CN103937732A - 产中性纤维素酶菌株及选育方法和其生产纤维素酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产中性纤维素酶的链霉菌属菌株，其特征是：它于2014年3月3日保藏于中国武汉大学“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCCNO:M2014056，分类命名为StreptomycesparvusS10A10。该菌株来源于昆虫肠道。本发明提供了鉴定的菌株培养物的rDNA序列。本发明还提供了该菌株的产酶培养基和培养条件，以及该菌株所产纤维素酶的酶学性质和生产方法。本发明生产的中性纤维素酶活力高，生产成本低廉、发酵周期短。所得到的中性纤维素酶适合作为食品和饲料添加剂，改善食品品质，促进动物生长，降低饲料系数，并可用于纺织行业。

Description

产中性纤维素酶菌株及选育方法和其生产纤维素酶的方法

技术领域

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、食品工程及畜牧养殖等领域，具体涉及一种产中性纤维素酶菌株及选育方法和其生产纤维素酶的方法。本发明生产的纤维素酶主要应用于食品加工、饲料添加剂及纺织等行业。

背景技术

纤维素酶是将纤维素及其衍生物水解成葡萄糖的一组酶的总称。一组完整的纤维素酶系通常有相互协同催化水解纤维素的三类酶组成：内切纤维素酶(CMCase)、外切纤维素酶和葡萄糖苷酶。按催化反应的最适pH，可将内切纤维素酶分为：酸性内切纤维素酶(最适pH3～5)、中性内切纤维素酶(最适pH6～8)、碱性内切纤维素酶(最适pH8～10)。目前国产商品化纤维素酶多为酸性高温酶，国内使用的中性纤维素酶几乎都是国外厂家生产的。技术垄断导致其商品化中性纤维素酶价格昂贵，制约了其市场推广。因此，本领域迫切需要开发新的生产高活力中性纤维素酶的菌株。

能产生内切纤维素酶的微生物主要是真菌和部分细菌。真菌所产纤维素酶多为酸性胞外酶且产酶效率高，且酶系结构完整，但真菌所产纤维素酶都是复合酶，且酶系结构复杂，分子量大，不易分离提取，通常其产酶过程需要加入纤维素类物质进行诱导，且发酵周期长，因此在工业用酶开发方面显示出了诸多不足。细菌所产纤维素酶虽然成分单一(即通常只含有一类纤维素酶)，可以简化提取步骤，但是细菌纤维素酶多为中性或者碱性胞内酶，多吸附于菌壁，且其酶活普遍较低，另外，大部分菌株产诱导型内切纤维素酶，需要添加诱导物，不适应用于工业大规模生产。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于，提供一种产中性纤维素酶菌株及选育方法和其生产纤维素酶的方法，该菌株产生的纤维素酶pH稳定性好、催化能力强，适合较高的酶反应温度。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一株产中性纤维素酶的链霉菌属菌株，其特征是：它于2014年3月3日保藏于中国武汉大学“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCCNO:M2014056，分类命名为StreptomycesparvusS10A10。

前述的一株产中性纤维素酶菌株，其特征是：该菌株为放线菌，能有效地获得高产的中性纤维素酶。

一种如权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：

(a)取昆虫肠道无菌研磨加入液体种子培养基中富集培养1d后，将经过富集培养后的菌液稀释到10^-4，取稀释液，在初筛培养基上涂平板培养；

(b)培养7d后，用接种针挑出同一平板上不同形态的放线菌菌落，再转接到平板上进行单菌落分离，最终得到多株菌；

(c)将每株菌分别接种于液体种子培养基和发酵产酶培养基中，在28℃恒温培养箱中培养36h，取发酵液进行刚果红平板的快速筛选，经1mg/mL的刚果红溶液染色30min，1mol/L的NaCl溶液脱色30min后，测量平板上菌落水解圈与菌落直径，计算水解圈和菌株直径的比值，筛选出比值大于5的菌株，经反复实验筛选得到一株在两种培养中均能产生明显透明圈的菌株，将其命名为StreptomycesparvusS10A10。

