particularmente se é rico em G/C na sua extremidade relevante# normalmente 31. Para alem disso, a natureza precisa do emparelhamento de bases na região da extremidade relevante, normalmente 3', do iniciador de diagnóstico guando este e utilizado pode ser a causa de um resultado de interferência. Deste modo a presença de As (adenosina) no emparelhamento de bases na região da extremidade relevante, normalmente 31, do iniciador de diagnóstico tende a melhorar a especificidade enquanto que a presença de Gs (guanosina) não tem este efeito.

Para além disso, a natureza precisa do desemparelhamento na extremidade relevante, normalmente 3', do iniciador de diagnóstico pode ser um factor importante na obtenção ou não de um resultado de interferência. Assim, por exemplo um desemparelhamento AA ou CT não tem hibjfcualmente como resultado um hibridação, mas um desemparelhamento GT ou AC pode ter como resultado um grau suficiente de hibridação que provoque a formação de um produto ou de produtos que causam interferências. Os resultados de interferências podem ser evitados por introdução deliberada de um ou de vários resíduos desemparelhados ou, se pretendido, de supressões ou de inserções, no interior do iniciador de diagnóstico a fim de desestabili zar o iniciador reduzindo ainda mais a duração de ligação da hibridação.

Deste modo, por exemplo é possível alterar qualquer nucleótido adjacente do desemparelhamento terminal ou mais dos 10 nucleótidos adjacentes, por exemplo 6, a fim de introduzir um maior desemparelhamento. Em geral pode ser necessário apenas um desemparelhamento para além do desemparelhamento terminal, posicionado por exemplo a 1. 2 ou 3 bases do desemparelhamento terminal. Deste modo, por exemplo, em relação com a determinação da presença de um homozigoto normal, heterozigoto ou homozigoto efectado com respeito ao alelo 2 do gene de antitripsina ctl, verificámos - 26 -

que é possível obter bons resultados se o terceiro nucleó-tido a partir do nucleótido terminal 3' é alterado a fim de gerar um desemparelhamento na utilização. Assim, por exemplo, verificámos que a presença de uma C em vez de uma A para terceiro nucleótido da extremidade 3'-terminal do iniciador de diagnóstico possibilita a fácil distinção de homozigotos normais, heterozigotos e homozigofeos efectados cou respeito ao alelo Z. é deste modo possível determinar a melhor disposição do iniciador de diagnóstico por experimentação directa baseada nos critérios anteriores, estando esta experimentação no âmbito da capacidade normal de um especialista em biologia molecular. 0 termo "iniciador de diagnóstico" é usado na presente memória descritiva para designar o iniciador gue tem uma sequência de diagnóstico tal que um seu nucleótido terminal é seleccionado para ser quer complementar do nucleótido variante suspeito quer do nucleótido normal correspondente de tal modo que é sintetizado um produto de extensão do iniciador de diagnóstico quando o nucleótido terminal do iniciador de diagnóstico é complementar do nucleótido terminal adequado da correspondente porção de diagnóstico da sequência de base alvo, mas tal produto de extensão não é sintetizado quando o nucueótido terminal do iniciador de diagnóstico não é homólogo do nucleótido terminal adequado da porção de diagnóstico correspondente da sequência de base alvo. 0 termo "iniciador de amplificação" é usado na presente memória descritiva para designar um iniciador que é capaz de hiferidar com a cadeia de ácido nucleico que é complementar de cadeia de ácido nucleico com e qual o iniciador de diagnóstico é capaz de hi-bridar, tendo o "iniciador de amplificação" uma sequência de diagnóstico de tal modo gue é capaz de hibridar com um produto de extensão de iniciador de diagnóstico, depois da separação do seu complemento, servindo o produto de extensão do 27 - iniciador do diagnóstico de molde para a síntese de um produto de extensão de um iniciador de amplificação/ facilitando assim a amplificação. A presente invenção é dirigida, deste modo, pelo menos em parte, para o melhoramento de processos de amplificação, tal como o processo descrito na Publicação de Patente Europeia N2 237 362 no qual o melhoramento torna possível amplificar selectivamente quer uma sequência que contém um nucleótido variante suspeito se presente quer uma seguência que contém o nucleótido normal correspondente se presente, simplificando assim a detecção enquanto torna dispensável a sequência, os oligonucleótidos específicos para determinados alelos e a digestão de restrição. Assim, para uma dada variação de nucleótidos, por exemplo mutação pontual, a sua presença ou ausência pode ser detectada quer 1) projec-tando o iniciador de diagnóstico para ter um nucleótido terminal adequado que e complementar da variação do nucleótido suspeito de tal modo que a síntese de um produto amplificado será o indicativo da presença de variação do nucleótido suspeito e a ausência de um produto amplificado será indicativa da ausência da variação do nucleótido suspeito? ou 2) projec-tando o iniciador de diagnóstico para ter um nucleótido terminal adequado que é complementar do nucleótido normal correspondente de tal modo que a síntese de um produto amplificado será indicativo da ausência da variação do nucleótido suspeito e a ausência de um produto amplificado será nudicativo da presença da variação do nucleótido suspeito. Em relação com este aspecto, as .referências na presente memória descritiva a "nucleótido terminal apropriado" significam o nucleótido terminal do iniciador a partir do qual a sintese em utilização será iniciada se possível. Deste modo, uma vez que em geral o agente para a poiimerização iniciará a sintese na extremidade 3' do iniciador, o nucleótido terminal apropriado será em geral o nucleótido terminal 3'. 28 Ί

A confirmação da presença ou da ausência de por exemplo uma dada mutação pontual pode ser obtida por adopção tanto do procedimento alternativo (1) como do procedimento alternativo (2), conforme descrito anteriormente. Uma combinação dos dois modos alternativos de abordagem proporciona um método para a detecção de heterozigotos que será valiosa para a análise das condições herdadas dominantes e na detecção de veículos de condições herdadas recessivas.

J

I

Numa forma de concretização preferida, a presente invenção é dirigida para a detecção da presença ou da ausência de mais do que um nucleótido variante suspeito na mesma amostra. A possibilidade de se amplificarem selecti-vamente, de acordo com a presente invenção, sequências que dependem da sequência nucleétidica pré-determinada dos iniciadores de diagnóstico possibilita a distinção simples e precisa da produtos de amplificação pré-determinados com um treino mínimo do operador tornando assim possível dispor de uma técnica robusta para escrutinar uma únÊca amostra em relação da múltiplas variações de nucleótidos. A presente invenção é deste modo de especial interesse para escrutinar uma única amostra de ADN ou de ARN com respeito a uma bateria de condições herdades, como sejam desordens genéticas, pré-disposições e mutações somáticas que provocam várias doenças.

Estes ADN e ARN podem por exemplo ser extraídos a partir de sangue ou de material tecidual, como seja de pelos coriónicos ou de células amnióticas por várias técnicas como as descritas por Maniatis et al, Molecular Cloning (1982), 280-281.

Para além disso, à medida que se torna conhecida a base molecular para outras condições herdadas, estas condições podem ser simplesmente incluidas na técnica de análise da presente invenção.

Os produtos de amplificação múltipla podem distinguir-se por meio de várias técnicas. Deste modo, por exemplo, podem ser utilizadas sondas para cada produto amplificado suspeito, contendo c ada amostra um sinal ou um - 29 -

resíduo capaz de dar origem a um sinal diferente e que se possa distinguir.

Estes sinais e resíduos capazes de dar origem a um sinal são discutidos em pormenor na nossa publicação de Patente Europeia N2 246 864, mas podem por exemplo incluir o sistema de amplificação em fase sólida descrito por Wang G G em World Biotech Report 1986 vol. 2, parte 2 páginas 33-37, (Diagnostics Healthcare, actas da conferencia que teve lugar em Novembro de 1986, San Francisco) no qual são conjugadas com a amostra microesferas formadas com muitos elementos vestigiais seleccionados. A presença de amostras específicas pode ser detectada por análise de fluorescência por raios X. Estas técnicas são geralmente de aplicação simples e directa uma vez que apenas será necessário detectar a existência de um produto de amplificação em vez de distinguir entre sequências que difiram apenas num unico nucleótido.

Um método muito mais simples e preferido para a distinção entre produtos de amplificação compreende a selecção das sequências nucleótidicas dos iniciadores de amplificação de tal modo que o comprimento de cada produto de amplificação formado durante o processo da presente invenção é diferente. Neste aspecto, o numero de pares de bases presente num produto de amplificação é ditado pela distância que separa os iniciadores de diagnóstico e de amplificação. Deste modo, os iniciadores de amplificação podem ser projectados de tal modo que cada nucleótido variante potencial se encontra associado com um produto de amplificação potencial de um comprimento diferente. A presença ou a ausência de um dado nucleótido variante potencial pode deste modo ser detectado de modo vantajoso por técnicas electroforéticas, nas quais os diferentes produtos amplificados, obtidos podem ser dis-tribuidos de acordo com os seus pesos moleculares e deste 30

modo identificados por exemplo por técnicas autorradiográ-ficas ou de fluorescência. Os comprimentos dos diferentes produtos podem diferir apenas por um único nucleótido, mas de preferência os comprimentos diferem por pelo menos 3 nucleó-tidos. 0 processo da presente invenção é de preferência efectuado usando um corante intercalado, como seja brometo de etídio, o qual pode ser visualmente vizualizado sob a forma de uma fluorescência alaranjada quando se irradia com raios ultravioletas. Deste modo, a presença ou a ausência de vários nucleótidos numa única amostra pode ser determinada de forma rápida, precisa e fácil. S& se pretender, o iniciador ou os iniciadores de diagnóstico e/ou o iniciador ou os iniciadores de amplificação podem ser marcados ou etiquetados por exemplo usando um fluorofóro- Deste modo, por exemplo, cada iniciador de diagnóstico ou iniciador de amplificação diferente pode conter um fluoróforo diferente de modo gue é possível ler os resultados de uma série de ensaios a partir de um gel de electroforese por exemplo por um leitor de varrimento ("scanner") de laser, possibilitando deste modo que o método da presente invenção seja automatizado. Em alternativa a presença ou a ausência de um produto de amplificação pode ser averiguada facilmente usando um solvente com capacidade de dissolver selectivamente trifosfatos de nu-cleósidos mas que não seja capaz de dissolver urna sequência nucleôtidica (por exemplo um ADN). um exemplo de um solvente adequado para este fim é o ácido tricloroacético (ATC).

Deste modo, por exemplo, a presença ou a ausência de um produto amplificado pode ser d eterminada por precipitação com ATC das misturas reacionais de amplificação. Quando ocorreu a incorporação dos trifosfatos de nucleósidos apropriados numa série de reacções exponencial, encontram-se presentes quantidades substancialmente superiores de material insolúvel em ATC do que quando não ocorre qualquer extensão do iniciador de diagnóstico, á possível levar a efeito por métodos conhecidos uma quantificação de material insolúvel. Deste modo, por exemplo, os trifosfatos de nucleósidos podem ser marcados (por exemplo por uma marca radioactiva ou - 31 -

fluorescente)/ submetendo em seguida a mistura reaccional por exemplo a centrifugação, eliminando o líquido presente por decantação e submetendo o líquido ou o produto insolúvel a técnicas de detecção apropriadas, como sejam contagem radioactiva ou determinação de fluorescência.

