CN101555461A - 一株产碱性纤维素酶菌株lt3及其选育方法和产酶条件初步优化 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株产碱性纤维素酶菌株LT3及其选育方法和产酶条件初步优化，通过对从腐烂朽木及其附近土壤中得到的样品进行富集培养、分离纯化、经刚果红染色鉴定和液体发酵获得一株纤维素酶分泌量较高的细菌LT3、经初步鉴定、克隆序列，***进化分析，鉴定为蜡状芽孢杆菌；16s rDNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。本发明对研究纤维素酶作用机理及纤维素酶制剂的生产具有潜在理论和应用价值；该纤维素酶菌株LT3能产生单一组份的纤维素酶，便于分离纯化，是纤维素酶基因克隆的理想材料，对于构建纤维素分解工程菌株以及探索纤维素酶作用机制有着潜在的理论和实践意义，方法简单快速，易于实施。

Description

一株产碱性纤维素酶菌株LT3及其选育方法和产酶条件初步优化

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体涉及一株产碱性纤维素酶菌株LT3及其选育方法和产酶条件初步优化。

背景技术

纤维素材料是自然界中最丰富的可再生资源。利用现代生物技术将纤维素材料转化为乙醇等液体燃料，不仅可以作为新资源新能源为人类造福，缓解或解决化石能源对环境污染的问题，同时也可以实现对农业剩余资源的高效利用，现已受到世界各国的普遍重视。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法，纤维素酶能将天然纤维素降解，生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖，然而目前主要制约纤维素材料转化乙醇产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下，造成生产成本过高。因此，筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。目前研究较多的是霉菌，其中木霉、曲霉、根霉和青霉均具有较强的酶活力，尤以绿色木霉、里氏木霉和康氏木霉为典型。而对细菌的研究很少有报道。由细菌所产生的纤维素酶一般最适pH为中性至偏碱性，近20年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一株产碱性纤维素酶菌株LT3及其选育方法和产酶条件初步优化，对研究纤维素酶作用机理及纤维素酶制剂的生产具有潜在理论和应用价值；该纤维素酶菌株LT3能产生单一组份的纤维素酶，便于分离纯化，是纤维素酶基因克隆的理想材料，对于构建纤维素分解工程菌株以及探索纤维素酶作用机制有着潜在的理论和实践意义，方法简单快速，易于实施。

本发明的产碱性纤维素酶菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LT3：所述产碱性纤维素酶菌株LT3的16s rDNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

本发明的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LT3，已经于2009年1月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2879。

本发明的菌株LT3形态学鉴定：使用革兰氏染色法对LT3进行染色，结果表明：该菌株为***，菌体呈杆状，有芽孢，呈椭圆形，位于中央或近中央。周生鞭毛。其繁殖体不耐热，120℃灭菌20分钟可被杀死。该菌株适宜pH发酵条件为7.0-8.5，与其他蜡状芽孢杆菌相比，该菌株具有产碱性纤维素酶特征。

本发明的通过对从腐烂朽木及其附近土壤中得到的样品进行富集培养、分离纯化得到16株纤维素分解菌，经刚果红染色鉴定和液体发酵获得一株纤维素酶分泌量较高的细菌LT3，并对其进行菌种初步鉴定，再通过克隆其16s rDNA序列，对其进行***进化分析，鉴定为蜡状芽孢杆菌。

本发明的显著优点：本发明蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LT3分离自朽木的特殊环境中，具有较宽的适应pH范围，能产生胞外纤维素酶，并且所产的纤维素酶具有耐受碱性环境的特性。除了便于分离纯化之外，该菌还是纤维素酶基因克隆的理想材料，对于构建纤维素分解工程菌株以及探索纤维素酶作用机制有着潜在的理论和实践意义。

本发明通过刚果红鉴定板来鉴定产纤维素酶菌是一种快速简便的筛选方法，透明圈直径和鉴定板孔径大小的比值能够直接的反映该菌产纤维素酶的能力，其原理是刚果红是一种能够和大分子多糖相结合的染色剂，染色之后能和纤维素结合形成红色，产纤维素酶菌在CMC平板上培养后产生的纤维素酶将纤维素水解成小分子的还原糖，在用刚果红染色之后没有被水解的纤维素能够和刚果红结合显红色，而水解的部位则不能和刚果红结合而出现透明圈。

