CN108051439A - 一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单试剂肝素结合蛋白（HBP‑Heparin Binding Protein）检测试剂盒及制备方法，该试剂盒为单试剂检测试剂盒。该单试剂检测试剂盒的主要成分是反应液以及含有HBP的校准品和质控品，反应液包括HBP抗体标记的胶乳颗粒，同时还包括缓冲溶液、表面活性剂、盐、稳定剂、助悬剂以及防腐剂。本发明还公开了使用该试剂盒检测血样中肝素结合蛋白（HBP）的浓度的方法。本发明采用单试剂，操作简单，灵敏度高，线性范围广，可以广泛应用于各种透射或者散射分析仪，包括通用生化分析仪、特定蛋白分析仪等。

Description

一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于医学免疫诊断试剂领域，特别涉及一种肝素结合蛋白的检测试剂及制备方法。

背景技术

肝素结合蛋白（Heparin Binding Protein -简称HBP）是一种中性粒细胞分泌的颗粒蛋白，具有杀菌作用，同时也参与炎症反应和凝血过程的调节。1984年，Shafer等人首次发现并分离出这种蛋白，根据其正电性的特征和杀菌的功能命名为CAP37（CationicAntimicrobial Protein, 分子量37k）。后来又陆续有人从多形核白细胞中的嗜苯胺蓝颗粒中分离出天青杀素（Azurocidin），以及与肝素有很强结合能力的肝素结合蛋白（HBP -Heparin Binding Protein）。进一步的蛋白质结构和基因测序的研究表明，这三种蛋白实际上是同一种蛋白，在本发明中统一用肝素结合蛋白来代表。肝素结合蛋白是一种多功能的蛋白，可以通过结合血管上皮细胞，改变血管通透性，诱导血浆渗漏和炎症反应。肝素结合蛋白还能够趋化和激活单核白细胞和巨噬细胞，应对细菌感染，参与调节免疫反应。最近的一些研究工作表明，血浆中的肝素结合蛋白的浓度与脓毒症以及脓毒症休克有很强的相关性。脓毒症是全身性的感染炎症反应， 会引起体温改变、心率加快、呼吸急促等症状， 导致全身凝血功能紊乱和免疫炎症反应失衡， 诱发器官功能衰竭，严重时会发生脓毒症休克甚至死亡。 医学界对脓毒症的病原机理还不是十分清楚，及早地预测脓毒症的发生能有效地防止脓毒症引起的器官衰竭以及死亡。 Linder等人（Adam Linder et al, CriticalCare Medicine, 2015, 43:2378-2386）的研究表明作为参与炎症反应的肝素结合蛋白，能够有效地预测脓毒症以及脓毒症休克的发生，是一个很好的临床诊断指标。

肝素结合蛋白（HBP）已经被国家药监局批准的检测方法是酶联免疫分析法（ELISA），其代表产品是英国Axis-Shield公司的酶联免疫试剂盒（国械注进20162400300）。酶联免疫分析法是在96孔板上包覆捕捉抗体，当含有抗原的样品在孔中培养时，包覆在孔内的抗体通过抗体抗原反应捕捉样品中的抗原，然后用酶标记的抗体与抗原结合，形成抗体-抗原-抗体的三明治结构。标记好的的酶可以与相应的底物定量地发生反应，产生颜色变化。通过测量特定波长下的吸光度变化，可以定量检出样品中的抗原浓度。酶联免疫分析法可以准确地检测样品中的肝素结合蛋白浓度， 但是实际操作中ELISA实验耗时比较长，需要孵育、清洗、移液等多项手工操作，过程比较复杂，一般需要3到5小时才能得到检测结果，不能够很好地满足门诊或者急诊的快速检测的需求。其他报道的检测方法还有CN204882574U公开的胶体金法和CN204882575U公开的免疫荧光层析的方法。胶体金法和免疫荧光层析法虽然可以快速检测，但是只能进行定性或者半定量的检测，准确度低，无法提供精确的临床判断依据。同时受限于方法本身，检测的精密度差，使得测试的重复性和一致性不能得到保障。最近在专利CN107167589A中公开了用胶乳增强免疫比浊法来检测HBP的方法，胶乳增强免疫比浊法可以快速定量测量血液中的HBP，是对现有检测方法的一个很好补充。但是，CN107167589A公开的方法中采用的是测量透射吸光度的检测方法，检测试剂是包括了稀释液R1和反应液R2的双试剂，在测量前需要进行混合，导致该发明只适合在全自动的生化分析仪上使用，不适合门诊快速检测的要求。同时该专利在抗体标记胶乳方法的多样性、抗体选择、样本条件、样本比对相关性等方面都存在一定缺陷。在检测试剂的具体组成成分的选择上也存在问题，例如使用多聚乙醇可能会产生非特异性反应即假阳性。诸多问题使得通过该发明得到检测试剂在灵敏度、特异性、线性范围等方面都不理想，试剂的准确性也无法和现有上市试剂做到很好的相关性。