De acordo com uma outra característica da presente invenção é proporcionado uma sequência nucleótidi· ca de cerca de 5 a 50 Pb para utilização no método da presente invenção, sendo um nucleótido terminal da referida sequência complementar de um nucleótido variante suspeâto associado com um distúrbio genético conhecido ou do nucleótido normal correspondente, sendo a parte restante da referida sequência substancialmente complementar da sequência de bases alvo correspondente adjacente do nucleótido variante suspeito ou nucleótido normal correspondente, sendo a referida sequência nucleotídica tal que quando usada como iniciador de diagnóstico no método da presente invenção é sintetizado um produto de extensão do iniciador de diagnóstico quando o referido nucleótido terminal do iniciador de diagnóstico é complementar do nucleótido correspondente na sequência de bases alvo, não sendo sintetizado qualquer produto de extensão quando o referido nucleótido terminal do iniciador de diagnóstico não é complementar do nucleótido correspondente n3 sequência de bases alvo.

De modo conveniente o nucleótido terminal gue é complementar do nucleótido variante suspeito ou do nucleótido normal correspondente esta situado na extremidade 3* da sequência nucleotídica. De preferência o nucleótido variante suspeito resulta de uma mutação pontual da sequência normal correspondente. A referida sequência nucleotídica pode por exemplo ter uma extensão de 10 a 50 pb, por exemplo 10 a 36 pb. 32 -

De acordo com quatro outras caracterís-ticas da pressnte invenção são proporcionadas sequências nucleotídicas conforme definidas imediatamente antes e nas quais um nucleótido terminal da sequência nucleótidica é complementar de um nucleótido variante que resulta de uma mudança do nucleótido normal correspondente para (i) A, (ii), G, (iii) C, (iv) T ou U, respectivamente.

De acordo com uma outra caracterí-stica da presente invenção é proporcionado um conjunto de duas sequências nucleotídicas conforme definido acima, sendo um nucleótido terminal de uma sequência complementar de um nucleótido variante suspeito associado terminal da outra sequência complementar do nucleótido normal correspondente.

De acordo ainda com uma outra caracte-rística da presente invenção são proporcionadas sondas que contém uma sequência nucleótidica conforme definido anterior· mente contendo um componente etiquetador ou marcador.

Para exemplo pormenorizam-se os seguintes distúrbios genéticos conhecidos mostrando as mutações responsáveis pelo distúrbio e uma referência da literatura relevantes para cada mutação. As sequências nucleotidi-cas e as sondas conforme anteriormente definidas podem por exemplo ser baseadas nos distúrbios genéticos pormenorizados em seguida, sendo a sequência da sequência nucleótidica relevante ou sonda derivável da referência da literatura relevante especificada no Quadro. 33

Quadro Mutações que A Autossomai Doença Deficiência em anti-trombina III Po1ineuropati a amiloidotica

Mutação Referência CG-^ TG Duchange et al

Nucleic Acids Research 14 : 2408 (1986) CG --) CA Maeda S. et al.,

Mol. Biol. Med, 329-338 (1986) AC .-^ GC Walace M R. et al, J. Clin Invest 78:6-12 (1986) AG-^GG Wallace M R. et al. J. Clin. Invest 78:6-12 (1986) 34 'Μ

Doença

Deficiência em alfa--1-antitripsina

CSM?--^CTG deletion of codon 51 (normal) M Malton,in press. 39 GGC-^TGG Arg - Cys, Sxon II,· I variant, unreported 35 -

Par de bases Mutação Referência

Deficiência em desarninase CG-^ GA Bonthron DT^ et al. # de adenosina J. Clin Invest 76:894-897 (1985) AA_^ AG Valerio D. et al ΞΜΒΟ J 5:113-119 (1986) GT — —} CG II II D ficiência em apolipoprote- CT - O —} GG Cladaras et al ina Ξ J. Biol. Chern 262:2310-2315 (1987) Diabetes mellitus, TG — —^ CG Haneda M. et al. ligeiro Proc. Natl. Acad

Sei. USA 80 ϊ 6366-6370 (1983) TC-^ TG Shoelson S.et al.,

Nature 30 2:540-543 (1983) <PG TT II II Doença de Gaucner CT - CG Tsuji S. et al. tipo 2 w. Engi. iJ. Med 316:570- 575 (1987) 36

Hyperinsulinaemia, familial CG -—^ CA Shibasaki Y. et al., J. Clin. Invest 76:378-380 (1985) CA—GA Chan SJ. et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 84:2194-2197 (1987)

Mutação Cf--^ CG

Doença

Deficiência em imuno-globulina kapa

Referência S t avne z er- Nordgx en J. et al., Science 230:458-461 (1985)

CG-^ TG

Deficiência em recep- Λ tor LDL GG-GA Lehrman MA et al., Cell 41:735-743 (1985)

Osteogenesis imperfecta TG -—Tf (tipo II)

Cohn DH et al., Proc Natl Acad Sei USA 83:6045-6047 (1986)

Fenilacetonúria AG -—^ AA Dilella AG et al Nature 322:799-803 (1986) CG-^ TG Dilella A G et al., Nature 327:333-336 (1987) 37

Doença

Mutação

Referência

Deficiência em CG -^ TG Romeo G. et al proteína C Proc. Natl Acad

Sei USA 84:2829-2832 (1987)

GG

GC

II i

I

Deficiência em fos- TG -^ SA forilase de nucleósi-do de purina

Williams SR.et al.# J. Biol. Cbem. 262:2332-2339 (1987)

Anemia falci-forme GAG^GTG Chang JG. and Kan YW. Lancet 2, 1127-9 (1981); Orlcin SH. et al.# New Eng. J. Med. 307# 32-6 (1982); and Conner BJ et al Proc. Natl. Acad. Sei. USA.# 80, 278-82 (1983).

Doença de Tâger AG-AT Law sw. Brewer HB J. Biol. Chem. 260: 12810-128814 (1985) 38

β-Tal assentia

Classe de mutante ‘Pipoa) mAJRN não funcional mutantes sem s entido (1) codão 17 (A—^ T) O

Referência i

I

(2) codão 39 (C

(3) codão 15 (C A) 0

O (4) codSo 37

(G A)

O

(5) codão 121(G T) 0

Cbang JC et al Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 2886 (1979) Trecartin RF et al J. Clin. Invest. 68: 1012 (1981) and Chehafo. FF et al Lancet is 3 (1986) Kazazian HH et al Eur.M0lec.Biol. org. J. 3: 593 (1984) Boehm. CD et al Blood 67: 1185 (1986) Kazazian HH et al. Am. J. Hum. Genet. 38: A860 (1986)

Mutantes com mudança (6) - 2 codão 8 0 de quadro

Orkin SH et al., J.Biol.Chem.256: 9782 (1981) 39

Classe de mutante

Tipo Referência (7) - 1 codão 16 0 (8) - 1 codão 44 0 (9) - 1 codão 8/9 0

Kazazian HH et al Eur. molec. Biol. org. J. 3: 593 (1984) Kinnifourgh. AT et al Nucleic Acids Res 10í 54 21 (1982) Kazazian HH et al Eur. molec. Biol. org. J. 3: 593 (1984) and Wong C et al Proc. Natl. Aead.Sci. USA 83: 6529 (1986) (10) - 4 codãss 41/42 0

Kazazian, HH et al Eur. molec. Biol. org. 3: 593 (1984) and Kimura. A et. al J. Biol. C^em.258: 2748 (1983). (11) - 1 codão 6 0 Kazazian HH et al

Am. J. Hum. Genet. 35: 10 28 (1983) (12) ·+ 1 codão 71/72 0 Cheng TC et al

Proc. Natl.Acad. Sei. USA 81: 2821 (1984) 40

Classe de mutante

ÊM

Referência (b) Mutantes de processamento de ARN Alterações de junção de cisão (1) IVS 1 posição 1 GT -AT 0

Orkin, SH et al Nature 296: 627 (1982) and Treisman R, et al Nature 30 2: 591 (1983) (2) IVS 1 posição 1 GT-^ TT 0

Kazazian. HH et al Eur. molec. Biol. org. «T. 3: 593 (1984) (3) IVS 2 posição 1 GT-^ AT 0 (4) IVS 1 extremidade 31 0 -17 bp (5) IVS 1 extremidade 3' 0 -25 bp

Orkin, SH et al, Nature 296, 627 (1982) and Treisman, R et al Cell 29: 903 (1982) Bunn HF et al, Haemoglobin: molecular genetic and clinicai aspects, p. 283 (Saunders, Philadejbphia 1986) Kazazian. HH et al., Bur. molec. Biol. org. J.,3: 593 (1984) and Orkin, SH et al.J.Biol. Chen.. 258:7249 (1983). _ Λ 1

Classe de mutante

Tipo

Referência (6) IVS 2 extremi- 0 dade 31

AG -v CG (7) IVS 2 extremidade 3 ' AG -_^ CG 0

Padanilam BJ, et al Am. J. Hematol 22:259 (1986)

Antonarakis SB, et al Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81i 1154 (1984) and Atweh GF et al Nucleic Acids Res. 13: 777 (1985).

Mndancas de consenso (8) IVS 1 posição 5 (G -* C) + (9) IVS 1 posição (G -T) 0 (10) IVS 1 posição 6 + (T -^ C)

Kazazian, HH et al Sur. molec. Biol. org. J. 3: 593 (1984) and Treisman, R et al Nature 30 2: 591 (1983) Wong C et al Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 6529 (1986) and Atweh, GF et al Nucleic Acids Res. 13: 777 (1985). Orkin, SH et al Nature 296: 627 (1982) and Atweh GF et al Am. J. Hum. Genet. 38: 85 (1986) - 42 -

Cl asse de mutante

Tipo

Referência

Mudanças de IVS Interno (11) IVS 1 posição 110 + (G-^ A)

Westaway, D et al Nucleic Acids Res. 9: 1777 (1981) (12) IVS 2 posição 705 + (T-> G)

Dofokin, C et al Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80í 1184 (1983). (13) IVS 2 posição 745 + (C -f G) (14) IVS 2 posição 654 0 (C --^T) (15) IVS 1 posição 116 ? (T-^ G)

Orlcin# SH et al Nature 296: 627 (1982) and Treisman, R et al Nature 30 2: 591 (1983) Cheng TC et al Proc. Natl. Acad. Sei USA 81: 2821 (1984) Feingold EA et al Ann. N. Y. Acad. Sei. 445: 159 (1985)

Substituições de região de codificação (16) codão 26 (G-^ A)

Thein SL et al J. Med. Genet. (in press 1986) and Orkin SH et al Nature 300: 768 (1982) (17) codão 24 (T<_* A)

Goldsmith et al Proc. Natl. Acad. Sei.USA 88: 2318 (1983)

Ciasse de mutante

Tipo

Referência (18) codão 27 (G -} Ί?) T* β , pKnossos Orlem SH et ai

Blood 64ϊ 311 (1984) (c) Mutantes Trans-cricionais

(1) -88 C

T

Wong, C et al Proc. Natl. Acad. Sei. ISA 83ϊ 6529 (1986) Orkin SH et al J. Biol. Chem. 259: 8679 (1984)

(2) -87 C -} G

Orkin SH et al 3%ture 296: 627 (1982) and Treisraan R et al Nature 30 2: 591 (1983)

(3) -31 A

G

Takihara Y et al Blood 67: 547 (1986)

(4) -29 A

Antonarakis SE et al Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:1154 (1984) and Wong C et al Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 6529 (1986)