本发明应用16S rDNA序列分析的分子生物学技术，总DNA提取、PCR扩增、16S rDNA测序及序列分析并结合形态学观察初步鉴定该降解纤维素菌，能够快速准确的对微生物种属进行鉴定。

附图说明

图1是使用革兰氏染色法对本发明的菌株LT3进行染色后菌株显微图。

图2是本发明部分芽孢杆菌以16S rDNA同源性为基础的***进化树。

图3为本发明菌株LT3PH优化水解圈大小图。

图4为本发明菌株LT3基因组DNA。

图5是本发明菌株LT3PCR扩增产物。

具体实施方式

以下是本发明的具体选育方法，并结合实施例充分说明本发明。

选育实施例：1材料与方法

1.1材料

主要试剂：

羧甲基纤维素钠、硝基水杨酸试剂(称取酒石酸钾钠91g，溶于500mL蒸馏水中，加热至50℃，再依次加入3，5-二硝基水杨酸(DNS)3.5g，NaOH20g，苯酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5g，搅拌完全溶解。冷却后用蒸馏水定容至1L。储于棕色瓶中4℃保存，放置一周后使用，使用前过滤。)、PH4.6醋酸缓冲液；所述醋酸缓冲液由冰醋酸与醋酸钠配置、刚果红、无水葡萄糖，PCR mix酶(购自北京天根公司)，胶回收试剂盒(购自大连TaKaRa公司)，化学试剂均为分析纯；

培养基(灭菌条件均为120℃20min)：

富集培养基，1L中含：CMC-Na 10g  黄豆饼粉5g  (NH₄)₂SO₄2.5g  pH 8.5。

初筛培养基，1L中含：CMC-Na10g  黄豆饼粉5g  (NH₄)₂SO₄2.5g  pH 8.5琼脂1.5％。

斜面保藏培养基，1L中含：麸皮70g  黄豆饼粉30g  (NH₄)₂SO₄2.5g  pH 6.0琼脂条2％。

液体发酵培养基，1L中含：CMC-Na10g  麸皮10g  (NH₄)₂SO₄3g  MgSO₄0.4g酵母膏0.5gCaCl₂0.4gKH₂PO₄1g  蛋白胨2g pH8.5。

1.2方法

样品采集：来自福州市闽侯县银雕村木屑厂，采集腐烂的朽木屑及其附近土壤。共9样，用于分离选育纤维素降解菌。

(1)富集初筛：取1g样品粉末置于无菌三角瓶(含30ml富集培养基)中，25℃和220rpm下，摇床培养48h。取富集后的培养液按10^-2、10^-3、10^-4、10^-6、10^-8配制不同梯度稀释液，分别涂布于初筛培养基中，倒置恒温培养箱28℃，培养65h。往平板中加入1mg/mL刚果红溶液，染色1h，弃去染液后，加入10-12ml的1mol/L的NaCl溶液，洗涤1h。分离能够旺盛生长，并在刚果红染色、NaCl脱色后可以观察到菌落周围有明显透明水解圈的菌株，接种于斜面培养基中25℃培养48h后，4℃低温保存。

(2)发酵复筛：将初筛得到的产纤维素酶菌株以1环/30ml培养基的接种量接种到液体发酵培养基中，于30℃，180r/min下，振荡培养5天后，测定初酶液的CMC酶活和滤纸酶活，最终以酶活值作为筛选纤维素酶高产菌的标准，筛选CMC酶活和滤纸酶活高的菌株。采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定CMC酶活和滤纸酶活(FPA)。酶活测定方法采用魏雅琴、李红玉.纤维素高产菌选育研究进展及未来趋势[J].兰州大学学报，2008，Vol.44记载的方法。

(3)菌种鉴定：经初筛、复筛得到CMC酶活及滤纸酶活都较高的菌株，观察其菌落的形态特征：颜色，形状，菌落质地等；通过革兰氏染色，在显微镜下观察菌的形态以及孢子形态；依据现有技术的文献资料，初步鉴定菌属。

