CN111044724B - 一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法，该试剂盒包含试剂A、试剂B和胸苷激酶1(TK1)校准品，其中试剂A为包被有抗胸苷激酶1(TK1)抗体的磁微粒混悬液，试剂B为碱性磷酸酶标记的抗胸苷激酶1(TK1)抗体酶结合物试剂。与现有技术相比，本发明提供了一种测定胸苷激酶1(TK1)含量的方法，利用本发明提供的试剂盒，根据双抗体夹心法的原理可以准确、灵敏、快速地测定样本中胸苷激酶1(TK1)的含量。
Description
技术领域
本发明涉及生物试剂，具体涉及检测试剂盒，尤其涉及一种灵敏度高、特异性强的测定人体血清胸苷激酶1含量的试剂盒及其制备方法。
背景技术
胸苷激酶1(Thymidine Kinase 1，TK1)胸苷激酶(TK1)是DNA合成中的关键酶之一，在镁离子和ATP的参与的条件下，可催化胸腺嘧啶核苷(TdR)转化为脱氧胸苷一磷酸(TMP)，进而形成的胸苷三磷酸(TTP，DNA合成中的四种必须脱氧核苷酸之一)从而参与DNA合成。TK1水平的升高和DNA的合成成正相关，在细胞周期中，TK1在G1期晚期开始升高，于S期达到最高，至G2期开始下降，由于TK1与细胞周期S期的特殊相关性，又被称为“S期关键酶”，是通过补救途径在S期合成DNA的关键酶。
TK1通常有两种形式，其TK1全酶是分子量约为12KDa的四聚体，同时也有二聚体形式。通常四聚体的催化效率更高，约为二聚体的22倍。在ATP存在的情况下，TK1更倾向于形成四聚体，去除ATP则回复二聚体的形式，该过程可逆。TK1在组织或细胞萃取液中并不稳定，但是血清中较为稳定，-20℃条件下保存期较长。
在临床研究中，TK1浓度和活性的显著相关性仅存在于健康人、良性肿瘤患者和部分恶性肿瘤患者中(如白血病、乳腺癌、胃癌)。通常90-95％的恶性肿瘤患者TK1的浓度会高于正常人，但是相对应的TK1活性却只有该增幅的75％。因此在恶性实体肿瘤的检测中用TK1浓度作为肿瘤标志物可能比检测TK1活性灵敏度更高，而在乳腺癌、***癌的早期发展中检测TK1蛋白浓度也比检测TK1活性更有效。与此同时，TK1还和一些实体肿瘤(如肺癌、胃癌)的诊断和治疗结果相关。总的来说，实体瘤患者TK1蛋白水平也会有明显的升高，并且在实体瘤病例中测定TK1浓度甚至可能比测定TK1活性有更好的灵敏度。
通常正常人的TK1水平平均值在1pM左右，具体值取决于个体差异，但是总的来说处于0-2pM之间。对于异常增殖类病变，由于病变细胞缺失了凋亡调控，DNA合成剧增会导致TK1水平的异常升高，即存在恶性增殖病变患者血清内TK1酶含量会比正常人有2-200倍的升高。因此TK1目前也被作为一种非特异性肿瘤标志物，应用于体检及临床中的恶性增殖病变筛查和治疗后的跟踪监测。
目前，测定TK1的方法主要是酶联免疫法(ELISA)。该方法通常依靠手工操作，比较耗费人力和时间，同时其检测的灵敏度和线性范围也较低，主要用于实验室分析，在临床的检测应用上具有一定的局限性，远不能满足临床需求。目前市场上仍缺乏速度快、稳定性好、灵敏度高、特异性强的TK1测定试剂，尤其是自动化检测试剂。因此，研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动化学发光分析仪的TK1测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法，可以实现在全自动化学发光分析仪上对TK1的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低TK1检测成本，有利于临床推广使用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含试剂A、试剂B和胸苷激酶1(TK1)校准品，其中试剂A为包被有抗胸苷激酶1(TK1)抗体的磁微粒混悬液，试剂B为碱性磷酸酶标记的抗胸苷激酶1(TK1)抗体酶结合物试剂。
进一步地，所述的试剂A是由0.05-0.2mol/L的缓冲液、0.1％-0.5％防腐剂、1％-10％表面活性剂、0.01％-0.08％包被有TK1抗体的磁微粒配制而成。
进一步地，所述的磁微粒为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，在所述磁微粒表面含有一种或多种活性功能基团。
进一步地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液的pH值为6～9；
进一步地，所述防腐剂选自叠氮化钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin 300中的一种或多种；