(5) -28 A

Surrey S et al J. Biol. Chem. 260:65o7 (1985) - 44 - I *

Tipo Referência + Orkin SH et al

Nucleic Acids Res. 11: 4727 (1983) (d) Mutante de Poliadenilação i (1) AATAAA-> AACAAA + Orkin SH et al

Bur. molec. Biol. org. J. 4: 453 (1985) (e) Supressões (1) 3'6(-619bp) 0 Spritz. RA et al

Nucleic Acids Res. 10: 8025 (1982) and Orkin, SH et al Pro. Natl. Acad. Sei. USA 76: 2400 (1979)

I

Classe de mutante (6) -28 A-^ G (2)5'8(-1.35kb) 0 HbP Padanilam. BJ et al

Blood 64: 941 (1984) (3) 6 (-10kb) 0 HbP Gilman, JG et al

Br. J. Haemat. 56: 339 (1984) + = mutante de B-talassemia (β-) o qual causa uma redução na produção da cadeia de β-glubina: o = um mutante (β°) que causa ausência de produção de cadeia de β-globina - 45 -

rase de triosefosfato Proc. Natl. Acad. Sei USA 83 s 7903-7907 (1986)

Deficiência em decarboxilase de uroporfininogese GG——^ GA De Verneuil H. et al.,

Science 234:732-734 (1986) B X-ligado

Doença Gene Mutação Referencia

Haemophilia Pactor CG—^ TG(24) Gitschier J. et al., A VIII Nature 315:427-430 (1985) CG—^ TG(18) Antonarakis SE et al., N. Engl. J. Med. 313: 842-848 (1985) CG —^ CA(26) Gitschier J. et al., Science 232: 1415--1416 (1986) CG ·—^ TG(18) Youssoufian H. et al., Nature 324: 380-382 (1986) CG. ^ TG (22) " " CG —^ TG (22) “ "

Haemophilia B Factor IX CG—^CA Bentley AK et al.,

Cell 45: 343-348 (1986) 46 -

Referência

Doença Gene Mutação GT ·—^ TT Rees DJG et al., %ture 316í 643-645 (1985). GA_^ GG Davis LM et al., Blood 69:140-143 (1987)

Encontram-se exemplos de anulaçães em: porrest S M, Gross G c, Speer A, Gardner-Medwin D, Burn J, e Davies K E (1987) Preferential deletion of exons in Duchenne and Becker muscular dystrophies. Nature 320, 638--640.

Koenig M, Hoffman E P, Bertselson C J, Monaco A P, Feener G e Kunkel L M (1987) Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDMA and preliminary genomic organisa-tion of the DMD gene in normal and affected individuais.

Gell 50# 509-517.

Malhotra S 3, Hert K A, Klamut H J# Thomas N S T, Bodrugs S E/ Burghes A Η M, Bobrow M, Harper P S/ Thompson M W, Ray P N e Worton R G (1988) Frame-shift deletions in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy, Science 242, 755 - 759.

Reaé A P, Mountford R C, Forrest S M, Kenwrick S J, Davies K E e Harris R (1988) Patterns of exon deletions in Duchenne and Becker muscular dystrophy. Hum. Genet. 80, 152rl56.

Chamberlain j s, Gibbs R A, Ranier J E, Nguyen P N e Caskey C T (1988) Deletion screening of the DMD locus via multiplex DNA amplification. Nuc, Ac. Res. 16; 23, 11141-11156. 47

Roberts R G, Cole C G, Hart K A, Bobrow M e Bentley D R < (1989) Rapid carrier and prenatal diagnosis o£ Duabenne and Becker muscular dystrophy, Nuc. Ac. Res. 17? 2/811.

Moitas vezes apenas se encontram disponíveis para análise pequenas quantidades de ADN genómico. Verificou-se que a especificidade dos iniciadores de diagnóstico para sequência de nucleótidos normais ou para variantes relevantes pode ser convenientemente avaliada pelo crescente número de cópias da(s) sequência(s) do nucleótido no ensaio de hibridação. Isto pode ser alcançado, por exemplo, com a construção de uma "cassette" de cadeiia dupla compreendendo uma sequência normal temperada com uma sequência variante, efetando o desemparelhamento entre os dois nucleótidos em cadeia adjacentes de preferência presente a cerca do meio da cassette. As cópias da cassette são então convinientemente obtidas pela sua inserção num plasmideo hospedeiro seguido de repli-cação do plasmideo e isolamento das sequências desejadas, usando em todos os casos técnicas bem conhecidas na ciência. Ssta técnica encontra-se convenientemente ilustrada na Figura 10.

Para que a presente invenção possa ser completamente compreendida e descrita em seguida através de exemplos com referência aos desenhos que os acompanham, nos quais í-

As figuras l(a) e l(b) ilustram a primeira concretização da presente invenção, a figura l(c) ilustra um resultado típico deste teste tal como pode ser apresentado por electroforese?

As figuras 2(a) e 2(b) ilustram a segunda concretização da presente invenção? A figura 3 ilustra o método preferido para distinguir entre os múltiplos produtos de amplificação? 48

As figuras 4 (a) e 4 (b) ilustram a terceira concretização da presente invenção;

As figuras 5(a), 5(b) e (c) ilustram a quarta concretização da presente invenção? A figura 6 (não está à escala) representa o gene de antitripsina al humano? e A figura 7 mostra o resultado da visualização do gel obtido nos exemplos 1 e 2. A figura 8 mostra o resultado da visualidade de um gel, no qual as pistas 1 a 4 representam o resultado do exemplo 3, as pistas 5 a 8 representam uma proporção dos resultados do exemplo 4 e a pista 9 representa um marcador de medida. A figura 9 mostra os resultados da visualização do gel obtido no exemplo 4, » A figura 10 ilustra o uso de um sistema de um plasmídeo em cassette para amplificar um ADN duplex desejado. A figura 11 ilustra a quinta concretização (amplificação Hinear) da presente invenção. A figura 12 mostra os resultados da visualização do gel obtido no exemplo 5. A figura 13 mostra o resultado da visualização do gel obtido no exemplo 6. A figura 1 ilustra o método da primeira • concretização da presente invenção. A figura l(a) mostra ca- • deias de ADN genómico desnaturado contendo um nucleótido nor- 49 - mal (N) na posição na qual, por exemplo como resultado de uma perturbação genética, um nucleótido variante suspeito pode estar presente. Fazendo contactar a estirpe de ácido nucle-co, sob condições de hibridação com urna sonda de diagnóstico possuindo um nucleótido 3' termiaal complementar do nucleoti-do normal (-N) na presença dos trifosfatos de nucleósidos apropriados e de um agente para polimerisação dos trifosfatos de nucleósidos, ocorre como resultado a extensão da cadeia do iniciador de diagnóstico na direcção 3' como se mostra na figura l(b). Nenhuma destas extensões de cadeia ocorre guando se usa um iniciador de diagnóstico no gual o nucleótido 3' terminal é complementar do nucleótido (-M) variante suspeito. Qualquer produto de extensão de cadeia do iniciador de diagnóstico pode então ser desnaturado e um iniciador de ampoificação (A) pode ser hífórididado para o produto desnaturado para dar mais um produto de extensão de cadeia. 0 produto de èxtensão de cadeia pode então ser desnaturado e o processo pode ser repetido para se alcançar a amplificação. A região do ADN genómico sujeita a amplificação com o iniciador de diagnóstico é designado por DG na figura l(b). Os produtos de diagnóstico desta região são responsáveis pelas bandas designadas por DG na figura l(c)· Para padrão podem ser empregues os iniciadores (P) de RCP (reacção de cadeia de polimerase) designados por P na figura l(a) num local separado na cadeia de ácido nucleico ou noutra cadeia de ácido nucleico, por exemplo noutro cromossoma em consideração por exemplo de ADN humano. Este local separado e designado por F-CR na figrra l(c) e os produtos de control PCR deste lado são responsáveis pelas bandas designadas por PCR na figura l(c). Deverá notar-se que as bandas designadas por PCR podem representar produtos quer maiores quer menores do que os produtos representados pela banda designada por DG. À figura l(c) mostra o resultado do método apresentado nas figuras l(a) e l(b), sob a forma de bar das decompostas por electroforese em gel de agarose em relação com, por exemplo, uma perturbação genética causada por - 50 -

uma mutação pontual analisada utilizando o iniciador de diagnóstico -to ou -N conforme for apropriado. Quando o sujeito testado for um veículo (C) da perturbação genética ver-se-âo bandas respeitantes quer às sequências de nucleótido normal (N) quer à sequência de nucleótido variante (K). Os homozi-gotos normais (N) apresentarão uma banda presente com respeito à sequência de nucleótido normal# mas nenhuma banda /"descrita como ( )_7 no que diz respeito a nucleótido va riante e os homozigotos para a mutação que causa a doença (individuos com perturbaçSes genéticas (d) não apresentam qualquer banda /"descrita como ( )_7 presente no que diz respeito à sequência de nucleótido normal e uma banda presente no que diz respeito à sequência de nucleótido variante. A Figura 2 ilustra a segunda concretização da presente invenção. Emprega-se um iniciador de diagnóstico para cada cadeia ou um ácido nucleico de dupla cadeia.

Em (a) os iniciadores de diagnóstico são projectados de tal forma que o nucleótido terminal 3' é complefaentar.do nucleótido normal. 0 método prossegue conforme descrito em relação à Figura 1# mas com dois iniciadores de diagnóstico diferentes que iniciam a amplificação se o nucleótido relevante esta presente. Assim nesta concretização o segundo iniciador de diagnóstico I equivalente ao iniciador de amplificação (A) na Figura 1. Assim# na Figura 2(a) a amplificação inicia-se pelos iniciadores (-N e N-) mas não pelos iniciadores de diagnóstico que tem nucleótidos terminais 31 complementares da sequência de nucleótido variante (-M e M-). 0 inverso é verdadesro na Figura 2(b) uma vez que a sequência variante está presente na cadeia de ácido nucleico da amostra. Os resultados do método apresentado na Figura 2 podem ser representados de um modo semelhante ao apresentado na Figura l(c)* mas as referencias aí incluídas a normal e variante (N e M) correspondem a pares destas sequências. Na Figura 2 a letra P refere-se a iniciadores RCP nsados como controlo. 51 -

A figura 3 apresenta um modo pelo qual é possível distinguir vários produtos de amplificação, permitindo assim gue uma única amostra de ARN ou de ADN seja testada para uma série de condições herdadas. Duas cadeias (desnaturadas) de ADN ou de ARN de uma amostra são apresentadas contendo três locais separados numerados 1, 2 e 3. Uma outra região removida destes locais é usada para amplificação de RCP para servir de controlo. C©m respeito ao local (1) usa-se um iniciador de diagnostico de 20 bases (5'-N 3') juntamente com outro iniciador de diagnóstico de 20 bases (3'N- 5’). Se tem lugar uma amplificação no local (1) será obtido um produto de amplificação de 39 bases. Uma vez gue na Figura o nucleótido 3'-terminal é normal como o nucleótido relevante na amostra aanalisar, ocorre uma amplificação. De modo semelhante, ocorre amplificação se o nucleótido relevante na amostra a analisar é um nucleótido variante e os iniciadores de diagnóstico usados contam também um nucleótido variante 3'-terminal. No entanto não ocorre gualguer amplificação deste tipo quando ocorre um desemparelhamento entre o nucleótido relevante na amostra e o nucleótido 3'-terminal do iniciador de diagnóstico.