前述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，上述步骤(a)和步骤(c)中，所述液体种子培养基的组成为：CMC-Na，10g；KH₂PO₄，4.0g；MgSO₄，0.03g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5。

前述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，上述步骤(a)中，所述初筛培养基的组成为：羧甲基纤维素钠，5.0g；K₂HPO₄，1.0g；NaNO₃，3.0g；KCl，0.5g；MgSO₄，0.5g；FeSO₄，0.01g；琼脂，17.0g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5。

前述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，上述步骤(c)中，所述发酵产酶培养基的组成为：水稻秸秆粉，10g；(NH₄)₂SO₄，4g；KH₂PO₄，2g；MgSO₄，0.5g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5。

一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：

(1)产酶培养

将StreptomycesparvusS10A10接种于斜面高氏1号培养基，27℃培养2d后转接液体种子培养基，27℃条件下培养24h；以2％接种量再转接发酵产酶培养基，发酵培养基最适初始pH为6～6.5,27℃条件下培养5d；

(2)胞外产物粗酶液的处理

将发酵液以4000r/min的转速冷冻离心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于0.05mol/L、pH为6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中透析过夜；用聚乙二醇浓缩透析液，再经O.45μm微孔滤膜过滤除杂，保存滤液；

(3)分子筛层析

预先用pH为6.2的磷酸盐缓冲液充分平衡葡聚糖凝胶层析柱SephadexG-100柱，上样后用pH为6.2的柠檬酸-柠檬酸钠洗脱，收集有酶活的洗脱峰，即为纯化后的纤维素酶。

前述的一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是，上述步骤(1)中，所述高氏1号培养基的组成为：可溶性淀粉，20g；KNO₃，1g；K₂HPO₄，0.5g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；NaCl，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；琼脂，20g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5。

前述的一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是，上述步骤(1)中，所述液体种子培养基的组成为：CMC-Na，10g；KH₂PO₄，4.0g；MgSO₄，0.03g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5。

前述的一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是，上述步骤(1)中，所述发酵产酶培养基的组成为：水稻秸秆粉，10g；(NH₄)₂SO₄，4g；KH₂PO₄，2g；MgSO₄，0.5g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所筛选到的StreptomycesparvusS10A10属于组成型纤维素酶高产菌株，与当前工业用酶的细菌菌株相比，发酵产酶周期短，酶活力高，且产酶过程无需诱导，因此其产生的纤维素酶即为组成型纤维素酶，因此该菌适用于大规模的发酵生产的特点；

(2)从本发明StreptomycesparvusS10A10提取的纤维素酶总酶的活力比活达33.02U/mL,与报道菌株相比，具有更高的催化能力；该酶最适反应pH为5.0，为罕见的酸性组成型纤维素酶；该酶在pH4.0～8.0的缓冲液中保存2h酶活力可保持最高酶活的90％以上，体现了较好的pH稳定性；最适反应温度为50～65℃；有耐Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺等金属离子的良好特性，EDTA对酶活性影响甚微，该酶为非金属离子纤维素酶，显示了良好的特性，在纺织、食品加工和饲料等工业领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明StreptomycesparvusS10A10菌株在初筛培养基上的透明圈；

图2为本发明StreptomycesparvusS10A10菌株的扫描电镜形态图片；

图3为本发明纯化的纤维素酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图(M为标准蛋白分子量，3为酶蛋白分子量为82Kd内切纤维素酶。)；

图4为SephadexG-100柱层析得到含纤维素酶活性峰的色谱图；

图5为pH对纤维素内切酶活的影响；

图6为温度对纤维素内切酶活的影响；

序列表为StreptomycesparvusS10A10菌株的16SrDNA序列鉴定。

生物材料样品保藏：

StreptomycesparvusS10A10已保藏于中国武汉大学“中国典型培养物保藏中心”，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号为保藏编号为CCTCCNO:M2014056，保藏日期为2014年3月3日。

具体实施方式

为进一步揭示本发明的技术方案，下面结合附图详细说明本发明的实施方式：

本发明中所用培养基为：

高氏(Gause)1号培养基：可溶性淀粉，20g；KNO₃，1g；K₂HPO₄，0.5g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；NaCl，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；琼脂，20g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5。