发明内容

为了解决上述现有各种方法的不足， 本发明的目的是提供一种操作简单、能够快速检测血液样本中的肝素结合蛋白（HBP）浓度的单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒。该试剂盒为单一检测试剂，可以在通用全自动生化分析仪和半自动或全自动特定蛋白分析仪等POCT测定散射光强度变化的设备上进行测试。

在背景技术的介绍中提到，CN107167589A采用的是双试剂的检测形式。其中稀释液常被称为R1,胶乳溶液常被称为R2。纯粹的抗体或者抗原包被的微球的胶乳溶液是热力学不稳定体系，如果没有特殊的处理，胶乳会自发地凝集。因此，一般地，检测试剂中的胶乳溶液（R2）需要通过优化溶液的组成来保证胶乳溶液的稳定，阻止胶乳在储存时发生自发凝集。常见的优化手段包括选用不同的缓冲体系、改变微球表面电荷、改变溶液离子强度、添加稳定剂等手段（J.A.Molina Bolivaretal,Journal of Macromolecular Science PartC-Polymer Reviews,2005,45:59-98）。然而当胶乳溶液用于测试时，由抗原抗体的特异性结合导致的胶乳凝集就不应该被阻止，这就要求稀释液（R1）能够在一定程度上有益于胶乳凝集的形成。所以一般稀释液（R1）和胶乳储存液（R2）在配方上有很大的区别。直接将R1和R2混合，一般会导致胶乳不稳定。这也是市场上胶乳试剂一般都采用双试剂形式的主要原因。

在本发明中，除了常规的稳定胶乳试剂的方法以外，我们还引入了表面活性剂来优化试剂配方稳定胶乳溶液。表面活性剂可以提供空间位阻，离子型的表面活性剂还可以提供额外的静电斥力，从而阻止胶乳的凝聚，在储存时稳定胶乳试剂。 同时，通过优化试剂配方，当含有HBP的样本接触胶乳试剂时，合适的表面活性剂能够促进HBP抗原和HBP抗体的相互作用，有利于形成特异性的胶乳凝集。这样我们就制备了一种单试剂形式的HBP胶乳试剂。在储存时，该试剂可以稳定存放，在接触样品时，该试剂可以迅速发生凝集反应，不再需要混合其他的稀释液来促进凝集反应。

本发明提供的一种技术方案是一种基于单试剂形式的肝素结合蛋白（HBP）检测试剂盒。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，该单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒包括反应液以及校准品和质控品，反应液包含HBP抗体标记的胶乳微粒。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，其使用的反应液是单试剂