No local (2) os iniciadores de diagonóstico são projecta-dos de modo a darem origem a um produto de amplificação de 49 bases se ocorre.amplificação e no local (3) os iniciadores de diagnóstico são projectados de modo a darem origem a um produto de.amplificação de 59 bases se ocorre amplificação. Uma vez que, como se pode verificar a partir do que se descreveu, a dimensão da banda do produto de amplificação é a soma das dimensões dos dois iniciadores de diagnóstico menos um, é possível levar a efeito vários testes numa única amostra num único recipiente de reacção se se projectarem de modo apropriado os iniciadores de diagnóstico individuais de modo a gue seja caracterizada cada local de interesse. A medida gue aumenta a dimensão da soma das dimensões dos iniciadores de diagnóstico, os produtos de am-l^ificação podem ser separados por exemplo em geis de aga-rose. É possível uma melhoria da resolução se os iniciadores 52 -

de diagnóstico forem etiquetadas ou marcados de qualquer modo conveniente e em seguida saturados por exemplo sobre um gel de acrilamida. Na figura 3 a letra P refere-se aos iniciadores de RCP usados para controlo.

J A Figura 4 mostra a terceira forma de concretização da presente invenção segundo a qual é efec-tuada amplificação normal de uma sequência de ácido nuclei-co contendo um nucleótido normal na posição em que pode estar presente um nucleótido variante suspeito, senéo utilizados por exemplo iniciadores habituais de RCP. De modo semelhante ocorre amplificação normal se estiver presente o nucleótido variante suspeito emvez do nucleótido normal. 0 produto de amplificação é feito contactar com um iniciador de diagnóstico conforme descrito anteriormente em relação à terceira forma de concretização da prese nte invenção.

I

Quando o produto amplificado contém uma sequência de ácidos nucleicos que contém um nucleótido normal conforme descrito anteriormente e o iniciador de diagnóstico é utilizado com um nucleótido 3'-terminal normal, forma-se um produto de extensão do iniciador de diagnóstico / usando a sequência nucleótidica produzida por amplificação de RCP normal (referida na presente memória descritiva como produto de controlo de RCP) como molde_7 desde que estejam presentes trifosfatos de nucleósidos apropriados e um agente para a polimerização dos trifosfatos de nucleósidos. Não será necessária qualquer iniciador de amplificação uma vez que o molde para a produção do produto de extensão do iniciador de diagnóstico já terá sido amplificado. A presença ou a ausência do produto de extensão do iniciador de diagnóstico designado por DG na Figura 4(b) bem como a presença do produto de controlo de RCP (designado por RCP na Figura 4(b) podem ser detecta-das, por exemplo por técnicas electroforéticas.

Deve notar-se que um produto deexten-são de um iniciador de diagnóstico será também formado quando o produto dS controle de RCP contém um nucleótido variante 53 1 '

e o iniciador de diagnóstico utilizado possui um nucleótido variante complementar 3·-terminal.

As bandas dos produtos resultantes podem ser visualizadas por exemplo conforme apresentado na Figura 4(b). Os símbolos N-, M-, C-, N, D, DG e PCR possuem os significadós.definidos em relação com a Figura 1 (c).

No entanto a banda do produto de extensão do iniciador de diagnóstico tem um peso molecular mais baixo que a banda de controlo de RCP (designada por PCR, conforme se apresenta na Figura 4b). Neste caso a banda de controlo representa um verdadeiro padrão interno uma vez que um dos iniciadores de RCP serve de iniciador de amplificação do produto de extensão do iniciador de diagnóstico. Quando o produto de controlo de RCP contem um nucleótido variante e o iniciador de diagnóstico possui um nucleótido normal 3‘-terminal e vice-versa nSo se formará qualquer produto de extensão.

Se se pretender, a terceira forma de concretização da presente invenção pode ser levada a efeito fazendo contactar a amostra a analisar no início da análise apenas com iniciadores de RCP mas também com o iniciador de diagnóstico. Deste modo não é necessário atrasar a utilização do iniciador de diagnóstico até se ter atingido um grau pretendido de amplificação do produto de controlo de RCP. De facto, o iniciador de diagnóstico pode ser usado em conjunto com os iniciadores de RCP ou a qualquer instante depois do uso destes. A análise pode por conseguinte ser efectuada, por exemplo, por simples adição de amostra a ser analisada a um único recipiente que contém os iniciadores de RCP, o iniciador de diagnóstico, trifosfatos de nucleósi-dos apropriados e um agente para a polimerização dos trifosfatos de nucleósidos. Os produtos obtidos e em consequência as bandas dos produtos que se observam são conforme descrito anteriormente e apresentados na Figura 4. 54 *

i A Figura 5 mostra a quarta forma de concretização da presente invento na qual se leva a efeito uma amplificação normal conforme descrito em relação com a Figura 4. O produto de amplificação deste modo obtido é em seguida feito contactar sob condições de hibridação quer com (a) dois iniciadores de diagnóstico separados conforme anteriormente definidos, tendo cada um um nucleótido normal 3'-terminal quer com (b) dois iniciadores de diagnóstico conforme anteriormente definido, tendo cada um um nucleótido variante 3'-terminal (ver Figura 5a). A formação de produtos d- extensão a seguir a um único ciclo demonstra se o ácido nucleico da amostra contem o nucleótido normal ou o variante, obtendo-se por técnicas de electroforese um padrão de bandas semelhante ao apresentado na Figura 5b. Deverá notar--se no entanto gue quando se usam dois iniciadores de diagnóstico, um iniciador de diagnóstico serve de iniciador de amplificação para o outro iniciador de diagnóstico. Se se

I pretender, por conseguinte, é possível submeter a amplificação o(s) próprio(s) produto(s) de extensão. Deste modo, depois de vários ciclos adicionais formam-se produtos de peso molecular inferior como os que se apresentam na banda adicional da Figura 5 em proporções que dependem das proporções relativas dos oligonucleótidos do iniciador de RCP original e dos iniciadores de diagnóstico adicionados. Os produtos de amplificação de RCP podem distinguir-se facilmente dos produtos de extensão do iniciador de diagnóstico por meio de por exemplo aumento ou diminuição de distância que separa os locais de ligação dos iniciadores de RCP no genoma.

Se desejado a quarta forma de concretização da presente invenção pode ser afectada pelo contacto com a amostra a ser testada no início do teste com, não só os in iciadores de RCP, mas também com os iniciadores de diagnóstico. PQr isso não é necessário atrasar o uso do iniciador de diagnóstico até ter sido alcançado um grau desejado de amplificação do produto de controlo de RCP. De facto os iniciadores de diagnóstico podem ser utilizados conjuntamente 55 Η

com o iniciador de RCP ou a qualquer momento após o iniciador de RCP ter sido empregue. 0 teste pode# assim, ser afectado, por exemplo, pela simples adição da amostra a ser testada a um único recipiente, o qual contém os iniciadores de RCF, os iniciadores de diagnóstico, trifosfatos de nucleósidos apropriados e um agente para a polimerização dos trifosfatos de nucleósidos. Se o teste for realizado i desta maneira, os produtos de diagnóstico de baixo peso molecular referidos acima serão formados dando assim forma às bandas adicionais descritas na Figura 5. A Figura 6 (não à escala) descreve o gene de antitripsina o;l humano, que é bem conhecido na especialidade (Long G.L. et al. Biochemistry Vol 23 p4828-4837,

I (1984)), mostra inter alia as posições relativas dos exões III e V que compreendem respectivamente as mutações potenciais S e Z da proteína antitripsina al. Sm particular a figura apresenta o exão III do gene da antitripsina al e mostra a posição da variante S na qual o codão GAA sé encontra mutado para GTA dando como resultado a produção de um resíduo de valina no ácido aminado 264 em vez de um resíduo de ácido glutâmico. Podem ser usados de modo conveniente um iniciador I com a sequência 5' CCCACCTTCCCCTCTCTCCAGGCAAATGGG 3' I que híbrida com as posições 7440 a 7469 do gene da antitripsina al e um iniciador II com a sequência:-

5· GGGCCTCAGTCCCAACAIGGCTAAGAGGTG 31 II ou um iniciador IIa (um desemparelhamento CF 31 baseado em II) com a sequências- 5' GGGCCTCAGTCCCAACAFGGCFAAGAGGTT 3' IIa cada um dos quais se encontra projectado para as posições 7770 a 7799 do gene da antitripsina al. 56 -

A Figura apresenta ainda o exão V do gene da antitripsina al e mostra a posição da viriante 2 na qual o codão GAG se encontra mutado para AAG dando como resultado a produção de um resíduo de lisina no ácido ami-nado na posição 342 em vez de um resíduo de ácido glutâmico. Podem ser usados de modo conveniente um iniciador III com a sequência

5 · TGTCGACGIGJ-iGCGTTGCTCGAGGCGIGGG 3' III que híbrida com as posições 9890 a 9919 do gene da antitripsina al e um iniciador IV com a sequências-

5' GAGACTTGGTA^TTGTTCÃAICATTAAG 3' IV que hibrida com as posições 10081 a 10109 do gene da antitripsina al. A numeração das bases apresentada anterior-mente está de acordo com a descrita em Biochem, 23 4828-4837, 1984. A Figura 7 mostra o resultado da visualização do gel obtido nos Exemplos 1 e 2. A pista 1 representa um plasmídeo que contém o Exão V cortado com Alu I; a pista 2 mostra um marcador de dimensão que é constituído pelo ADN do bacteriófago çí X174 cortado com Hae II; a pista 3 mostra a amplifscação do Exão III com os iniciadores I e II conforme definido art eriormente e a amplificação do Exão V com os iniciadores III e IV conforme definidos an-teriormente na mesma mistura reacional para dar origem a produtos de 360 pb e de 220 pb respectivamente. A pista 4 mostra que não ocorreu amplificação do Exão III quando se usaram os iniciadores I e lia conforme definidos anteriormen-te, mas que foi efectuada amplificação do Exão V com os iniciadores III e IV conforme definidos anteriormente. A pista 5 mostra um controlo negativo no qual os iniciadores I, II, III e IV estão presentes sob condições propícias para promover a amplificação mas em que não está presente ADN genómico. 57 *} '

A Figura 8 mostra nas pistas 1 a 3 os resultados do Exemplo 3, nas pistas 5 a 8 os resultados da utilização de iniciadores de diagnóstico normal e mutante nos quais não foi efectuada qualquer destabilização de acordo com o Exemplo 4 e a pista 9 mostra o marcador de dimensão do bacteriófago 0 X174. A pista 1 mostra o resultado da utilização da sequência nucleótidica:-

5 'IXSGTGATGATATGGTGGGÍGAGTTGATSTT V como iniciador de diagnóstico e o oligonucleótido designado por I conforme definido anteriormente como iniciador de amplificação. 0 ADN genómico humano usado foi proveniente de um homozigoto normal com um nucleótido normal (a) presente no ponto de mutação potencial S do gene da antitripsina al. 0 produto de amplificação esperado de 267 pb é claramente visível. A pista 2 mostra o resultado da utilização da sequência nucleótidica;-

5 'TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATíTÍA VI como iniciador de diagnóstico e o oligonucleótido designado por I conforme definido anteriormente como iniciador de amplificação, o ADN genómico humano usado foi proveniente de um homozigoto normal com um nucleótido normal (A) presente no ponto de mutação potencial S do gene da antitripsina al.