进一步地，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物或聚乙二醇辛基苯基醚；
进一步地，所述包被有TK1抗体的磁微粒为选择不同粒径和表面活性功能基团的磁微粒与TK1抗体形成的复合物，所述磁微粒表面的活性功能基团选自对甲苯磺酰基或羧基，所述的磁微粒的粒径为0.1-5μm。
进一步地，所述的试剂B是由0.05-0.2mol/L的缓冲液、0.1％-0.5％防腐剂、1％-10％表面活性剂、1％-10％保护蛋白、0.1-1.0μg/ml碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物配制而成。
进一步地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6～9；
进一步地，所述防腐剂选自叠氮化钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin 300中的一种或多种；
进一步地，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、十二烷基磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚；
进一步地，所述保护蛋白选自酪蛋白酸钠或牛血清白蛋白；
进一步地，所述碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物为碱性磷酸酶和TK1抗体形成的复合物。
进一步地，所述试剂A和试剂B中的TK1抗体为两种结合位点不同的单克隆抗体；两种TK1抗体选自兔抗多克隆抗体、羊抗多克隆抗体或鼠抗单克隆抗体。
进一步地，所述试剂A和试剂B的体积比为1:5。
本发明试剂盒所述TK1校准品包含校准品1、校准品2、校准品3、校准品4、校准品5和校准品6。其中校准品1是指将TK1用牛血清制品得到校准品；校准品2是指将TK1用牛血清制品稀释成浓度为1pmol/ml得到校准品；校准品3是指将TK1用牛血清制品稀释成浓度为2pmol/ml得到校准品；校准品4是指将TK1用牛血清制品稀释成浓度为5pmol/ml得到校准品；校准品5是指将TK1用牛血清制品稀释成浓度为10pmol/ml得到校准品；校准品6是指将TK1用牛血清制品稀释成浓度为50pmol/ml得到校准品。
本发明的原理为：本发明使用试剂A中的包被有TK1抗体的磁微粒，与样品中的TK1进行反应并形成TK1-TK1抗体包被的磁微粒复合物，同时试剂B中碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物也会与TK1-TK1抗体包被的磁微粒反应，形成TK1抗体包被的磁微粒-TK1-碱性磷酸酶标记的TK1抗体复合物。孵育反应之后，利用全自动化学发光分析仪中的相应磁力设备，在保留TK1抗体包被的磁微粒-TK1-碱性磷酸酶标记的TK1抗体复合物的同时洗去剩余的反应液和样本后，加入发光底物，测定产生的化学发光信号，样本中的TK1浓度和化学发光信号成正比。对比TK1浓度和化学发光强度的工作曲线，可获得样品中TK1浓度。
本发明的另一目的是提供了上述胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)试剂A的制备：
在水中依次加入缓冲盐、表面活性剂、防腐剂，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH值至6.0～9.0，然后过0.22μm滤膜得到试剂A稀释液，之后加入包被有TK1抗体的磁微粒得到试剂A；
(2)试剂B的制备：
在水中依次加入缓冲盐、表面活性剂、保护蛋白、防腐剂，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH值至6.0～9.0，然后过0.22μm滤膜得到试剂B稀释液，之后加入碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物得到试剂B；
(3)组成试剂盒：将上述制备的试剂A和试剂B按体积比R1：R2＝1:5分装入瓶组成试剂盒。
其中，步骤(1)包被有TK1抗体的磁微粒是用于结合样品中的TK1的抗体-磁微粒结合物，通过相应抗体和磁微粒反应制备，具体为：
(一)当磁微粒表面的活性功能基团为对甲苯磺酰基时，制备步骤如下：
ⅰ.磁微粒和抗体的反应：在50mmol/L的硼酸缓冲液中，TK1抗体与磁微粒按质量比1:100混合，20-25℃下反应16-24小时，形成抗体-磁微粒结合物；
