CN103917650B - 人源化的通用轻链小鼠 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种小鼠、组织、细胞和遗传物质，其包括人源化的重链免疫球蛋白基因座、表达通用轻链的人源化的轻链基因座和编码ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的基因。本申请提供了一种小鼠，其表达包括人可变结构域的人源化的重链，并且其表达包括人可变结构域的人源化的轻链，其中所述轻链衍生自不超过一个，或不超过两个轻链V和J或重排的V/J序列。本申请提供了表达具有通用轻链和人源化重链的抗体的可生育的雄性小鼠。本申请提供了用于制备双特异性结合蛋白的方法和组合物。

Description

人源化的通用轻链小鼠
技术领域
用于制备编码人免疫球蛋白重链可变结构域的序列和抗体包括双特异性抗体和包括包含通用轻链的双特异性抗体的基因修饰小鼠、细胞、胚胎、组织和分离的核酸。包括具有在内源性小鼠重链可变基因座的种系取代的基因修饰小鼠的组合物和方法，所述小鼠包括经修饰的轻链基因座，所述轻链基因座表达衍生自不超过一个或两个不同的轻链V基因片段的轻链，其中所述小鼠在其种系进一步经基因修饰以使得具有这些修饰的雄性小鼠能够繁殖。本申请提供了表达通用轻链和人源化的重链可变结构域的基因修饰小鼠，其中所述小鼠包含在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。
背景技术
用于人类治疗的抗体的发展具有漫长而复杂的历史。一个显著的进步已经使基本上完全人抗体序列能够用于设计有效的人用疗法，其具有降低的潜在免疫原性。现已存在的小鼠是在其种系中进行修饰以产生衍生自未经重排的基因片段(轻链和重链)的人抗体序列，所述未重排的基因片段要么作为基因修饰，要么作为在内源性小鼠的免疫球蛋白基因座的取代。在小鼠的内源性基因座中使用人的可变序列取代小鼠的可变序列，如人源化的小鼠，使得小鼠免疫***的功能基本上正常。其结果是，将这些小鼠暴露于所选择抗原会产生种类繁多、亚群丰富的克隆选择的B细胞，所述B细胞表达高亲和性体细胞突变的人可变结构域，所述结构域能够用于制备针对所选择抗原的完全人抗体。
在人源化小鼠中制备的人可变结构域能够用于设计完全的人双特异性抗体，即结合蛋白，其是重链的异源二聚体，其中重链可变结构域的识别和结合特异性不同。但是选择能够有效地与重链异源二聚体结合并表达的轻链尚没有简单的解决方案。在人源化的小鼠中开发用于人类治疗的人轻链可变结构域当 然是有可能的，但是选择与具有所需结合特性的重链有效地结合和表达的轻链并没有简单的解决方案，其中所述轻链不利于两条重链的表达或结合性能。
因此，本领域仍需要用于开发供人类治疗使用的人免疫球蛋白可变区的组合物和方法，包括由内源性小鼠免疫球蛋白基因座的核酸序列产生的人免疫球蛋白可变区。
发明概述
本申请描述了一种小鼠，所述小鼠表达人免疫球蛋白可变结构域，所述结构域适用于双特异性结合蛋白，包括双特异性抗体，其中所述小鼠包含内源性小鼠重链可变基因座的人源化，其中包含人源化的雄性小鼠具有生育能力，并且其中所述小鼠进一步包含内源性免疫球蛋白轻链基因座的人源化，其结果为使得小鼠表达免疫球蛋白轻链库，所述库衍生自不超过一个，或者不超过两个，λ和/或κV基因片段。
所提供的基因工程小鼠选择适宜的亲和成熟的人免疫球蛋白重链可变结构域，所述结构域衍生自未经重排的人重链V、D和J片段的库，其中所述亲和成熟的人重链可变结构域与人源化的通用轻链结合并表达。人源化的通用轻链由一个基因座表达，所述基因座包含不超过一个或不超过两个人轻链V片段和人J片段，其可操作地与轻链恒定基因连接，或者不超过一个或不超过两个编码与轻链恒定基因可操作地连接的轻链可变结构域的重排的(Vλ/Jλ、Vκ/Jκ、Vλ/Jκ或Vκ/Jλ)人核酸序列。在不同实施方式中，通用人源化的轻链结构域与多种亲和成熟的人重链可变结构域配对，其中所述的多种重链可变结构域与不同表位或抗原特异性的结合。
在一个方面，提供了用于制备小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法，所述小鼠包括人源化的重链免疫球蛋白可变基因座和人源化的轻链免疫球蛋白可变基因座，其中所述小鼠表达不超过两个通用轻链中的一个，并且雄性的小鼠表现出野生型的生育能力。