Na presença de um desemparelhamento A-A não se forma qualquer produto de amplificação de 267 pb. A pista 3 mostra uma banda de comparação baseada no gene da apoliproproteina B, sendo as sequências usadas

XIII

^ATGAATTTATCAGCCAAAACTTTTACAGG e

CFCTGGGAGCACAGTACGA AAAACCACIT XIV A pi;,ta 4 foi deixada em branco. 58 -

A pista 5 mostra o resultado da utilização da sequência nucleótidica

VII

5 1CCGTGCATAAGGCTGTGCXGACCAÍPCGAGG corro iniciador de diagnostico no Exemplo 4. o iniciador de diagnóstico contém um nucleótido 3'-terminal '-CG) capaz de emparelhamento de bases com um nucleótido normal (C) no ponto de mutação potencial 2 e é em caso contrário completamente complementar do ADN daamostra. 0 ADN da amostra usado foi proveniente de um homozigoto normal com um nucleótido normal (C) presente no ponto de mutação potencial Z do gene da anti-tripsina al. A pista 6 mostra o resultado da utilização da sequência nucleótidica:-

5'CGGTGGATAAGGCTGTGGTGAGGATGGAGA 3' VIII como iniciador de diagnóstico no Exemplo 4. o iniciador de diagnóstico contém um nucleótido 3‘-terminal (A) capaz de emparelhamento de bases com um nucleótido normal (T) no ponto de mutação potencial Z, mas á em caso contrário completamente complementar do ADN da amostra. 0 ADN da amostra usado foi proveniente de um homozigoto normal um nucleótido normal (C) presente no ponto de mutação potencial Z do gene da antitripsina αΐ. A pista 7 mostra o resultado da utilização da sequência nucleótidica da fórmula VII como iniciador de diagnóstico no Exemplo 4. 0 ADN da amostra usado foi proveniente de um homozigoto afectado por um distúrbio genético da antitripsina al humana e tendo um nucleótido mutante (T) no ponto de mutação Z. A pista 8 mostra o resultado da utilização d a sequência nucleótidica da fórmula VIII como iniciador de diagnóstico no Exemplo 4. 0 ADN da amostra usado foi proveniente de um homozigoto afectado por um distúrbio genético da antitripsina al humana e tendo um nucleótido mutante (T) no ponto de mutação S. A sequência nucleótidica do iniciador de amplificação usado em cada um dos ensaios apresentados nas pistas 5 a 8 é da fórmula IV conforme anteriormente definido. Pode o.oservar-se que a produção do produto de am- 59

plificação de 150 pb não é totalmente suprimida pela presença de um desemparelhamento A-C (pista 6) e é ainda menos suprimida pela presença de um desemparelhamento Gf (piBta 7).

A Figura 9 mostra o resultado da visualidade do gel obtido no Exemplo 4. As pistas 1 e 14 mostram o ADN do marcador de dimensão do bacterióf ago X174 cindido com Hae III í a pista 2 mostra o resultado da utilização da sequência nucleótidica;-

5 ' GCGOI-GCATAAGGCTGTGC^GACGATAGÂCG 3* IX como iniciador de diagnóstico na presença de ADN da amostra com um nucleótido normal (G) presente no ponto de mutação potencial E do gene da antitripsina al humana (ADN da amostra proveniente de um homozigoto normal). 0 iniciador da diagnóstico contém uma alteração deliberada (sublinhada na sequência IX-A em vez de C) no que diz respeito ao quinto nucleótido da extremidade 3'-terminal mas um nucleótido 31--terminal (G) capaz de ernparelhamento de bases com um núcleo^ tido normal (C) no ponto de mutação potencial Z. A pista 3 mostra o resultado da utilização da sequência nucleotídica:-

5·CCGTGaA^AAGGGrGTGCTGACCATAGACA 3' X como iniciador de diagnóstico na presença de ADN da amostra com um nucleótido normal (G) presente no ponto de mutação potencial Z (ADN da amostra proveniente de um homozigoto normal). 0 iniciador de diagnóstico contém uma alteração delibérada (sublinhada na sequência X - A em vez de C) no que diz respeito ao quinto nucleótido da extremidade 3'-terminal mas um nucleótido 3'-terminal (A) capaz de emparelha-mento de bases com um nucleótido mutante C?) no ponto de mutação potencial Z: a pista 4 mostra o resultado da utilização da sequência nucleótidica IX (conforme definido ante-riormente) como iniciador de diagnóstico na presença de ADN ds amostra proveniente de um heterozigoto para a mutação Z e deste modo portador do distúrbio genético da deficiência - 50 -

em antitripsina al humana; a pista 5 mofetra o resultado da utilização da sequência nucleotídica X (conforme definida anteriormente) corno iniciador de diagnóstico na presença de ADN de amostra proveniente de um heterozigoto para a mutação 2 e deste modo portador do distúrbio genético da deficiência em antitripsina al humana. A pista 6 mostra o resultado da utilização da sequência nucleotídica IX (conforme definida anteriormente) como iniciador de diagnóstico na presença de ADN de amostra proveniente de um homozigoto afectado com o distúrbio genético da antitripsina al humana. A pista 8 mostra o resultado do uso da sequência nucleotídica:-

5 ' CCGTG CΑ'ΓAAGGΟΓΘ'Γ GCTGACCAECGGCG 3 ' XI como iniciador de diagnóstico na presença de ADN de amostra tendo um nucleótido normal (C) presente no ponto de mutação 2 potencial do gene al de antitripsina humano (ADN da amos fra de um homozigoto normal). O iniciador de diagnóstico contém uma alteração deliberada (sublinhada na sequência XI-C em vez de A), com respeito ao terceiro nucleótido da extremidade 3'-terminal, mas um (G) 3'-terminal capaz de em-parelhamento de bases com um nucleótido normal (C) presente no ponto de mutação Z potencial: a pista 9 mostra o resultado do uso da sequência nucleotídica?

5' CCGTGCATAAGGGTGI-GCIGACCASCGCCA 3' XII como iniciador de diagnóstico na presença de ADN tendo um nucleótido normal (C) presente no ponto de mutação Z potencial (ADN) de amostra de um homozigoto normal. O iniciador de diagnóstico contém uma alteração deliberada (sublinhada na sequência XII - G em vez de A) com respeito ao terceiro nucleótido da extremidade 3'-terminal e um nucleótido 3'--terminal (A) capaz de emparelhamento de bases com um nucleótido mutante (T), se presente no ponto de mutação Z potencial? a pista 10 mostra o resultado do uso de sequência 61

nucleotidica XI (conforme definida ant eriorrnente) como iniciador de diagnóstico na presença de ADN de amostra de um heterozigoto para a mutação 2 e portanto um portador da perturbação genética de deficiência de antitripsina ccl humana? e pista 11 mostra o resultado do uso da sequência nucleotídica XII (conforme definido anteriorrnente) como iniciador de diagnóstico na presença de ADN de amostra de um heterozigoto para a mutação 2 e portanto port ador da perturbação genética da antitripsina ccl humana. A pista 12 mostra o resul tado do uso da sequência nucleotidica XI (conforme definida anteriormente) como iniciador de diagnóstico na presença de ADN de amostra de um homozigoto afectado pela perturbação genética de deficiência de antitripsina ctl humana. A pista 13 mostra o resultado do uso da sequência nucleotidica XII (conforme definido anteriormente) como iniciador de diagnóstico na presença de ADN de amostra afectado pela perturbação genética da antitripsina ocl humana.

Em cada uma das pistas 2 a 13 a sequência nucleotidica da fórmula IV foi usada como iniciador de amplificação e as sequências de nucleótidos da fórmula XIII:- AATGAATTTAjíGAG CCAAAAÇTTTTACAGG XI11 e da fórmula XIVs-

CICIGGGAGCACAGSAGGAAAAACGAGIT XIV foram usadas como controlo. As bandas correspondentes ao controlo são marcadas (C) na Figura 9 e correspondem a um produto de amplificação de 510 pb do exlo 26 do gene da apolipoproteína 3 humana.

A Figura 10 ilustra o uso de um sistema de plasmídeos de cassette. 0 plasmídeo pAT 153,· tendo regiSes que conferem resistência aos antibióticos Amplicilina (Apr) e Tetraciclina (Tc ), assim como tendo os sitios de restrição EcoRl/ BamHI e Sall, é digerido com EcoRl e BamHl. A 62 - cassette sintética, compreendendo um ADN duplex com um núcleo-tido desemparelhado (no centro) devido à presença de uma sequência normal e de uma sequência variante simultaneamente, é ligada usando ligas de ADN T"4 no plasmídeo hospedeiro conforme se mostra. 0 plasmídeo é então replicado e seleccio-nado conforme se mostra. 0 sistema é ilustrado mais em pormenor como segue: Preparam-se cassettes de ADN sintético, cada uma compreendendo duas sequências de 65 bases temperadas tendo terminais de restrição ScoRI e BamHI e sendo o par de bases do meio desemparelhamento devido a um nucleótido variante. Estas cassettes foram introduzidas em hospedeiros do plasmídeo pAT153 como descrito acima e, depois de transformação, isolaram-se clones sensíveis à tetraciclina e extraíu-se o plasmídeo. Os extractos de plasmídeo foram então usados numa transformação secundária para proporcionar clones, quer com inserções normais, quer com inserções variantes. Para verificar que os clones continham a sequência completa, normal ou mutante, sequencialmente sequenciaram-se cerca de 2 jig de cada. após desnaturação com NaOH, e usando polimerase de ADN T4 (Sequsnase, Ό3 Biochemicals) e iniciador com marcação 32 P termiaal. Quando se encontram pelo menos um normal e um variante de cada tipo, cultivou-se um clone representativo de cada sem separação# e®traiu~se o plasmídeo e purificou-se usando um gradiente de CsCl. As cassettes foram então digeridas com Sall, extraídas com fenol/clorofórmio, precipitadas e lavadas com etanol a 70%. As cassettes ficaram então prontas e ser usadas, por exemplo em reacções em cadeia de polimerase para determinar a sensibilidade e a especificicTade'' .dos vários oligonlcleótidos. A figura 11 ilustra a quinta forma de concretização (amplificação linear) da presente invenção. Em a) mostra-se uma seguência de ADN genémico normal juntamente com dois iniciadores de diagnóstico, um dos quais é complementar no seu terminal 3' da sequência de ADN genómico normal, - 63 -

e tendo o segundo um nucleótido complementar do nucleótido variante suspeito no seu terminal 31. Sm b) mostram-se uma sequência de ADN genómico é posta em contacto com os iniciadores sob condições que permitam a hibridização complementar/ em ambos os casos ocorre hibridização. A adição de todos os quatro trifosfatos de nucleósidos sob condições que permitem a extensão dos iniciadores só conduz a um produto de extensão no caso de a) o iniciador da sequência normal e b) o iniciador da sequência variante/ sendo a extensão do outro iniciador impedida pelo desemparelhamento. Além disso, como mostrado em c), onde só trés ou menos trifosfatos de nucleósidos são adicionados, em . vez c|e quatro, a extensão do iniciado:: apropriado é impedido num dado ponto pela falta de trifosfato (s) de nucleósidos apropriado.(s). A Figura 12 postra os resultados da visualização do gel obtido no S^emplo 5.

Ag pistas 1 e 2 correspondem a ADN para um homozigoto(MM) normal, as pistas 3 e 4 a ADN para a hetero-zigoto (MS) e as pistas 5 e 6 a ADN para um homozigoto variante (S3). No que respeita às pistas 1. 3 e 5, usou-se oligonu-cleótodo XXII (normal) e no que respeita às pistas 2. 4 e 6 usou--se oligonucleótido XXI (variante). Como previsto, não ocorreu extensão do oligonucleótido no que respeita às pistas 2 ou 5.