初筛培养基：羧甲基纤维素钠，5.0g；K₂HPO₄，1.0g；NaNO₃，3.0g；KCl，0.5g；MgSO₄，0.5g；FeSO₄，0.01g；琼脂，17.0g；蒸馏水1000mL，pH6.0～6.5。

液体种子培养基：CMC-Na，10g；KH₂PO₄，4.0g；MgSO₄，0.03g；蒸馏水1000mL，pH6.0～6.5。

发酵产酶培养基：水稻秸秆粉，10g；(NH₄)₂SO₄，4g；KH₂PO₄，2g；MgSO₄，0.5g；蒸馏水1000mL，pH6.0～6.5。

实施例1

StreptomycesparvusS10A10的筛选过程：

取黑盾鞭蝎(Typopeltisniger)肠道无菌研磨加入液体种子培养基中富集培养1d后，将经过富集培养后的菌液稀释到10-4，取稀释液，在初筛培养基上涂平板培养。培养约7d后，用接种针挑出同一平板上不同形态的放线菌菌落，再转接到平板上进行单菌落分离，最终得到42株菌株。将每株菌分别接种于液体种子培养基和发酵产酶培养基中，在28℃恒温培养箱中培养36h，取发酵液进行刚果红平板的快速筛选，经1mg/mL的刚果红溶液染色30min，1mol/L的NaCl溶液脱色30min后，测量平板上菌落水解圈与菌落直径，计算水解圈和菌株直径的比值，筛选出比值大于5的菌株，经反复实验筛选得到一株在两种培养中均能产生明显透明圈的菌株(D/d>5)，将其命名为StreptomycesparvusS10A10。图1为StreptomycesparvusS10A10菌株在初筛培养基上的透明圈，图2为StreptomycesparvusS10A10菌株的显微观察图片。

实施例2

从StreptomycesparvusS10A10中提取中性组成型内切纤维素酶的方法：

1.产酶培养

将StreptomycesparvusS10A10接种于斜面高氏1号培养基，27°C培养2d后转接种子培养基，27°C条件下培养24h；以2％接种量再转接液体发酵培养基，发酵培养基最适初始pH为6～6.5；27°C条件下培养5d。

2.胞外产物粗酶液的前处理

将发酵液以4000r/min的转速冷冻离心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于0.05mol/L、pH值6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中透析过夜；用聚乙二醇浓缩透析液，再经O.45μm微孔滤膜过滤除杂，保存滤液。

3.分子筛层析

预先用pH6.2的磷酸盐缓冲液充分平衡葡聚糖凝胶层析柱SephadexG-100柱，上样后用PH6.2的柠檬酸-柠檬酸钠洗脱，收集有酶活的洗脱峰(见图4)。

SephadexG-100柱层析条件如下：

平衡缓冲液：0.05mol/L、pH值6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

洗脱缓冲液：0.05mol/L、pH值6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

上样流速：1.0mL/min；

洗脱流速：1.5mL/min。

分管收集蛋白峰，检测酶活力和蛋白浓度，得到含纤维素酶活性峰的收集液。

酶活测定方法：

①总酶(滤纸酶活力、FPA)活力的测定：

取稀释10倍后的粗酶液0.5mL，加入1.0ml0.05mol/L的柠檬酸缓冲液(pH值4.8)和50mg新华滤纸，以不加底物为对照，50℃反应60min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再将试管置于冷水浴中，待试管冷却后，加入18mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光度计测得在540nm处的OD值。

②纤维素内切酶(羧甲基纤维素酶、CMCA)活力的测定：

取稀释10倍后的粗酶液0.5mL，加入1.0mL、1％羧甲基纤维素钠溶液(pH值4.8)，以不加底物为对照，50℃反应30min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再将试管置于冷水浴中，待试管冷却后，加入18mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光度计测得在540nm处的OD值。

③纤维素外切酶(微晶纤维素酶)活力的测定：

取0.5mL稀释3倍后的酶液，加入1.0mL、1％的微晶纤维素溶液(pH值4.8)，以不加底物为对照，50℃反应60min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再将试管置于冷水浴中，待试管冷却后，加入18mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光度计测得在540nm处的OD值。