(4)16s rDNA序列克隆：细菌基因组DNA的提取按照《精编分子生物学实验指南》(马学军，舒跃龙.精编分子生物学实验指南[M].第四版.科学出版社：2005.1-1109.)中的方法进行。使用上游引物5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’，下游引物5’AAG GAG GTG ATCCAC CC 3’进行16s rDNAA序列扩增。PCR反应条件为：95℃预变性3min，(94℃45s，53℃45s，72℃2min)X 30个循环，72℃延伸10min，4℃终止。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。将PCR产物割胶回收纯化后送上海生工公司测序。

(5)序列比对及***发育树的构建：将16s rDNA序列克隆结果提交GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。用Blast软件在GenBank网站上进行相似性搜索，获取相近典型菌株的基因序列。利用Clustalw2(Larkin MA，Blackshields G，BrownNP，et al.Clustal W and Clustal X version 2.0.[J].Bioinformatics，2007，23：2947-2948.)在线工具将序列及其相似性序列进行遗传关系研究，并用邻接法构建***发育树状图，如图2中所示。

2.结果与分析

菌株的初筛

将9种土样制备的菌悬液涂布于初筛平板上，待生长出单菌落后，用刚果红染色。结果表明，其中100余个菌落周围产生清晰水解圈，这些菌落多为霉菌和细菌。挑取其中16个菌落生长旺盛且水解圈较大的菌种进入复筛。

LT3菌株的分离

将16株产纤维素酶的菌株进行发酵产酶，测得其初酶液的CMC酶活和滤纸酶活，选出酶活均较高的菌株LT3。初步鉴定得LT3菌株生长较快具有较高纤维素分解能力的细菌，其初酶液的CMC酶活为12.35u/ml，滤纸酶活为9.12u/ml。

培养条件优化

PH条件对产酶活性的影响

将LT3菌株于发酵培养基中30℃180r/min培养72h(接种量：1接种环/30ml培养基)，测定培养基pH分别为5.5、7.0、8.5时发酵液CMC酶的活力，如表1，并取发酵液40μl于酶活鉴定板中观察其水解圈大小，如图3所示：

表1PH条件对LT3菌株纤维素酶活力的影响

pH	5.5	7.0	8.5
				CMC酶活(u/mL)	12.30	13.49	12.36

pH条件优化结果表明，LT3菌株产酶培养基最优起始PH为7.0，但是在pH8.5时仍然保留有较高的活性。

菌株形态学鉴定

使用革兰氏染色法对LT3进行染色，结果表明：该菌株为***，菌体呈杆状，如图1所示。

16s rDNA序列克隆结果

PCR扩增片段经1％琼脂糖电泳后，获得1条约1500bp大小的特异DNA带，如图4、5所示，基因组DNA的条带清晰，无降解。

序列比对及***进化树构建结果

对测序结果进行同源性分析以及Blast比对，与之相似度达99％得菌株大部分为芽孢杆菌，主要有蜡状芽孢杆菌(Bacillis cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)，选取相似度达99％的14株芽孢杆菌16S rDNA序列，经Clustalw2软件进行多序列比对，采用邻接法(Neighbor-Joining-method)进行聚类分析和***进化树的构建，如图2显示相关芽孢杆菌的进化地位，从14序列中划分出3大类群，LT3所处类群中16S rDNA基因序列两两之间的相似值达98％以上，其中LT3菌株与以蜡状芽孢杆菌为主的的亚群处在同一分枝上，与Bacillus cereus isolate HKS 2-1株距离最近。16srDNA测序结果表明LT3菌株与蜡状芽孢杆菌有很高的同源性。

功能用途实验

将LT3菌株接种于发酵培养基中30℃180r/min培养72h(接种量：1接种环/30ml培养基)，测定培养基pH分别为5.5、7.0、8.5时发酵液的CMC酶活力，并取发酵液40μl于酶活鉴定板中观察其水解圈大小(如图3所示)

pH	5.5	7.0	8.5
				CMC酶活	12.30	13.49	12.36

结果表明，LT3能够产生胞外纤维素酶，直接将酶分泌到培养基中，运用在工业上能节省细胞破碎这一步骤，便于提取和纯化。并且该酶在较宽的培养基pH环境下都具有活性，尤其是能在pH8.5的碱性条件下具有较高的活性，在工业上，该特性具有很好的应用前景，比如洗涤剂行业，纺织业等等。而普通的蜡状芽孢杆菌，一般不具有产生胞外纤维素酶的能力。