本发明提供的试剂盒是利用吸附在直径几十到几百纳米的胶乳微粒上的HBP抗体捕捉测试样品中的肝素结合蛋白（HBP），改变了溶液的散射度或吸光度。通过测量溶液的散射度或吸光度的变化，根据定标曲线定量地计算出待测样品中肝素结合蛋白的浓度。该测试方法既可以在通用的大型自动生化分析仪上运用，也可以在半自动或全自动特定蛋白分析仪等小型的POCT（即时检测）设备上采用，有很强的适用性，可以很好地满足我国从大型三甲医院到社区基层医院的使用需求。和酶联免疫分析法相比，本方法具有操作简单、检测快速、测试结果重复性好、测量线性范围广等优点。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒， 其反应液包含HBP抗体标记的胶乳微粒，同时包含缓冲溶液、盐、稳定剂、助悬剂、防腐剂和表面活性剂，校准品和质控品包含肝素结合蛋白、缓冲溶液、盐、稳定剂、防腐剂和表面活性剂。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，HBP抗体标记的胶乳微粒为单抗（一对或者几对配对的HBP单抗）标记的胶乳微粒或多抗标记的胶乳微粒，或是一株HBP单抗标记的胶乳微粒与HBP多抗标记的胶乳微粒的混合物。本发明试剂盒反应液中使用到的抗体皆为HBP的抗体。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，HBP抗体标记的胶乳微粒中使用的胶乳微粒直径为100nm~400nm，微粒的表面修饰基团为-COOH、-NH2、-SH、-OH、- CHO 中的一种或物理吸附型胶乳微粒。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，HBP抗体标记的胶乳微粒的浓度为0.01%~1%。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，稳定剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶中的一种；盐为氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾中的一种、两种或两种以上的组合；表面活性剂为NP40、曲拉通X-100、吐温20、吐温40、吐温80、十二烷基硫酸钠（SDS）、司盘40、司盘60中的一种、两种或两种以上的组合；助悬剂为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇、乙二醇、丙三醇、乳糖中的一种、两种或两种以上的组合；防腐剂为叠氮化钠、硫柳汞、Proclin-300 中的一种。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，盐为氯化钠。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，对表面活性剂进行了优选，优选的表面活性剂为曲拉通X-100、NP40、吐温20中的一种，浓度为0.1%~1%。在该优化的组合和浓度下，表面活性剂具有降低血液样品与HBP抗体标记的胶乳微粒产生非特异性反应的效果。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，稳定剂为牛血清白蛋白，牛血清白蛋白浓度0.2%-2% ；助悬剂为浓度海藻糖，海藻糖浓度0.2%-5%；防腐剂为Proclin-300，防腐剂浓度为0.05%-2%；表面活性剂的浓度为0.1%~2%。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，缓冲液为甘氨酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液、3-(N-吗啉)-2-羟基丙磺酸（MOPSO）缓冲液、三羟基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）缓冲液、磷酸生理盐水（PBS）缓冲液和2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液的其中任一种，所述缓冲液浓度范围为10-200mmol/L。

本发明提供的试剂盒中还应包含肝素结合蛋白标准品和质控品，本发明的肝素结合蛋白的标准品为一系列低值浓度到高值浓度的HBP抗原溶液，浓度范围从0到240ng/mL,用于建立测试所需要的定标曲线。

根据本发明的一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法，该方法使用上述任意一种配方组成所述单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，其HBP抗体标记的胶乳微粒中标记抗体的方法为中间酯法、一步法、两步法和物理吸附法中的任意一种。

根据本发明的另一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法，该方法使用上述任意一种配方组成单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，本测试剂盒制备方法中 HBP抗体标记的胶乳微粒中标记抗体的方法为中间酯法、一步法、两步法和物理吸附法中的任意一种。

根据本发明的另一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法，中间酯法为使用碳化二亚胺类和琥珀酰亚胺酯催化剂活化胶乳微粒表面的羧基，形成表面带有琥珀酰亚胺酯中间体的胶乳微粒，再加入HBP抗体，HBP抗体表面的氨基与胶乳微粒表面的琥珀酰亚胺酯缩合，即完成HBP抗体标记过程。

根据本发明的另一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法，一步法为把HBP抗体先同胶乳微粒混合，HBP抗体吸附在胶乳微粒表面，然后加入碳化二亚胺类催化剂，HBP抗体表面的羧基或氨基与胶乳微粒表面的羧基或氨基缩合，完成HBP抗体标记过程。

根据本发明的另一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法，二步法为使用碳化二亚胺类催化剂活化胶乳微粒表面的羧基，然后加入HBP抗体，二者的氨基和羧基直接缩合，完成HBP抗体标记过程。

根据本发明的另一方面，提供了一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法，物理吸附法为使用不带任何表面活性基团的聚苯乙烯微粒，然后加入HBP抗体，HBP抗体吸附在聚苯乙烯微粒表面，完成HBP抗体标记过程。

根据本发明的还有一方面，提供了一种单试剂的检测肝素结合蛋白的方法，该方法采用透射比浊法或散射比浊法检测肝素结合蛋白，上述任一种单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，在自动生化分析仪和半自动或全自动特定蛋白分析仪等小型的POCT上通过测定散射光强度或吸光度变化的来测定待测样品中的HBP含量。