ⅱ.抗体-磁微粒结合物的封闭：用50mmol/L的Tris缓冲液清洗抗体-磁微粒结合物，之后将磁微粒加入含有10g/L牛血清白蛋白(BSA)的50mmol/L的Tris缓冲液中，20-25℃下反应16-24小时，对抗体-磁微粒结合物进行封闭；
ⅲ.抗体-磁微粒结合物的保存：用50mmol/L的Tris缓冲液清洗抗体-磁微粒结合物，之后将磁微粒加入含有10g/L牛血清白蛋白(BSA)的50mmol/L的Tris缓冲液中保存备用；
(二)当磁微粒表面的活性功能基团为羧基时，制备步骤如下：
Ⅰ.磁微粒和抗体的反应：在50mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，将TK1抗体与磁微粒按质量比1:100，再加入EDC·HCl，20-25℃下反应2小时，形成抗体-磁微粒结合物；
Ⅱ.抗体-磁微粒结合物的封闭：用50mmol/L的Tris缓冲液清洗抗体-磁微粒结合物，之后将磁微粒加入含有10g/L牛血清白蛋白(BSA)的50mmol/L的Tris缓冲液中，20-25℃下反应16-24小时，对抗体-磁微粒结合物进行封闭；
Ⅲ.抗体-磁微粒结合物的保存：用50mmol/L的Tris缓冲液清洗抗体-磁微粒结合物，之后将磁微粒加入含有10g/L牛血清白蛋白(BSA)的50mmol/L的Tris缓冲液中保存备用；
步骤(2)碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物是用于结合样品中的TK1的抗体-碱性磷酸酶结合物，通过相应抗体和碱性磷酸酶反应制备，具体为：
(a)碱性磷酸酶的活化：在碱性磷酸酶中加入高碘酸钠，混合均匀后2-8℃活化30min；
(b)碱性磷酸酶的活化终止：向步骤(a)中的碱性磷酸酶活化液中加入乙二醇，混合均匀后2-8℃放置2小时以终止活化反应；
(c)TK1抗体和碱性磷酸酶的偶联：将所用TK1抗体和步骤(b)中活化的碱性磷酸酶混合，混合均匀后2-8℃放置20min进行偶联；
(d)TK1抗体和碱性磷酸酶的偶联终止：向步骤(c)中的碱性磷酸酶和TK1抗体的结合液中加入硼氢化钠，混合均匀后2-8℃放置2小时以终止偶联反应；
(e)碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物的洗涤：将结合有TK1抗体的碱性磷酸酶的反应液转移至透析袋，并浸泡于洗涤液中，除去小分子杂质；所述洗涤液为50～100mM缓冲液，pH8.5～9.5，得到洗涤后的碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物；
(f)碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物的保存：向步骤(e)中得到的经过洗涤的碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物溶液中加入甘油，并于-20℃保存备用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明试剂盒中包含两种分别使用碱性磷酸酶标记的TK1抗体，以及用磁微粒包被的TK1抗体，采用双抗体夹心法，可准确、灵敏、快速地测定样本中TK1的浓度。
(2)本发明试剂盒的采用更为先进的化学发光免疫分析法，特异性和灵敏度得到了很大的提升，更好地服务于临床诊断。
(3)本发明试剂盒可借助于全自动化学发光免疫分析仪运行，所有的样本和试剂加样都由仪器运行完成，降低人为因素对试验结果的干扰。同时也大幅度缩短了测试时间，得以更高效、快速的提供临床诊断结果。
(4)本发明试剂盒测定样本时，不需要对待测样本进行稀释，可直接进行检测，减少稀释操作带来的误差，也有利于低值样本的检测灵敏度。其中待测样本可为空白管、EDTA血浆管、肝素血浆、促凝剂血清管和分离胶血清管中的任意一种。
附图说明
图1为实施例6制备的试剂在运涛Lumiart-II-1化学发光测定仪上的校准曲线，X轴为TK1浓度，Y轴为发光值(RLU)。
图2为实施例6制备的试剂与经华瑞同康试剂检测的样本比对相关性结果。
图3为实施例7制备的试剂在运涛Lumiart-II-1化学发光测定仪上的校准曲线，X轴为TK1浓度，Y轴为发光值(RLU)。
图4为实施例7制备的试剂与经华瑞同康试剂检测的样本比对相关性结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例使用原料通过市售得到。对甲苯磺酰基磁微粒和羧基磁微粒购自赛默飞世尔科技有限公司或捷时雅(上海)商贸有限公司。
实施例1
兔抗TK1多克隆抗体包被对甲苯磺酰基磁微粒
包被有兔抗TK1多克隆抗体的磁微粒，为对甲苯磺酰基磁微粒与兔抗TK1多克隆抗体的氨基连接而成，该复合物的具体合成步骤如下：