④β-葡萄糖苷酶(BGA)活力测定：

取0.5mL稀释3倍后的酶液，加入1.0mL、1％的水杨苷溶液(pH值4.8)，以不加底物为对照，50℃反应30min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再将试管置于冷水浴中，待试管冷却后，加入18mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光度计测得在540nm处的OD值。

酶活力的计算方法：

酶活力的定义：在pH4.8，50℃条件下，每1mL酶液在1min内水解底物生成1μg葡萄糖的酶量称作一个酶活力单位(U)。

纤维素酶活力单位＝G×n×1000/(0.5×t)

G——所测得的OD值在葡萄糖标准曲线上查出的还原糖浓度，mg/mL；

n——酶液的稀释倍数；

1000——毫克换算成微克；

0.5——反应酶液的体积；

t——酶和底物反应时间，min。

取粗酶液测定酶的活力，经测定，总酶、内切酶和外切酶酶活分别为33.02U/mL、18.51U/mL和23.92U/mL。

分别对粗酶液、样品前处理液和经SephadexG-100柱层析后的样品进行总酶活力的测定，如表1所示，结果表明StreptomycesparvusS10A10纤维素酶纯化后得率78％，得率较高，且酶活在纯化过程中较为稳定。

表1纤维素酶的内切酶活力测定

实施例3

从StreptomycesparvusS10A10菌株中提取的中性组成型内切纤维素酶的相关性质：

1.酶蛋白分子量的测定

用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳按常规方法进行。分离胶、浓缩胶浓度分别为12％和5％，电极缓冲液为pH8.3Tris-Gly缓冲，考马斯亮蓝染色，结果如图3所示。电泳后用GEL-DOC2000(Bio-Rad)进行凝胶扫描。运用扫描***自带软件QuantityOne进行分子量测定，测得内切纤维素酶酶蛋白分子量为82Kd。

2.酶的最适pH

用各种缓冲配制不同pH值的CMC-Na底物。将提取后的内切纤维素酶LC与不同pH值CMC-Na底物反应，65℃条件下反应30min，并检测CMCase活力，如图5所示。纤维素酶在中性偏酸性的具有较高的活力，在pH5.O～7.O范围内具有很高的活力，达到最高酶活的80％以上，其最适反应pH为6.2，为中性纤维素酶。

3.酶的pH稳定性

提取后的内切纤维素酶溶解于不同pH缓冲液中，65℃条件下放置2h后，测定内切纤维素酶相对活力，如附图5所示。结果表明该内切纤维素酶在较宽的pH范围内显示了高度的稳定性，在pH5.0～8.0的缓冲液中能保持其最高酶活85％以上，显示了良好的pH稳定性，在纺织、造纸以及食品加工行业有良好的应用潜力。

4.酶的最适反应温度

将内切纤维素酶LC纯酶分别放置于不同温度下反应30min，测定其酶活如图6所示。结果表明内切纤维素酶在50～65℃反应时具有较高的活力，其最适温度为50℃。

5.金属离子对内切纤维素酶活力的影响

在三个浓度水平lmmol/L、5mmol/L、10mmol/L探讨Na⁺、K⁺、Li⁺—价金属离子；Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺二价金属离子；Fe³⁺三价金属离子以及EDTA对CMCase活力的影响。4℃下放置30min，65℃条件下反应30min，并检测CMCase活力。以不加金属离子的酶活为对照测定酶的相对活力。结果低浓度(lmmol/L)的金属离子存在条件下，大部分金属离子可明显促进内切纤维素酶活力，中等浓度(5mmol/L)的金属离子存在条件下,大部分金属离子可提高纤维素酶活力。此外实验发现不同浓度的EDTA对酶活力影响不大，推测内切纤维素酶很可能为非金属离子纤维素酶，金属离子对该酶有一定的促进作用。表明该酶符合纺织、造纸以及食品加工行业应用的基本要求。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化、均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一株产中性纤维素酶的链霉菌属菌株，其特征是：它于 2014年3 月 3日保藏于中国武汉大学“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO：M 2014056，分类命名为Streptomyces parvus S10A10。