根据本发明的还有一方面，提供了一种采用单试剂的检测肝素结合蛋白的方法，所使用的检测样品是6小时以内提取的新鲜血清或者血浆样本。

检测样品时，本发明提供的试剂中胶乳微粒上的HBP抗体与样品中的HBP抗原发生抗体抗原反应，从而使得胶乳逐渐凝聚，改变了测试液的浊度。浊度的变化可以通过散射光或透射光强度变化来测定。 一般地，在大型自动生化分析仪上采用透射比浊的方法，其优点是自动化程度高。在半自动或全自动特定蛋白分析仪等POCT设备上采用散射比浊的方法，具有占用检测空间小、可实现门诊检测、检测速度更快、灵敏度高等优点。散射光强度或吸光度变化值与样品中的HBP浓度在一定浓度范围内成线性关系。 通过参考HBP标准品建立的定标曲线，可以定量地计算出被测样品中HBP的浓度。

本发明提供的单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，可以适应于各种透射或者散射分析仪，包括全自动生化分析仪、半自动或全自动特定蛋白分析仪等。

本发明的有益效果还包括：

1. 检测试剂的组成为单试剂，操作步骤少。本发明提供的试剂盒只有单试剂，无需稀释样本，不需要像市场上已有的进口ELISA试剂那样在测试时进行抗原稀释、多步清洗、加底物和终止液以及控制各步骤反应时间的操作，简化了测试程序，为操作人员带来极大的便利，同时也更好地保障了测试的精确性。

2. 检测快速，本发明方法在半自动或全自动特定蛋白分析仪等POCT上1-3分钟左右即可以完成检测，在全自动生化分析仪上5min左右即可完成检测。而现有的ELISA方法需要3到5小时完成检测。

3. 试剂量程宽，线性范围广，可以不用稀释直接测量浓度高达240ng/mL的样品,同时抗原浓度高达600ng/mL也不会出现钩状（Hook）效应。

4. 试剂适用性好。本发明所提供的单试剂检测试剂盒既可以通用全自动生化分析仪上使用，也可以在半自动或全自动特定蛋白分析仪等POCT上使用。可以同时满足大型医院检验科、小型医院门诊、以及急诊科室的检测需要。

附图说明

图1. 实施例1、2和3在POCT上的反应标准曲线

图2. 实施例4在全自动生化分析仪上的反应标准曲线

图3. 实施例1的线性范围

图4. 实施例4的线性范围

图5. 实施例3的钩状效应曲线

图6. 实施例10相关性分析

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

实施例1

1）单抗与多抗组合标记的胶乳试剂（300nm，反应液）的制备

中间酯法标记粒径为300nm的表面带羧基的聚苯乙烯胶乳微粒（分类号K030，厂家Merck Millipore）。将粒径为300nm表面带羧基的微粒在MES缓冲溶液中稀释至1%， 室温下搅拌。投入EDC和Sulfo-NHS固体粉末，搅拌2小时后10000RPM离心20分钟。 胶乳用MES缓冲溶液清洗两次后重悬，分成两份。一份加入HBP单克隆抗体， 搅拌反应2小时，另一份加入HBP多克隆抗体， 搅拌反应2小时。然后两份胶乳均在10000RPM离心20分钟，去掉上清液。两份沉淀的胶乳均在储存液中重悬并超声分散，分别搅拌1小时，再按下述比例混合HBP单抗标记的胶乳微粒和多抗标记的胶乳微粒。本例中反应液包括胶乳微粒、缓冲溶液、盐、稳定剂、助悬剂、防腐剂和表面活性剂，其中HBP抗体标记的胶乳微粒总浓度为0.03%，HBP单抗标记的胶乳微粒与多抗标记的胶乳微粒的质量比分别是2：8、3：7、4：6、5：5和4：6，缓冲溶液是50mM MES pH=6.5，稳定剂是0.5%牛血清白蛋白 ，防腐剂是 0.1%ProClin 300，助悬剂是3% 海藻糖，盐是2.7% 氯化钠，表面活性剂是0.2%曲拉通X-100。

2）标准品的制备

将市售的HBP抗原用标准品稀释液配制成一系列标准品，浓度分别为0ng/mL, 5ng/mL,20ng/mL, 50ng/mL, 100ng/mL, 240ng/mL，标准品稀释液的组成是50mM PBS pH7.4，0.1%Proclin 300，0.1%曲拉通X-100，1.8%氯化钠，1%牛血清白蛋白。