(1)称取3.1g硼酸，溶解于1L去离子水中，调节pH至9.6，制成缓冲溶液A；
(2)称取7.9gTris-HCl，溶解于1L去离子水中，调节pH至7.6，制成缓冲溶液B；
(3)称取10g牛血清白蛋白(BSA)，溶解于1L上述缓冲溶液B中，制成缓冲溶液C；
(4)在100ml缓冲溶液A中加入1g对甲苯磺酰基磁微粒和10mg兔抗TK1多克隆抗体，然后将此混合溶液在室温(20-25℃)下反应16-24小时，反应时将容器置于滚轴机上滚动混匀；
(5)将步骤(4)中的反应液容器放置于磁铁上，利用磁力将磁珠沉淀完全后，弃去上清液，再加入200ml缓冲液B搅拌清洗，之后再容器放置于磁铁上，待磁珠沉淀完全后，弃去上清液，重复此步骤4次；
(6)向步骤(5)中的磁微粒容器中加入200ml缓冲溶液C，然后将此混合溶液在室温(20-25℃)下16-24小时进行封闭，反应时将容器置于滚轴机上滚动混匀；
(7)将步骤(6)中的反应液容器放置于磁铁上，利用磁力将磁珠沉淀完全后，弃去上清液，再加入200ml缓冲溶液B搅拌清洗，之后再容器放置于磁铁上，待磁珠沉淀完全后，弃去上清液，重复此步骤4次，最后加入100ml缓冲溶液C，得到包被有兔抗TK1多克隆抗体的磁微粒，保存于4℃备用。
实施例2
鼠抗TK1单克隆抗体包被羧基磁微粒
包被有鼠抗TK1单克隆抗体的磁微粒，为羧基磁微粒与鼠抗TK1单克隆抗体的氨基连接而成，该复合物的具体合成步骤如下：
(1)称取9.7g 2-(N-***啉)乙磺酸，溶解于1L去离子水中，调节pH至5.5，制成缓冲溶液A；
(2)称取7.9gTris-HCl，溶解于1L去离子水中，调节pH至7.6，制成缓冲溶液B；
(3)称取10g牛血清白蛋白(BSA)，溶解于1L上述缓冲溶液B中，制成缓冲溶液C；
(4)在100ml缓冲溶液A中加入1g羧基磁微粒和10mg鼠抗TK1单克隆抗体，再加入0.5g EDC·HCl，然后将此混合溶液在室温(20-25℃)下反应2小时，反应时将容器置于滚轴机上滚动混匀；
(5)将步骤(4)中的反应液容器放置于磁铁上，利用磁力将磁珠沉淀完全后，弃去上清液，再加入200ml缓冲液B搅拌清洗，之后再容器放置于磁铁上，待磁珠沉淀完全后，弃去上清液，重复此步骤4次；
(6)向步骤(5)中的磁微粒容器中加入200ml缓冲溶液C，然后将此混合溶液在室温(20-25℃)下16-24小时进行封闭，反应时将容器置于滚轴机上滚动混匀；
(7)将步骤(6)中的反应液容器放置于磁铁上，利用磁力将磁珠沉淀完全后，弃去上清液，再加入200ml缓冲溶液B搅拌清洗，之后再容器放置于磁铁上，待磁珠沉淀完全后，弃去上清液，重复此步骤4次，最后加入100ml缓冲溶液C，得到包被有鼠抗TK1单克隆抗体的磁微粒，保存于4℃备用。
实施例3
碱性磷酸酶标记的羊抗TK1多克隆抗体酶结合物的制备
碱性磷酸酶标记的羊抗TK1多克隆抗体酶结合物，为碱性磷酸酶与TK1抗体连接而成，该复合物的具体合成步骤如下：
(1)称取2.9g碳酸氢钠、1.5g碳酸钠，溶解于1L去离子水中，调节pH至9.5，制成缓冲溶液A；
(2)取100mg碱性磷酸酶溶解于5ml去离子水中并混匀，再向其中加入100mg高碘酸钠，震荡混匀至完全溶解，在2-8℃条件下活化反应30min；
(3)向步骤(2)中的碱性磷酸酶活化液中加入0.36ml乙二醇，混合均匀后于2-8℃放置2小时以终止活化反应；
(4)向步骤(3)中的碱性磷酸酶反应液中加入100mg羊抗TK1多克隆抗体，混合均匀后于2-8℃放置20min进行偶联反应；
(5)向步骤(4)中的碱性磷酸酶和羊抗TK1多克隆抗体抗体的反应液中加入10.4mg硼氢化钠，混合均匀后于2-8℃放置2小时以终止偶联反应；
(6)将步骤(5)得到的结合有羊抗TK1多克隆抗体的碱性磷酸酶的反应液转移至透析袋，并将透析袋浸泡于缓冲溶液A中，于2-8℃放置4小时以除去小分子杂质，得到洗涤后的碱性磷酸酶标记的羊抗TK1多克隆抗体酶结合物；
(7)向步骤(6)中得到的经过洗涤的碱性磷酸酶标记的羊抗TK1多克隆抗体酶结合物溶液中加入5ml甘油，并于-20℃保存备用。
实施例4
本发明测定人体TK1含量的试剂盒制备
试剂1的制备：取995g水，然后依次加入2.4g磷酸二氢钠、11.4g磷酸氢二钠、9.0gNaCl、10g吐温20、0.2g Proclin 300，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH至7.4；用0.22μm滤膜过滤，制成1L的试剂1稀释液。再加入0.2g包被有兔抗TK1多克隆抗体的磁微粒(实施例1制得)，混匀后制成1L的试剂1。