2.根据权利要求1所述的一株产中性纤维素酶菌株，其特征是：该菌株为放线菌，能有效地获得高产的中性纤维素酶。

3.一种如权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，所述方法包括以下步骤： 

（a）取昆虫肠道无菌研磨加入液体种子培养基中富集培养1d后，将经过富集培养后的菌液稀释到10^-4，取稀释液，在初筛培养基上涂平板培养；

（b）培养7d后，用接种针挑出同一平板上不同形态的放线菌菌落，再转接到平板上进行单菌落分离，最终得到多株菌；

（c）将每株菌分别接种于液体种子培养基和发酵产酶培养基中，在28℃恒温培养箱中培养36h，取发酵液进行刚果红平板的快速筛选，经1 mg/mL的刚果红溶液染色30 min，1 mol/L的NaCl溶液脱色30 min后，测量平板上菌落水解圈与菌落直径，计算水解圈和菌株直径的比值，筛选出比值大于5的菌株，经反复实验筛选得到一株在两种培养中均能产生明显透明圈的菌株，将其命名为Streptomyces parvus S10A10。

4.根据权利要求3所述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，上述步骤（a）和步骤（c）中，所述液体种子培养基的组成为：CMC-Na，10 g；KH₂PO₄，4.0 g；MgSO₄，0.03 g；蒸馏水，1000 mL，pH 6.0～6.5。

5.根据权利要求3所述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，上述步骤（a）中，所述初筛培养基的组成为：羧甲基纤维素钠，5.0 g；K₂HPO₄，1.0 g；NaNO₃，3.0 g；KCl，0.5 g；MgSO₄，0.5 g；FeSO₄，0.01 g；琼脂，17.0 g；蒸馏水，1000 mL，pH 6.0～6.5。

6.根据权利要求3所述的产中性纤维素酶菌株的选育方法，其特征是，上述步骤（c）中，所述发酵产酶培养基的组成为：水稻秸秆粉，10 g；（NH₄）₂SO₄，4 g；KH₂PO₄，2 g；MgSO₄，0.5 g；蒸馏水，1000 mL，pH 6.0～6.5。

7.一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：

（1）产酶培养

将Streptomyces parvus S10A10接种于斜面高氏1号培养基，27℃培养2d后转接液体种子培养基，27℃条件下培养24h ；以2%接种量再转接发酵产酶培养基，发酵培养基最适初始pH为6～6.5,27℃条件下培养5d ； 

（2）胞外产物粗酶液的处理

将发酵液以4000r/min的转速冷冻离心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于0.05 mol/L、pH为6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中透析过夜；用聚乙二醇浓缩透析液，再经O.45μm微孔滤膜过滤除杂，保存滤液；

（3）分子筛层析

预先用pH为6.2的磷酸盐缓冲液充分平衡葡聚糖凝胶层析柱Sephadex G-100柱，上样后用pH为6.2的柠檬酸-柠檬酸钠洗脱，收集有酶活的洗脱峰，即为纯化后的纤维素酶。

8.根据权利要求7所述的一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是，上述步骤（1）中，所述高氏1号培养基的组成为：可溶性淀粉，20 g；KNO₃，1 g；K₂HPO₄，0.5 g；MgSO₄·7H₂O，0.5 g；NaCl，0.5 g；FeSO₄·7H₂O，0.01 g；琼脂，20 g；蒸馏水，1000 mL，pH 6.0～6.5。

9.根据权利要求7所述的一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是，上述步骤（1）中，所述液体种子培养基的组成为：CMC-Na，10 g；KH₂PO₄，4.0 g；MgSO₄，0.03 g；蒸馏水，1000 mL，pH 6.0～6.5。

10.根据权利要求7所述的一种利用权利要求1所述的产中性纤维素酶菌株生产纤维素酶的方法，其特征是，上述步骤（1）中，所述发酵产酶培养基的组成为：水稻秸秆粉，10 g；（NH₄）₂SO₄，4 g；KH₂PO₄，2 g；MgSO₄，0.5 g；蒸馏水，1000 mL，pH 6.0～6.5。