重复性实验

采集不同的地区的腐烂朽木及其附近土壤作为样品，按照以上实验步骤重复实验步骤。在初筛平板中得到一株变色圈较大的菌株，编号为33，从形态上观察，初步判断该微生物为细菌，将33接种于LB培养基平板上，划线培养，挑取形态上相同的单菌落数个，同时分别接种于初筛培养基和斜面保藏培养基中，对初筛培养基进行刚果红染色，在初筛培养基中这些菌均能产生透明圈，可证明这些菌均能产生胞外纤维素酶。同时，将这些菌分别使用革兰氏染色法制片，于显微镜下观察，可见菌体显微形态一致，并且均为革兰氏阳性菌，可判断这些菌为同一种菌。

取出接种有其中一株的斜面保藏培养基置于4度冷藏，并命名为LT3。之后，对LT3进行分子分类学的鉴定。

由此可见，本发明具有高度重复性。

核苷酸序列表：

<110>福州大学

<120>一株产碱性纤维素酶菌株LT3及其选育方法和产酶条件初步优化

<160>1

<210>1

<211>1093

<212>DNA

<213>蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LT3

<220>

<223>该蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LT316S rDNA总长1093。

<400>1

ggttattggg ccgcgtgcta taatgcaagt cgagcgaatg gattaagagc ttgctcttat      60

gaagttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccataaga ctgggataac     120

tccgggaaac cggggctaat accggataac attttgaacc gcatggttcg aaattgaaag     180

gcggcttcgg ctgtcactta tggatggacc cgcgtcgcat tagctagttg gtgaggtaac     240

ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg     300

agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag     360

tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttgtta     420

gggaagaaca agtgctagtt gaataagctg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca     480

cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta     540

ttgggcgtaa agcgcgcgca ggtggtttct taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac     600

cgtggagggt cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccatg     660

tgtagcggtg aaatgcgtag agatatggag gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt     720

ctgtaactga cactgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag     780

tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagagggttt ccgcccttta gtgctgaagt     840

taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaggaattga     900

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta     960

ccaggtcttg acatcctctg acaccctaga gatagggctt ctccttcggg agcagagtga    1020

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg tggttagtcc cgcacgagcg    1080

caacccttga tct                                                       1093

Claims (6)

1.一株产碱性纤维素酶菌株LT3，其特征在于：所述产碱性纤维素酶菌株LT3的16s rDNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的产碱性纤维素酶菌株L73，其特征在于：所述产碱性纤维素酶菌株LT3为蜡状芽孢杆菌，其保藏号为CGMCC No.2879。

3.一种如权利要求1或2所述的碱性纤维素酶菌株的选育方法，其特征在于：通过对从腐烂朽木及其附近土壤中得到的样品进行富集培养、分离纯化得到16株纤维素分解菌，经刚果红染色鉴定和液体发酵获得一株纤维素酶分泌量较高的细菌LT3，并对其进行菌种初步鉴定，再通过克隆其16s rDNA序列，对其进行***进化分析，鉴定为蜡状芽孢杆菌。

4.根据权利要求3所述的碱性纤维素酶菌株LT3的选育方法，其特征在于：所述选育方法的具体如下：主要试剂：羧甲基纤维素钠、硝基水杨酸试剂、PH4.6醋酸缓冲液；所述醋酸缓冲液由冰醋酸与醋酸钠配置、刚果红、无水葡萄糖，PCR mix酶，胶回收试剂盒，化学试剂均为分析纯；

培养基：培养基的灭菌条件均为120℃20min：

富集培养基，1L中含：CMC-Na 10g  黄豆饼粉5g  (NH₄)₂SO₄ 2.5g  pH 8.5

初筛培养基，1L中含：CMC-Na10g黄豆饼粉5g  (NH₄)₂SO₄ 2.5g  pH 8.5琼脂1.5％

斜面保藏培养基，1L中含：麸皮70g黄豆饼粉30g  (NH₄)₂SO₄2.5g  pH 6.0琼脂条2％

液体发酵培养基，1L中含：CMC-Na10g麸皮10g    (NH₄)₂SO₄ 3g  MgSO₄ 0.4g酵母膏0.5g CaCl₂ 0.4g  KH₂PO₄1g  蛋白胨2g pH8.5