试剂2的制备：取995g水，然后依次加入2.4g磷酸二氢钠、11.4g磷酸氢二钠、9.0gNaCl、21.6g聚乙二醇辛基苯基醚、50g牛血清白蛋白(BSA)、0.2g Proclin 300，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH至7.6；用0.22μm滤膜过滤，制成1L的试剂2稀释液。再加入0.2mg羊抗TK1多克隆抗体(实施例3制得)，混匀后制成1L的试剂2。
校准品的制备：取1L水，然后依次加入缓冲剂、氯化钠、乙二胺四乙酸钠(EDTA)、无菌婴牛血清、胸苷激酶1、叠氮钠，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH值至7.0～8.0，优选7.4，然后过0.22μm滤膜得到校准品溶液。使用市售的华瑞同康试剂盒对校准品进行赋值。
组成试剂盒：将上述制备的试剂1、试剂2按体积比1:5分装入瓶组成试剂盒，试剂盒的包装规格为：R1(3ml/每瓶)，R2(15ml/每瓶)。
实施例5
本发明测定人体TK1含量的试剂盒制备
试剂1的制备：取995g水，8g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、9.0gNaCl、15g吐温80、10g环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、0.2g Proclin 300，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH至7.6；用0.22μm滤膜过滤，制成1L的试剂1稀释液。再加入0.65g鼠抗TK1单克隆抗体包被羧基磁微粒(实施例2制得)，混匀后制成1L的试剂1。
试剂2的制备：取995g水，然后依次加入2.4g磷酸二氢钠、11.4g磷酸氢二钠、9.0gNaCl、15g聚乙二醇辛基苯基醚、15g吐温20、50g牛血清白蛋白(BSA)、20g酪蛋白酸钠、0.2g Proclin 300，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH至7.6；用0.22μm滤膜过滤，制成1L的试剂2稀释液。再加入0.2mg羊抗TK1多克隆抗体(实施例3制得)，混匀后制成1L的试剂2。
校准品的制备：取1L水，然后依次加入缓冲剂、氯化钠、乙二胺四乙酸钠(EDTA)、无菌婴牛血清、胸苷激酶1、叠氮钠，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH值至7.0～8.0，优选7.4，然后过0.22μm滤膜得到校准品溶液。使用市售的华瑞同康试剂盒对校准品进行赋值。
组成试剂盒：将上述制备的试剂1、试剂2按体积比1:5分装入瓶组成试剂盒，试剂盒的包装规格为：R1(3ml/每瓶)，R2(15ml/每瓶)。
实施例6
本发明测定TK1的试剂盒(实施例4制得)的相关性分析
按照实施例4制备得到测定TK1的试剂盒，对6例校准品和50例血清样本，与华瑞同康的TK1检测试剂盒的临床检测结果进行比对。
实验方法：试验仪器自动吸取试剂1 30ul，试剂2 150ul，50ul样本加入反应管，于37℃孵育20min后，清洗并加入碱性磷酸酶底物，之后仪器自动检测得到反应管中反应液的相对发光单位(RLU)。
根据RLU与校准品的浓度做出校准曲线，并依照该曲线，根据样本检测后得到的发光RLU计算样本中TK1的浓度。
线性范围：0.2-50pmol/ml
试验仪器：运涛Lumiart-II-1化学发光测定仪。
本实施例试剂与华瑞同康试剂分别定标之后，本实施例的试剂定标曲线如图1，检测50例不同浓度的临床样本，检测结果如表1所示：
表1
根据上面测定结果，本试剂与华瑞同康TK1测定试剂盒的临床相关性良好，没有显著差异。
实施例7
本发明测定TK1的试剂盒(实施例5制得)的相关性分析
按照实施例5制备得到测定TK1的试剂盒，对6例校准品和50例血清样本，与华瑞同康的TK1检测试剂盒的临床检测结果进行比对。
实验方法：试验仪器自动吸取试剂1 40ul，试剂2 150ul，50ul样本加入反应管，于37℃孵育20min后，清洗并加入碱性磷酸酶底物，之后仪器自动检测得到反应管中反应液的相对发光单位(RLU)。
根据RLU与校准品的浓度做出校准曲线，并依照该曲线，根据样本检测后得到的发光RLU计算样本中TK1的浓度。
线性范围：0.2-50pmol/ml
试验仪器：运涛Lumiart-II-1化学发光测定仪。
本实施例试剂与华瑞同康试剂分别定标之后，本实施例的试剂定标曲线如图3，检测50例不同浓度的临床样本，检测结果如表2所示：
表2