As bandas de produto dstectadas são inidicadas por sinais >· A Figura 13 mostra os resultados da visualização do gel obtido no Exemplo 6.

A pista no extremo esquerdo mostra marcadores de dimensão usados para confirmar as dimensões dos produtos. obtidos. As pistas 1 e 2 correspondem a ADN de um homozigoto normal (MM), as pistas 3 e 4 a ADN de um heterozi-goto(mz) e as pistas 5 e 6 a ADN de um homozigoto variante (Z2). N0 que respeita às pistas 1, 3 e 5 usaram-se iniciadores XIX e XI; para as pistas 2, 4 e 6 usaram-se iniciadores XII 64 —

e XX. Como esperado, não ocorreu extensão dos iniciadores no que respeita às pistas 2 ou 5. As bandas de produto detec-tadas são indicadas por sinais .

Sequências do local 5 da antitripsina g-1 (exão XXX).

As bases apresentadas em letras minúsculas descrevem a sequência normal de cada local. As bases sublinhadas nos iniciadores mostram o desemparelhamento deliberado inserido para dasestabilizar os iniciadores. As coordenadas são conforme atribuidas por Long et al (1984) Bio-chemlstri 23 ? 4828-4837. 65 -

5 · CGGTGATGAGGGGAAACIÍAGAGCACGTGGT XXI

5' GGCTGATGAGGGGAAACmCAGCAGCTGGA XXII 5' CTTCGTGGGTGATGAGGGGAAAGTACAGCACCTGGa 31 GAAGGACGGACllACTCCCCTTTGATGTCGTGGACCt

I 7642 7718

I aAAATGAAGUCACCGAGGAT ATCATGACCAAG^TCCTGGAAA 3' t^>‘l\ACTGGAGTGGGlGCTASAGritAGTGGSTCAAGGACCtI1Tir 5 1 GACAGCTGrTAGGGATGnOGGACTGAGGGGGATGAGGACIGGG 3 ' GTGTGGAGAATCGGTACAAGGCmACTCCGGGTAGTGCTGACGG 5' i 7811 GTGGAGAATCGGTAGAAGCCTGACTCCGGG 5' TTGGAGAATGGGTAGAACCCTGAGTCCGGG 5 *

Sequência do local Z da antitripsina al (excio V)

As bases apresentadas em letras minúsculas descrevem a sequência normal de cada local. As bases sublinhadas nos iniciadores mostram o desemparelhamento deliberado inss-rino para desestabiliaar os iniciadores. 56

5' GGGTGGATAAGGGTGTGCTGAGGCTGGAGA XVI 5' CCGTGCATAAGGGTGTGCTGACCCTCGACG XV 5' CGGTGCATAAGGCTGTGCTGAGGATAGACA mm X 5' CCGTGCATAAGGCTGTGGTGACCATAG ACG IX 5' CCGTGCATAAGGGTGTGÇBSAGGATCGÇGA M n H H 5' GCGTGGATAAGGGTGTGCTGAGGATSGGGG XI 5‘ CCGTGGATAAGGGTGTGCTGACaATCGACA VIII 5' GCGTGCATAAGGCTGTGCTGACGATCGAGG VII 5' TCCAGGCCGTGCATAAGGCPGTGCTGACCAT-CGAGg 3· AGGTCCGGCACGTATTCGGAGACG ACTGGTAGCTGc 9954 10030 gAGAAAGGGAGTGAAGGXGGTGGGGCCATGTxTTTAGAGGCC 3! cTCTTTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTACAAAAATCTCCGG 51

CTCTrTCCGrGAGTíPCGAGGAGCCCGGTAC 5' XVII

TTCrTTCGGTGAGTTCGACGACGCGGGTAG 5' XVIII

CTGATTGCCTGAGITGGAGGACGGGGGXAC 5' XIX

TTGArTGGCTGAOXTCGAGGAGGCGGGTAC 5' XX A presente invenção é ilustrada# mas não limitada# pelos Exemplos seguintes. Mos Exemplos, guando não for indicado o contrário# os materiais usados são-no nas seguintes quantidades ou concentrações ADN substrato; 1 ^ig de ADN genómico humano Oligonuclsótidos; 100 pmoles de cada oligonucleótido apropriac. «Prifosfatos de desoxinucleósido; Cada a concentração final de 1# 5 mM.

Tampão (centrifugações finais na mistura reaccional):

Tris 67 mM (pli 8# 8 com HG1)

Sulfato de amónio 16#6 mM

Cloreto de magnésio 6#7 mM 3-Mercaptoetanol 10 mM

EDTA 6# 7 uM 67 -

Tampão de cargaí - Ficoll 70 a 35% - (Ficoll 70 é um polímero sintético feito por copolimerásação de sucrose e epicloro-hidrina, tendo o copolí-mero um peso molecular médio aproximado de 70000 - produto de Pharmacia)

Tris-acetato 2Ω0 mM

Acetato de sódio 100 mM

EDTA 5 mM O, 2 %

Azul de bromofenol

Marcadores de dimensão: - ADN de bacteriófago Çf XI74 cindido com Hae III? A dimensão das bandas em pares de bases é: -- 1353, 10 78, 87 2, 603 , 310, 281, 271, 234, 194, 118, e 72.

Exemplo 1

Misturaram-se num tubo de microcentrifu-ga de tampa roscada de 1.5 ml 1 ^ug de ADN genómico humano. 100 pmoles de cada um dos oligonucleótidos I, II, III, e IV conforme definidos anteriormente, 1.5 mM (concentração final) de cada um dos quatro trifosfatos de desoxinucleóside e tampão nas concentrações finais definidas acima, após o que se ajustou o volume de a 100 ;ul com água destilada estéril. 0 tubo foi selado e colocado num banho de água em ebulição durante 5 minutos. A reacção foi iniciada adicionando 1 /il de polimerase Taq contendo 1 unidade de enzima (Anglian Biotech lote 3 diluido para 1 unidade / ^ul com o tampão referido acima). 0 tubo foi incubado a 58°G durante 4 minutos e depois a 91°G durante 2 minutos. 0 regime de a.guecimento / arrefecimento 58°C/91°G foi continuado durante mais 5 ciclos, altura em que se adicionou mais 1 unidade de enzima (como acima). 0 regime de aquecimento/arrefecimento 58°C/91°G foi continuado durante mais 6 ciclos seguidos pela adição de mais 1 unidade de enzima (como acima). 0 ciclo de aquecimento/arrefecimento anterior foi continuado por mais 6 ciclos seguidos pela adição de mais 1 unidade de enzima (como acima) e em seguida por mais 5 ciclos seguidos pela adição de mais 1 unidade de enzima, 68 -

depois por mais 2 ciclos seguidos pela adição de mais 1 unidade de enzima (como acima). Este regime foi então seguido por incubação a 58u durante 20 minutos. A detecção dos produtos de amplificação foi efectuada combinando 15 ,ul da mistura de reacção com um tampão de carga de gel separado, seguido por electroforese em gel de agarose (3 % de "NuSieve") contendo brometo de etídio (2 /íg/ml), A electroforese foi conduzida contra marcadores de dirnensães para confirmar a dimensão correcta dos produtos de amplificação. 0 gel foi visualizado num transiluminador (300 nm de comprimento de onda) e foi tirada uma fotografia polaroid. A pista 3 da Figura 7 mostra o resultado desta visualização. Assim a pista 3 mostra a amplificação do Exão Ι1Ί com iniciadores I e II, como anterior-mente definidos, para gerar um produto de 360 pb e amplificação do Exão V com iniciadores 111' e IV, como anteriormente definidos, para gerar um produto de 220 pb.

Exemplo 2

Repetiu-se o exemplo 1/ mas o iniciador II foi substituído pelo iniciador Ha, como definidos anteriormente. A Figura 7, pista 4, mostra o resultado da visualização do gel obtido neste Exemplo. Pode-se ver que não tem lugar qualquer amplificação de Exão III usando os iniciadores I e lia, como definidos anteriormente, mas que foi efectuada amplificação de Exão V com os iniciadores III e IV, como definidos anteriormente, para gerar o mesmo produto de 220 pb como no Exemplo 1.

Assim, o Exemplo 2 demonstra que um desemparelhamento na extremidade 3' de um iniciador oligo-nucleótidico impede, ou pelo menos inibe substancialmente, a iniciação da actividade de polimera.se. 69

Exemplo 3

Ale lo S de antitripsina cc-1 humana

Misturaram-se num tubo de microcentri-fugação de tampa roscada de 1, 5 ml l^u@ de ADN genómico humano, 100 pmoles de cada um dos oligonucleótidos abaixo pormenorizados, 1,5 mM. (concentração final) de cada um dos quatro trifosfatos de desoxinucleósidos e tampão nas concentrações finais pormenorizadas acima, após o que se ajustou o volume a 100 ^ul com água destilada estéril. 0 tubo foi selado e colocado num banho de água em ebulição durante 5 minutos. A reacção foi iniciada adicionnando 1 ^1 de politne-rase Taq conteido 1 unidade de enzima (Anglian Biotech lote 3 diluído para 1 unidade/^ug com o tampão referido acima). 0 tubo foi incubado a 58°C durante 4 minutos e depois a 91°C durante 2 minutos. C regime de aquecimento/arrefecimento 58°C/ 91°C foi continuado durante mais 5 ciclos, altura em que se adicionou mais 1 unidade de enzima (como acima). 0 regime de aquecimento/arrefecimento 58 C/91 C foi continuado durante mais 6 ciclos seguidos pela adição de mais 1 unidade de enzima (como acima). 0 ciclo de aquecimento/arrefecimento acima foi continuado por mais 6 ciclos seguidos pela adição de mais 1 unidade da enzima (como acima), e depois por mais 5 ciclos seguidos pela adição de mais 1 unidade de enzima, depois por mais 2 unidades seguidos pela adição de mais 1 unidade de enzima (como acima). Este regime foi então seguido por incubação a 58° durante 20 minutos.

Os testes seguintes foram conduzidos com base no protocolo acimar- a) os oligonucleótidos usados foram

5 «TGGTGAIGATAT-CGTGGGTGAGTTCATTTT V e o oligonucleótido designado por 1 como definido anterior-rnente, 0 ADN genómico humano usado foi de um homozigoto nor- 70

mal, não afectado pela perturbação genética de antitripsina al humana: e b) os oligonucleótidos usados foram

TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTA VI e o oligonucleótido designado por I como definido anterior-mente. 0 ADN genómico humano usado foi de um hornozigoto normal, não afectado pela perturbação genética de antitripsina al humana. A detecção dos produtos de amplificação foi efectuada combinando 15 ^ul da mistura de reacção com um tampão de carga de gel separado, seguindo a electroforese em gel de agarose (3 % de "NuSieve") contendo brometo de etídio (2 ^.ug/ml). A electroforese foi conduzida contra marcadores de dimensão (Pista S da Figura 8) para confirmar o tamanho correcto dos produtos de amplificação. 0 gel foi visualizado num transiluminador (300 nm da comprimento de onda) e foi tirada uma fotografia polaroid. As pistas 1 e 2 da Figura 8 mostram o resultado desta visualização. Assim a Pista 1 mostra que I efectuada amplitfi.cação quando a sequência nu-cleotídica de fórmula V é usada com um nucleótido terminal 3' complementar do nucleótido correspondente no ponto de mutação S potencial no ADN de amostra usado e ê formado um produto de amplificação de 267 pb. A Pista 2, contudo, mostra que não é efectuada amplificação quando ocorre um desempa-relhamento na extremidade 3'-terminal do iniciador de diagnóstico, tendo o iniciador de diagnóstico usado o nucleótido (A) na sua extremidade 3'-terminal que desemparelha com o nucleótido (A) no ponto de mutação s potencial de uma amostra de ADN de um hornozigoto normal.