3）质控品的制备

将高浓度的HBP样品（80ng/mL）用标准品稀释液稀释成8ng/mL和40ng/mL，分别作为低值质控品和高值质控品。

4）在POCT上建立定标曲线

将6个HBP标准品，浓度从0到240ng/mL，放于生化仪（本例中使用劳拉电子半自动特定蛋白分析仪EZ-400）中样品盘内，分别与实施例1配制的反应液反应，样本：反应液＝10μl:200μl，检测波长为650nm，记录散射度变化值，整个过程耗时3分钟。根据HBP浓度和散射度变化值建立定标曲线。 图1是实施例1中反应液建立的定标曲线。

实施例2

1）一对单抗标记的胶乳试剂（200nm，反应液）的制备

中间酯法标记200nm表面带羧基的聚苯乙烯胶乳微粒（分类号H20021C，厂家Holmes）。将粒径为200nm的微粒在PBS缓冲溶液中稀释至1%， 室温下搅拌。投入EDC和Sulfo-NHS固体粉末，搅拌2小时后10000RPM离心20分钟。加入一对HBP单克隆抗体， 搅拌反应2小时。然后胶乳在10000RPM离心10分钟，去掉上清液。沉淀的胶乳在储存液中重悬并超声分散，搅拌1小时后备用。本例中反应液包括胶乳微粒、缓冲溶液、盐、稳定剂、助悬剂、防腐剂和表面活性剂，其中胶乳微粒浓度为0.04%，缓冲溶液是100mM PBS pH=7.4，稳定剂是2%牛血清白蛋白 ，防腐剂是 0.1%ProClin 300，助悬剂是 4%海藻糖，盐是1.8% 氯化钠，表面活性剂是0.3%吐温20。

2）在小型POCT上建立定标曲线

校准品、质控品的配制以及检测过程与实施例1相同，在半自动特定蛋白分析仪上建立定标曲线。 图1是实施例2中反应液建立的定标曲线。

实施例3

1）多抗标记的胶乳试剂（120nm，反应液）的制备

物理吸附法标记120nm的聚苯乙烯胶乳微粒（分类号PS19021，厂家Merck Millipore）。将粒径为120nm的微粒在PBS缓冲溶液中稀释至1%， 室温下搅拌。投入EDC和Sulfo-NHS固体粉末，搅拌2小时后10000RPM离心20分钟。加入HBP多克隆抗体， 搅拌反应2小时。然后胶乳在10000RPM离心10分钟，去掉上清液。沉淀的胶乳在储存液中重悬并超声分散，搅拌1小时后备用。本例中反应液包括胶乳微粒、缓冲溶液、盐、稳定剂、助悬剂和防腐剂，其中胶乳微粒浓度为0.05%，缓冲溶液是100mM Hepes pH=7.8，稳定剂是1%牛血清白蛋白 ，防腐剂是0.1%ProClin 300，助悬剂是 3%海藻糖，盐是2.0% 氯化钠，表面活性剂是0.5%NP-40。

2）在小型POCT上建立定标曲线

校准品、质控品的配制以及检测过程与实施例1相同，在半自动特定蛋白分析仪上建立定标曲线。 图1是实施例3中反应液建立的定标曲线。

实施例4

1）一对单抗标记的胶乳试剂（210nm，反应液）的制备

物理吸附法标记210nm的聚苯乙烯胶乳微粒（分类号PS02N，批号9936，厂家BangsLaboratories）。将粒径为210nm的微粒在PBS缓冲溶液中稀释至1%， 室温下搅拌。加入一对HBP单克隆抗体， 搅拌反应2小时。然后胶乳在10000RPM离心10分钟，去掉上清液。沉淀的胶乳在储存液中重悬并超声分散，搅拌1小时后备用。本例中反应液包括胶乳微粒、缓冲溶液、盐、稳定剂、助悬剂和防腐剂，其中胶乳微粒浓度为0.04%，缓冲溶液是100mM Tris pH=7.4，稳定剂是1.2%牛血清白蛋白 ，防腐剂是 0.1%ProClin 300，助悬剂是 3%海藻糖，盐是0.9%氯化钠，表面活性剂是0.2%吐温20。