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需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的范围，凡是利用本发明说明内容及附图内容所做的直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含试剂A、试剂B和胸苷激酶1(TK1)校准品，其中试剂A为包被有抗胸苷激酶1(TK1)抗体的磁微粒混悬液，试剂B为碱性磷酸酶标记的抗胸苷激酶1(TK1)抗体酶结合物试剂；
所述的试剂A是由0.05-0.2mol/L的缓冲液、0.1％-0.5％防腐剂、1％-10％表面活性剂、0.01％-0.08％包被有TK1抗体的磁微粒配制而成；所述包被有TK1抗体的磁微粒为选择不同粒径和表面活性功能基团的磁微粒与TK1抗体形成的复合物，所述磁微粒表面的活性功能基团选自对甲苯磺酰基或羧基，所述的磁微粒的粒径为0.1-5μm；
所述的试剂B是由0.05-0.2mol/L的缓冲液、0.1％-0.5％防腐剂、1％-10％表面活性剂、1％-10％保护蛋白、0.1-1.0μg/ml碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物配制而成，所述保护蛋白选自酪蛋白酸钠或牛血清白蛋白；所述碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物为碱性磷酸酶和TK1抗体形成的复合物。
2.根据权利要求1所述的一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，在所述磁微粒表面含有一种或多种活性功能基团。
3.根据权利要求1或2所述的一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，试剂A中：
所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液的pH值为6～9；
所述防腐剂选自叠氮化钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin 300中的一种或多种；
所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物或聚乙二醇辛基苯基醚。
4.根据权利要求1所述的一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，试剂B中：
所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6～9；
所述防腐剂选自叠氮化钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin 300中的一种或多种；
所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、十二烷基磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚。
5.根据权利要求1所述的一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述试剂A和试剂B中的TK1抗体为两种结合位点不同的单克隆抗体；两种TK1抗体选自兔抗多克隆抗体、羊抗多克隆抗体或鼠抗单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述试剂A和试剂B的体积比为1:5。
7.一种如权利要求1所述的胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)试剂A的制备：
在水中依次加入缓冲盐、表面活性剂、防腐剂，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH值至6.0～9.0，然后过0.22μm滤膜得到试剂A稀释液，之后加入包被有TK1抗体的磁微粒得到试剂A；
(2)试剂B的制备：
在水中依次加入缓冲盐、表面活性剂、保护蛋白、防腐剂，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH值至6.0～9.0，然后过0.22μm滤膜得到试剂B稀释液，之后加入碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物得到试剂B；
(3)组成试剂盒：将上述制备的试剂A和试剂B按体积比R1：R2＝1:5分装入瓶组成试剂盒。
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