Exemplo 4 Aleio 2

Misturaram-se num tubo de microcentrifuga de tampa roscada de 1,5 ml 1 jag de ADN genómico humano, 100 71 pmoles de cada um dos oligonucleótidos abaixo pormenorizados, 1.5 mH (concentração final) de cada um dos quatro tri-fosfatos de desoxinucleótidos e tampão nas concentrações finais pormenorizadas acima, após o que se ajustou o volume a 100 ;ul com agua destilada estéril. 0 tubo foi selado e colocado num banho de água em ebulição durante 5 minutos. A reacção foi iniciada adicionando 1 xul de polimerase Taq contendo 0,5 unidades de enzima (Anglian Biotech lote 9 diluído para 0,5 unidades/jul com o tampão referido acima). O tubo foi incubado a 60°C durante 4 minutos e depois a 91°C durante 2 minutos. 0 regime de aquecimento/arrefecimento a 60°C/91°C foi contmnuado durante mais 5 ciclos, altura em que se adicionaram mais 0.5 unidades de enzima (como acima). 0 regime cie aquecimento/arrefecimento a 60°C/91°C foi continuado durante mais 6 ciclos seguidos pela adição de mais 0.5 unidades de enzima (como acima). 0 ciclo de aquecimento/arrefecimento acima foi continuado por mais 6 ciclos seguidos pela adição de mais 0.5 unidades de enzima (como acima) e depois por mais 5 ciclos seguidos pela adição de mais 0.5 unidadês de enzima, depois por mais 3 ciclos seguid os pela adição de mais 0,5 unidades de enzima (como acima). Este regime foi então seguido por incubação a 60°G durante 20 minutos.

Foram então conduzidos os testes seguintes com base no protocolo acima: a) os oligonucleótidos usados foram IX e IV, como definidos anteriormente, e o ADN genómico humano usado foi de um homozigoto normal não afectado pela perturbação genética de antitripsina cíl humana? b) os oligonucleótidos usados foram X e IV# como definidos anteriormente, e o ADN genómico humano usado foi de um homozigoto normal não afectado pela perturbação genética de antitripsina ccl humana? c) os oligonucleótidos usados foram IX s IV, como definidos anteriormente, e o ADN genómico humano usado 72 - foi de um heterozigoto para o alelo Z de antitripsina al humana; d) os oligonucleótidos usados foram X e IV, como definidos anteriormente, e o ADN genómico humano usado foi de um heterozigoto para o alelo z de antitripsina al humana; e) os oligonucleótidos usados foram IX e IV, ãomo definidos anteriormente, e o ADN genómico humano usado foi de um homozigoto (ZZ) afectado com a perturbação de antitripsina al; f) os oligonucleótidos usados foram X e IV, como definidos anteriormente, e o ADN genómico humano usado foi de um homozigoto (zz) afectado pela perturbação de antitripsina al; g) os oligonucleótidos usados foram XI e IV, como definidos anteriormente, e o ADN genómico humano usado de um homozigoto normal não afectado pela perturbação genética de antitripsina al humana; h) os oligonucleótidos usados foram XII e IV, como definidos anteriormente, e o ADN genómico humano usado foi de um homozigoto normal não afectado pela perturbação genética de antitripsina al humana; i) os oligonucleótidos usados foram XI e IV, como definidos anteriormente, e o ADN genómico humano usado foi de um heterozigoto para o alelo Z de antitripsina al humana; j) os oligonucleótidos usados foram XII e IV, como definido anteriormente, e o ADN genómico humano usado foi de um heterozigoto para o -alilo Z de antitripsina al humana; 73

k) os oligonucleótidos usados foram XI e IV/ como definidos anteriormente/ e o ADN genómico humano usado foi de um homosigoto (22) afectado com a perturbação de antitripsina al? l) os oligonucleótidos usados foram XII e IV/ como definidos anteriormente, e o ADN genómico humano usado foi de um homozigoto (ZZ) afectado com a perturbação de antitripsina al;

Em cada teste as sequências nucleotídicas das fórmulas XIII e XIV foram usadas como controlo de amplificação. A detecção dos produtos de amplificação foi efectuada combinada 15 ^ul da mistura de reacção com um tampão de carga de gel separado, seguido por eleetroforese num gel de agarose a 1.4 % contendo brometo de etidio (0.5 μg/ /ml). A eleetroforese foi conduzida contra marcadores de dimensão, como definidos anteriormente, para confirmar a dimensão correcta dos produtos de amplificação. 0 gel foi visua-lisado num transiluminador (300 nra de comprimento de onda) e foi tirada uma fotografia polaroid. Ag Pistas 2 a 13 da Figura 9 mostram o resultado desta visualização, representando as pistas 1 e 14 as bandas dos mercadores de dimensão. Assim, as Pistas 2 a 7 mostram que a desestabilização do iniciador de diagnóstico por alteração do quinto nucleótido de extremidade 3'-terminal não é completamente eficaz, de modo a permitir ao iniciador distinguir entre uma amostra de ADN normal e uma de ADN mutante, sob estas condições de reacção.

As pistas 8 a 13, no entanto, mostram que a alteração do terceiro nucleótido da extremidade 3'-terminal do iniciador de diagnóstico ê exequível para permitir que o iniciador discrimine entre uma amostra de ADN mutante e uma amostra de ADN normal e pode, assim servir de diagnóstico para homozigotos, heterozigotos (portadores) ou homozigotos ZZ normais afecta-dos com uma perturbação de antitripsina al humana. 74 -

As experiências acima mencionadas deste exemplos foram também levadas a cabo utilizando um iniciador de diagnóstico no qual não se fizeram quaisquer alterações de destaMlizaçcio do nucleótido e no qual o sétimo nucleóti-do da extremidade 3'-terminal foi alterado (A) para (C) para efectuar a destafoilização. Em qualquer dos casos o iniciador de diagnóstico não foi completamente eficaz para descriminar entre uma amostra de ADN normal e uma amostra de ADN mutante, encontra-se este facto ilustrado na figura 8. pistas 5 a 8 no que respeita ao iniciador de diagnóstico não ter quaisquer alterações adicionais de destabilização do •nucleótido.

Exemplo 5

Os oligonucleótidos XXI! (normal) e XXI (variante) foram utilizados corno iniciadores. Neste exemplo h mistura de dNTP de A, G e T dará um iniciador extendido de sete bases no molde antes de requerer o trifos-fato de nucleótido C. A Tm para estes oligonucleótidos foi calculado em 94°C utilizando a formula Tm = 4 (G+C) e 2 (A+T) mas acredita-se que só é relevente para oligonucleótido até 23 bases e assim foi selecclonada preferencialmente uma temperatura de 75°C.

Os oligonucleótidos (8 pmole cada) foram rotulados no grupo hidroxilo 5'-terminal utilizando d p ATP (Amersham 2uCi) e quinase de polinucleótido (4 unidades) num volume de reacçlo de 80 xul contendo tris.Cl 5 mH de pK 7,6, MgCl ? lOmM, DDT 5 mM, espermidina lOOuM e EDTA 100 /Μ. A reacção de quinase foi levada a cabo a 37°C durante 20 minutos, em seguida os oligonucleótidos etiquetados foram verificados por electroforese em gel de 15% de poli-acrilamida desnaturada/Ureia 8M (pré-desenvolvimento 1 hora 500 V. desenvolvimento principal 4 horas 800 V).

Foram utilizados dois plasmídeos, um contendo a sequência normal (MM) do local S do exão III do 75 gene de antitripsina al humano e o outro contendo a sequência variante correspondendo ao homozigoto variante (SS).

Foram aprontados seis tubos, 2 de cada tipo possível de ADN. Foi utilizado 1 imole do plasmídeo apropriado para os homo-zigotos mas o teterozigoto foi simulado utilizando-se O,5 fmole de ambos os plasmídeos. Foi creado um oligonucleótido etiquetado com um excesso de 200 vezes - cada tubo por adição de 200 fmoles (2 ^,ul da solução etiquetada) quer de oligo— nucleótido normal (XXII) quer do variante (30íl) para cada tipo de ADN. Cada tubo continha o 3dNTPs de A, G e T (Pharmacia) numa concentração final de 5 mM cada num volume de reacção de 20 ul contendo EDTA 6, 7 mM, MgCl^ 6, 7 mM, Tris. . HC1 6,7 mM 8,8, mercaptoetanol, 10 mM e sulfato de amónio 16,6 mM. Os volumes de reacção foram triplicados isto é utilizaram-se em cada caso 60 jal para minorar os efeitos da evaporação. Os tubos foram fervidos durante 5 minutos e em seguida guardados em gelo antes de se adicionar a cada tubo 3 unidades de P0limerase Taq (Cetus numa diluição de 1 em 5 com MgCl2 1,5 mM. KC1 50 mM, Tris 10 mM a pH 8,3 e 0,01 % de gelatina para dar 1 unidade/ ^μΐ). Os tubos foram submetidos a centrifugação a 13 000 rpm durante 2 linutos e foi adicionada uma aliguota de 2 pl a 5 ^il de farmamida/ /corante azul de bromofenol. Os tubos foram em seguida deixados a repouso num banho de água a 75°C. Após 4 horas os tihbos foram removidos e submetidos a centrifugação durante 1 minutos a 13 000 rpm, tomaram-se outros 2 ^ul de aliguota e adicionaram-se a 5 ^1 de corante. Os tubos foram em seguida recolocados em banho de água a 65°C. Após 6 horas os tubos foram removidos outra vez e foram novamente adicionados mais 3 unidades de Polimerase Taq a cada tubo, submeteram--se a centrifugação durante 1 minuto a 13 000 rpm e adicionou-se uma gota de um óleo mineral léve (Sigma) para diminuir e avaporação mas não se removeu qualquer aliquota. Os tubos foram em seguida deixados a 75° C durante a noite. Após 24 horas calculadas desde o fim da centrifugação inicial os tubos foram removidos do banho de água, submetidos a centrifugação 1 minuto e as alíquotas finais de 2 ^,ul foram adicionadas a - 76 -

V -V

5 ;ul de corante. Todas as aliquotas foram submetidas a electroforese com um pré-desenvolvimento (1 h; 500 V) em gel de poliacrilamida a 15% desnaturante/Ureia 8M em tampão de 1 x TBE (Tris borato 0,089 M, de ácido bórico 0,089, EDTA 0,002 M) durante cinco horas e meia a 880 V. Os geis foram em seguida auto-radiografados durante a noite à temperatura ambiente sem qualquer filtro em filme fotográfico lento. Os resultados são apresentados na figura 12.

As pistas 1 e 2 correspondem a ADN para um homozigoto normal (MLí), as pistas 3 e 4 a ADN para um heterozigoto (MS) e as pistas 5 e 6 para um homozigato variante (S3). N0 que diz respeito às pistas 1, 3 e 5 usou--se o oligonucleótido XXII (normal) e no que diz respeito às pistas 2. 4 e 6 usou-se o oligonucleótido XXI (variante). Gomo previsto, a extensão do oligonucleótido não ocorre no que diz respeito às pistas 2 ou 5. As bandas do produto detectado sâo indicadas por sinais > ^ .