2）在全自动生化分析仪上建立定标曲线

校准品、质控品的配制以及检测过程与实施例1相同，在全自动生化分析仪（本例中使用迈瑞全自动生化仪BS-400）上建立定标曲线。将6个HBP标准品，浓度从0到240ng/mL，放于生化仪中样品盘内，分别与实施例4中的反应液反应，样本：反应液＝10μl:200μl，进行检测，记录反应度，试剂参数设置完成和试剂位置放置正确后，生化分析仪自动完成吸取试剂和采样步骤，整个过程大约耗时5分钟。检测波长为700nm，采用两点终点法，反应时间270秒，计算两点反应度差值。根据浓度和反应度差值可以建立定标曲线。 图2是实施例4中反应液建立的定标曲线。

实施例5

试剂的分析灵敏度(空白限)

使用实施例1(HBP单抗标记的胶乳微粒微粒与多抗标记的胶乳微粒的质量比 是5：5)、2和3中的试剂，选用零值标准品作为空白样本测试，在半自动特 定蛋白分析仪(EZ-400)上，测试散射度变化值。重复测试20次，根据图1建 立的标准曲线，计算20次测试结果的平均值和标准差(SD)，

作为试剂的分析灵敏度(空白限)。3组测试结果如表1所示， 显示分析灵敏度分别为1.474、0.963和1.594ng/mL。肝素结合蛋白(HBP)检 测的临床参考值在30ng/mL左右，本发明试剂的灵敏度比参考值要小一个数量 级，完全符合使用的需要。

表1. 实施例1、2和3的试剂分析灵敏度测试结果

实施例6

试剂的线性范围

用零值HBP标准品稀释浓度240ng/mL的高浓度HBP标准品，分别制成240ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、5ng/mL、0ng/mL共6个不同的稀释浓度样本。使用实施例1（HBP单抗标记的胶乳微粒与多抗标记的胶乳微粒的质量比是6：4）和实施例4中制备的试剂分别对这些样本进行测试，每个稀释浓度测试3次，求出每个稀释浓度检测结果的均值。测量结果见表2。以稀释浓度为自变量，以检测结果均值为因变量求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数（r）。线性相关曲线见图3和图4。

表2.实施例1和实施例4的线性范围测量结果

实施例7

试剂的重复性

用实施例3中制备的试剂测试HBP浓度为8ng/mL左右的正常值水平的控制物 质和HBP浓度为40ng/mL左右的异常值水平的控制物质，各重复测试10次， 计算测量值的平均值和标准差(SD)。按式(1)计算变异系数(CV)。 测试结果见表3。根据测量结果，计算出变异系数CV＝8.16％和3.91％，符合 试剂CV≤10％的技术要求。

式中：

CV——变异系数；

SD——标准差；

——测量值的平均值。

表3.实施例3的重复性测量结果

用实施例1中制备的5组试剂测试HBP浓度为8ng/mL左右的正常值水平的控 制物质和HBP浓度为40ng/mL左右的异常值水平的控制物质，各重复测试10 次，计算测量值的平均值和标准差(SD)。按式(1)计算变异系 数(CV)。测试结果见表4和表5。根据测量结果，计算出HBP浓度为8ng/mL 的控制物质的变异系数分别为CV＝11.60％、9.29％、7.59％、8.31％和8.84％； HBP浓度为40ng/mL的控制物质的变异系数分别为CV＝4.97％、6.17％、5.70％、 5.48％和4.77％，结果表明单抗与多抗标记胶乳质量比为2：8时不符合试剂CV ≤10％的技术要求，单抗与多抗标记胶乳质量比为3：7、4：6、5：5和6：4时， 符合试剂CV≤10％的技术要求。

表4. 实施例1的重复性测量结果（质控浓度 8ng/mL）

表5. 实施例1的重复性测量结果（质控浓度 40ng/mL）

实施例8

钩状（Hook）效应

将市售的HBP抗原用标准品稀释液配制成一系列浓度的抗原溶液，浓度分别为240ng/mL, 3000ng/mL，400ng/mL, 500ng/mL, 600ng/mL, 700ng/mL, 800ng/mL, 900ng/mL,1000ng/mL。图5显示实施例3中散射强度变化值随抗原浓度的变化关系。本发明提供的散射比浊单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒在600ng/mL时不出现Hook效应。图5为实施例3的钩状效应曲线。

实施例9

与进口ELISA试剂盒的相关性分析

在本实施例中，我们收集了264个临床血清或血浆样本，采用实施例3中的试剂和POCT设备进行检测， 检测结果与市场上的进口试剂盒的检测结果进行了相关性分析。分析结果如图6所示。相关性直线拟合的结果显示拟合方程为y=0.9928x+0.4136，相关系数R=0.9830。这个结果表明本发明中的试剂盒和进口上市试剂盒相关性高，准确性非常一致。