方法步骤：

(1)样品采集：采集腐烂的朽木屑及其附近土壤，共9样，用于分离选育纤维素降解菌；

(2)富集初筛：取1g样品粉末置于无菌三角瓶中，所述无菌三角瓶中含30ml富集培养基，在25℃和220rpm下，摇床培养48h；取富集后的培养液按10^-2、10^-3、10^{- 4}、10^-6、10^-8配制不同梯度稀释液，分别涂布于初筛培养基中，倒置恒温培养箱28℃，培养65h，往平板中加入1mg/mL刚果红溶液10ml，染色1h，弃去染液后，加入10-12ml的1mol/L的NaCl溶液，洗涤1h，分离能够旺盛生长，并在刚果红染色、NaCl脱色后能观察到菌落周围有明显透明水解圈的菌株，接种于斜面保藏培养基中25℃培养48h后，4℃低温保存；

(3)发酵复筛：将初筛得到的产纤维素酶菌株以1环/30ml培养基的接种量接种到液体发酵培养基中，于30℃，180r/min下，振荡培养5天后，测定初酶液的CMC酶活和滤纸酶活，最终以酶活值作为筛选纤维素酶高产菌的标准，筛选CMC酶活和滤纸酶活高的菌株，采用3，5-二硝基水杨酸法测定CMC酶活和滤纸酶活，酶活测定方法采用魏雅琴、李红玉.纤维素高产菌选育研究进展及未来趋势[J].兰州大学学报，2008，Vol.44记载的方法；

(4)菌种初步鉴定：经初筛、复筛得到CMC酶活及滤纸酶活都较高的菌株，观察其菌落的形态特征；通过革兰氏染色，在显微镜下观察菌的形态以及孢子形态；依据现有技术文献资料，初步鉴定菌属；

(5)16s rDNA序列克隆：细菌基因组DNA的提取按照《精编分子生物学实验指南》中的方法进行：使用上游引物5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’，下游引物5’AAG GAGGTG ATC CAC CC 3’进行16s rDNA序列扩增，PCR反应条件为：95℃预变性3min，按照94℃45s，53℃45s，72℃2min做30个循环，72℃延伸10min，4℃终止；1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；将PCR产物割胶回收纯化后测序；

(6)序列比对及***发育树的构建：将16s rDNA序列克隆结果提交GenBank数据库；用Blast软件在GenBank网站上进行相似性搜索，获取相近典型菌株的基因序列；利用Clustalw2在线工具将序列及其相似性序列进行遗传关系研究，并用邻接法构建***发育树状图；

(7)对测序结果进行同源性分析以及Blast比对，与之相似度达99％得菌株大部分为芽孢杆菌，选取相似度达99％的14株芽孢杆菌16S rDNA序列，经Clustalw2软件进行多序列比对，采用邻接法进行聚类分析和***进化树的构建，显示相关芽孢杆菌的进化地位，从14序列中划分出3大类群，LT3所处类群中16S rDNA基因序列两两之间的相似值达98％以上，其中LT3菌株与以蜡状芽孢杆菌为主的的亚群处在同一分枝上，与Bacillus cereus isolate HKS 2-1株距离最近；16srDNA测序结果表明LT3菌株与蜡状芽孢杆菌有很高的同源性。

5.根据权利要求4所述的碱性纤维素酶菌株LT3的选育方法，其特征在于：所述硝基水杨酸试剂的配置为：称取酒石酸钾钠91g，溶于500mL蒸馏水中，加热至50℃，再依次加入3，5-二硝基水杨酸(DNS)3.5g，NaOH 20g，苯酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5g，搅拌完全溶解；冷却后用蒸馏水定容至1L；储于棕色瓶中4℃保存，放置一周后使用，使用前过滤。

6.一种如权利要求1或2所述的碱性纤维素酶菌株LT3的产酶条件初步优化，其特征在于：所述LT3菌株产酶培养基起始PH为7.0-8.5。

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