Bxemolo 6

I

Misturaram-se 1 ng de ADN de plasmí-deo de cassette, 100 pmoles de cada um dos inniciadores de oligonucleótidos TTACTTTCACCAGGGTTTCTGGGTGAGCAA e TATGGGACTCCGTGCATTAGGAGCAGGCCA, 1*5 mM (concentração final) de cada um dos quatro trifosfatos de dasoxinucleótidos e tampão nas concentrações finais descritas acima num tubo de microcentrifuga de tampa roscada de 1,5 ml e ajustou-se o volume a 100 ^ul com água desioni-zada estéril (Milli o). Selou-se o tubo e colocou-se num banho em ebulição durante 5 minutos. Iniciou-se a reacção por adição de 2 unidades de polimerase Taq (Cetus) e selou- -se a mistura com óleo mineral leve (Sigma) para evitar a evaporação. Incubou-se o tubo a 60°C durante 4 minutos segui- 77 -

dos de dois minutos a 90°C. Repetiu-se este procedimento num total de trinta ciclos.

Reraoveram-se em seguida 60 ^jul da mistura reaccional e adicionaram-se a estes 60 prnoles de cada um dos iniciadores XIX e XI (normal) ou dos iniciadores XII e XX (variante). A^icionou-se em seguida 1 unidade de poli-merase Taq (Cetus) para iniciar a reacção seguinte. Incu-bou-se a mistura a 92°G durante dois minutos seguidos de quatro minutos a 60°G. Este procedimento foi repetido num total de quatro ciclos. A detecção de produtos de amplificação foi efectuada por combinação de aliquotas de 10 ^μΐ da mistura reaccional com um "tampão" de carga de gel seguido de electroforese em gel de agarose a 3 % ("Nu Sieve", FMC 3ioproducts) contendo 0,5 jag/ml de brometo de etidio. Visualizou-se o gel num transiluminador (comprimento de onda 300 nm) e fez-se uma fotografia polaroide. Os resultados são apresentados na Figura 13. A pista na estrema esquerda mostra marcadores de dimensão usados para confirmar as dimensões dos produtos obtidos. As pistas 1 e 2 correspondem a ADN de um nomozigoto normal (MM), as pistas 3 e 4 a ADN de um heterozigoto (M2) e as pistas 5 e 6 a ADN de um homozigoto variante (ZZ). No que diz respeito às pistas 1. 3 e 5 usaram-se os iniciadores XIX e XI: para as pistas 2. 4 e 6 usaram-se os iniciadores XII e XX. Como era de esperar a extensão do iniciador não ocorre no que dis respeito às pistas 2 ou 5. As bandas dos produtos detectores estão indicadas por sinais^ ^ . 78 -

BEIVIIDIGÂOOES - lã -

Processo para a detecção da presença ou da ausência de pelo menos um nuoledtido variante em um ou mais ácidos nucleicos contidos numa amostra, caracterizado por se tratar a amostra, em conjunto ou sequencialmente com trifosfatos de nucledsido apropriados, oom um agente para a polimerazação dos trifosfatos de nucledsido e oom um marcador ("primer") diagndstioo para uma região diagndstioa de uma determinada sequência de "bases nas condiçSes de hi-bridação, em que a sequência de nucledtidos do referido "primer" diagndstioo é substancialmente complementar à referida região diagndstioa, em que o nuoledtido terminal do "primer" diagndstioo d complementar ou ao nuoledtido variante a detectar ou ao nuoledtido normal correspondente, sintetizando-se um produto da extensão do "printer" dia-gndstico quando o referido nuoledtido terminal do "prdnter" diagndstioo for complementar ao nuoledtido correspondente na sequência de bases e analisar e não se sintitizando qualquer produto de extensão quando o referido nuoledtido terminal do "printer" diagndstioo não for complementar ao nuoledtido correspondente na sequência de bases a analisar, e se detectar a presença ou a ausência do nucledtido variante suspeito pela presença ou pela ausência de um produto de extensão. - 2§ -

Processo de aoordo oom a reivindicação 1, caracterizado por 1) se tratar a amostra, em conjunto ou sequencialmente, oom trifosfatos de nucledsido apropriados, com um 79 agente para a polimerização dos trifosfatos de nuclósid®, com um "primer" diagnóstico para a região tiagnóstica de uma sequência de bases a determinar e com um "primer" de amplificação correspondente nas condições de Mbridação, em que a sequência de nucleótidos do referido "primer" diagnóstico é substancialmente complementar à referida região diagnóstica, em que o nucleótido terminal do "primer" diagnóstico é complementar ou ao nucleótido variante a analisar ou ao nucleótido normal correspondente, sintetizando-se um produto de extensão do "primer" diagnóstico quando o referido nucleótido terminal do "primer" diagnóstico for complementar ao nucleótido correspondente na sequência de bases em causa, não se sintetizando qualquer produto de extensão quando o nucleótido terminal referido do "primer" diagnóstico não for complementar ao nucleótido correspondente na sequênoia de bases em causa; possuindo qualquer produto de extensão do "primer” diagnóstico formando a capacidade de servir de templasto para a síntese de um produto de extensão do referido "primer" de amplificação, após separação do seu complemento; se tratar a amostra em condições de desnaturação de modo a separar o produto de extensão do "primer" do seu templato, onde se forma esse produto de extensão; se porem em contacto as cadeias simples preparadas no passo (2) em conjunto ou sequencialmente, oom trifosfatos de nucleósido apropriados, com um agente para a polimerização dos trifosfatos de nucleósi-ddt, com um "primer" diagnóstico e com um "primer" de amplificação tal como descritos anteriormente, sempre que possível, de modo a sintetizarem-se outros produtos de extensão utilizando as cadeias so

simples preparadas no passo (2) oomo templatos; (4) (5) ) se repetirem os passos (2) e (3) o número suficiente de vezes para se obter uma amplificação detectá-vel da sequência de nuoleótidos apropriados; e se detectar a presença ou a ausência do nucleótido variante suspeito pela presença ou ausência de um produto de amplificação obtido no passo (4). - 3& -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se tratar a amostra, em conjunto ou sequencialmente com a) um primeiro "premier" diagnóstico com uma sequên cia substancialmente complementar à região diagnóstica de uma primeira sequência de ácidos nucleicos, em que o primeiro "primer" diagnóstico tem um nu-cleótido terminal complementar ao referido nucleóti-do variante suspeito, e em que um segundo "primer" diagnóstico tem uma sequência substancialmente complementar a uma região diagnóstica de uma sequência de ácidos nucleicos em que o segundo "primer" diagnóstico tem um nucleótido terminal complementar ao nucleótido variante suspeito complementar; ou (b) um primeiro "primer" diagnóstico com uma sequência substancialmente complementar a uma região diagnóstica de uma primeira sequência de ácidos nucleicos, em que o primeiro "primer" diagnóstico tem um nucleótido terminal complementar ao nucleótido normal que corresponde ao referido nucleótido variante suspeito e em que um segundo "primer" diagnóstico com 81

Claims

uma sequência substancialmente complementar a uma região diagnóstica de uma segunda sequência de ácidos nucleicos, ou em que o segundo ”primern diagnóstico tem um nucleótido terminal complementar ao nucleótido normal que corresponde ao referido nucleótido variante suspeito; estando o referido nucleótido terminal do primeiro "pritser" diagnóstico e o referido nucleótido terminal do segundo "primer” diagnóstico, ambos na posição 5* ou ambos na posição 3' (extremos) dos respectivos "primers" e em que a primeira sequência de ácidos nucleicos tem uma orientação oposta à da segunda sequência de ácidos nucleicos. - 4.6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se amplificar, em primeiro lugar, pelo menos uma parte da amostra constituída pelo ácido nucleico que contóm o nucleótido variante a detectar (suspeito) e se utilizar 0 produto de amplificação assim obtido como amostra a tratar. _ 5 a _ Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se amplificar, em primeiro lugar, pelo menos uma parte da amostra oonstituida pelo ácido nucleico que contém 0 nucleótido variante suspeito, e se utilizar 0 produto de amplificação assim obtido como amostra a tratar. - 6® - Processo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por se repetir 0 tratamento da amostra de ácido nucleico,pelo menos uma vez,obtendo-se a amplificação linear de um produto de extensão utilizando a mesma se- 82 - quência de bases em análise como templato - 7» - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores,caracterizado por o nuoleótido terminal do "primer" diagnóstico que é complementar ou ao nucledtido variante suspeito ou ao nuoleótido normal correspondente, se encontrar no extremo 3' do "primer" diagnóstico - 8β - Processo de acordo gobi a reivindicação 6, caracterizado por se tratar a amostra com 1, 2 ou 3 tri-fosfatos de nucleósido sendo o grau de extensão de produtos de extensão a obter aquele que a presença desses 1, 2 ou 3 trifosfatos de nucledsiâo permite. - 9â - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se tratar a amostra com três trifosfatos de nucleósido.
A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado no Peino Unido em 10 de Março de 1988 e em 15 de Junho de 1988, sob os nss. 8805692 e 8814170.0, respectivamente. lisboa, 10 de Março de 1989

83

RESUMO "PROCESSO PARA A DESEGÇlQ DE SEQUEECIAS Dl IUCIiE$IIDOS» A invenção refere-se a una processo para a detecção da presença ou da ausência de pelo menos um nucleótido variante em um ou mais ácidos nucleicos numa amostra, que compreende tratar-se a amostra, em conjunto ou sequencialmente oom trifoifatos de nucleósidos apropriados com um agente para a polimerização dos trifosfatos de nueleósido e com um marcador ("primer") diagnóstico para uma região diagnóstica de uma àetermada sequência de bases nas condiçSes de hibri-dação, em que a sequência de nucleótidos do referido "primer" diagnóstico é substancialmente complementar à referida região diagnóstica, em que a nucleótido terminal do "primer" diagnóstico é complementar au ao nucleótido variante a detectar ou ao nucleótido normal correspondente sintetizando-se um produto de extensão do "primer" diagnóstico quando o referido nucleótido terminal do "primer" diagnóstico for complementar ao nucleótido correspondente na sequência de bases a analisar e não se sintetizando qualquer produto de extensão quando o referido nucleótido terminal do "primer" diagnóstico não for complementar ao nucleótido correspondente na sequência de bases a analisar, e se detectar a presença ou a ausência do nucleótido variante suspeito pela presença ou pela ausência de um produto de extensão.

Fig. 1(c) N- Μ- N- Μ- N- M- — ( ) ( ) — DG PCR C N D

Fig.2(a) /_n B'-----N-51

37 5/-N-----3' OR

5' 5 3'· 3' Fig.2(b) M_ M-5' M_ 5'-M------3'

3'·

/

-5' 3' © © ® 5;_N_N_N 3'---N-^5' 3'—N-^5' 3<—N-gj-S'
3' N -fN—, 5' 3' N_25_n___ 5' 3' 5' 30 N_ N—5^' -—5' 3' 3'- 3'- r Fig.5(a) N N N N N —3' N N N

Fig.5(b) N- Μ- N MN M

PCR -N — DG 5— N — DG 3/-N —5 1 — — — — — — II II — ( ) ~ ( ] II — — — ( ) ( ) — PCR DG , DG 3L DG N 5 —N -N 5y—N B7— N -5'li