实施例10

与市场上其他试剂盒的性能参数对比

本发明试剂与市场上其他HBP试剂盒的性能参数对比情况如表6所列。从表中可以看出，本发明的盒试剂主要在检测样本类型、需要的试剂数量和种类、试剂的线性范围、试剂的检测速度和精密度方面明显优于市场上的对比试剂盒。

表6. HBP试剂盒性能参数对比

试剂盒来源	本发明试剂盒	进口上市试剂盒
			测试方法	散射比浊或透射比浊法	酶联免疫法（ELISA）
样本类型	新鲜血清和血浆	新鲜血清和血浆
			试剂类型	液体	板条和液体试剂
试剂数量	1	6
			试剂种类	反应液	抗体标记的聚苯乙烯板条、抗原稀释液、酶标抗体溶液、底物溶液、终止液
线性范围	0-240ng/mL	0-200ng/mL
			检测耗时	半自动或全自动特定蛋白分析仪等POCT 1-3min；全自动生化分析仪5min左右	3-5小时
精密度	≤10%	≤15%
			是否需要配备抗原稀释液	否	是
是否配备标准品和质控品	是，6个浓度标准品和2个浓度质控品	是，6个浓度标准品和3个浓度质控品
			有效期	12个月	12个月

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的通用技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (13)

1.单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒包括反应液以及校准品和质控品，所述反应液包含HBP抗体标记的胶乳微粒。

2.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述反应液是单试剂。

3.根据权利要求1所述的单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述反应液包含HBP抗体标记的胶乳微粒，同时包含缓冲溶液、盐、稳定剂、助悬剂、防腐剂和表面活性剂，所述校准品和质控品包含肝素结合蛋白、缓冲溶液、盐、稳定剂、防腐剂和表面活性剂。

4.根据权利要求2所述的单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述HBP抗体标记的胶乳微粒是单抗标记的胶乳微粒或多抗标记的胶乳微粒或是HBP单抗标记的胶乳微粒与HBP多抗标记的胶乳微粒的混合物，所述单抗是一对或者几对配对的HBP单抗。

5.根据权利要求3所述的单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述HBP抗体标记的胶乳微粒中使用的胶乳微粒直径为100nm~400nm。

6.根据权利要求4所述的单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述HBP抗体标记的胶乳微粒的浓度为0.01%~1%。

7.单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1~5项任意一种配方组成所述单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒，所述HBP抗体标记的胶乳微粒中标记抗体的方法为中间酯法、一步法、两步法和物理吸附法中的任意一种。

8.根据权利要求7所述的单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述中间酯法为使用碳化二亚胺类和琥珀酰亚胺酯催化剂活化胶乳微粒表面的羧基，形成表面带有琥珀酰亚胺酯中间体的胶乳微粒，再加入HBP抗体，HBP抗体表面的氨基与胶乳微粒表面的琥珀酰亚胺酯缩合，即完成HBP抗体标记过程。

9.根据权利要求7所述的单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述一步法为把HBP抗体先同胶乳微粒混合，HBP抗体吸附在胶乳微粒表面，然后加入碳化二亚胺类催化剂，HBP抗体表面的羧基或氨基与胶乳微粒表面的羧基或氨基缩合，完成HBP抗体标记过程。

10.根据权利要求7所述的单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述二步法为使用碳化二亚胺类催化剂活化胶乳微粒表面的羧基，然后加入HBP抗体，二者的氨基和羧基直接缩合，完成HBP抗体标记过程。

11.根据权利要求7所述的单试剂肝素结合蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述物理吸附法为使用不带任何表面活性基团的聚苯乙烯胶乳微粒，然后加入HBP抗体，HBP抗体吸附在聚苯乙烯胶乳微粒表面，完成HBP抗体标记过程。

12.一种单试剂检测肝素结合蛋白的方法，其特征在于，采用权利要求1-11中所描述的任一种HBP 检测单试剂，在基于透射比浊或者散射比浊原理的分析仪上来测定待测样品中的HBP含量。

13.根据权利要求12所述的检测方法，其特征在于所使用的检测样本是新鲜血清或者血浆。