在一个方面，提供了一种经过修饰的小鼠，在其种系中在内源性的小鼠重链基因座中包含人源化的重链免疫球蛋白可变基因座和人源化的轻链免疫球蛋白可变基因座，其中所述小鼠表达通用轻链，并且其中所述小鼠包含编码小鼠 ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列。在不同实施方式中，所述人源化的轻链免疫球蛋白可变基因座在内源性的小鼠轻链基因座中。
在一个实施方式中，人源化的重链免疫球蛋白可变基因座包含在内源性小鼠重链可变基因座中全部或基本上全部有功能的小鼠免疫球蛋白重链V、D和J基因片段被一个或多个人V、人D和人J基因片段所取代，其中所述的一个或多个人V、D和J片段可操作地被连接并且能够重排以形成可操作地与重链恒定序列连接的重排V/D/J基因。
在一个实施方式中，所述小鼠包含设计成制备通用轻链的轻链基因座，其中所述通用轻链是衍生自包含不超过一个轻链V片段和不超过一个轻链J片段的轻链基因座或者包含单一重排的轻链V/J序列的轻链基因座的轻链。在一个实施方式中，所述小鼠包含包括单一人免疫球蛋白轻链V片段的免疫球蛋白轻链基因座，所述的V片段能够与人轻链J基因片段(选自一个或多个J片段)重排并且编码人轻链可变结构域。在另一个实施方式中，所述小鼠在轻链基因座包含不超过两个人轻链V片段，其中各V片段均能够与人J基因片段(选自一个或多个轻链J片段)重排并且编码重排的人轻链可变结构域。
在一个实施方式中，单一的人轻链V片段可操作地与人轻链J片段连接，所述J片段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5，其中所述的单一人轻链V片段能够重排以形成编码具有任意所述一个或多个人轻链J片段的轻链可变区域基因的序列。
在一个实施方式中，所述小鼠包含内源性的轻链基因座，其包含全部或基本上全部的小鼠V和J基因片段被不超过一个或不超过两个重排(V/J)的核酸序列所取代。在一个实施方式中，所述的不超过一个或不超过两个重排(V/J)的核酸序列选自人Vκ1-39Jκ5、Vκ3-20Jκ1及其组合。
在一个实施方式中，所述小鼠缺乏有功能的内源性轻链基因座，所述基因座能够表达小鼠轻链可变结构域。在一个实施方式中，所述小鼠在κ基因座包含编码通用轻链可变结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠在λ基因座包含编码通用轻链可变结构域的核酸序列。
在一个实施方式中，所述人V片段(或重排的V/J序列)可操作地与人或小鼠前导序列连接。在一个实施方式中，所述前导序列是小鼠前导序列。在一个 特定实施方式中，所述小鼠前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。
在一个实施方式中，所述人V片段(或重排的V/J序列)可操作地与免疫球蛋白启动子序列连接。在一个实施方式中，所述启动子序列是人启动子序列。在一个特定实施方式中，所述人免疫球蛋白启动子是人Vκ3-15启动子。
在一个实施方式中，所述未经重排的V和J片段或者重排的(V/J)序列可操作地与轻链免疫球蛋白恒定区基因连接。在一个特定实施方式中，所述恒定区基因是小鼠Cκ基因。
在一个实施方式中，所述未经重排的V和J片段或者重排的(V/J)序列存在于κ轻链基因座，并且所述κ轻链基因座包含小鼠κ内含子增强子、小鼠κ3’增强子或者即包含内含子增强子又包含3’增强子。在一个特定实施方式中，所述κ基因座是内源性κ基因座。
在一个实施方式中，所述小鼠包含κ基因座，其包含编码通用轻链的可变结构域的序列，并且所述小鼠包含不具有功能的免疫球蛋白λ轻链基因座。在一个特定实施方式中，所述λ轻链基因座包含一个或多个基因座的序列缺失，其中所述一个或多个缺失使得λ轻链基因座不能重排形成轻链基因。在另一个实施方式中，λ轻链基因座中的全部或基本上全部的V片段缺失。在另一个实施方式中，所述小鼠包含全部或基本上全部内源性轻链可变基因座的缺失。
在一个实施方式中，所述小鼠在其种系中进一步包含选自下述的序列：针对重排的免疫球蛋白轻链序列或未经重排的基因片段的小鼠κ5’内含子增强子、小鼠κ3’增强子及其组合。
在一个实施方式中，所述小鼠的通用轻链可变结构域序列包括一个或多个体细胞超突变；在一个实施方式中，所述可变结构域序列包括多个体细胞超突变。
在一个实施方式中，所述小鼠产生包含体细胞突变的人可变结构域的通用轻链。在一个实施方式中，所述轻链包含衍生自人V片段、人J片段和小鼠Cκ基因的体细胞突变的人可变结构域。在一个实施方式中，所述小鼠不表达λ轻链。
在一个实施方式中，所述人可变序列是重排的人Vκ1-39Jκ5序列，并且所述小鼠表达反向嵌合轻链，所述反向嵌合轻链包含(i)衍生自Vκ1-39Jκ5的可 变结构域和(ii)小鼠CL；其中所述轻链与反向嵌合重链结合，所述反向嵌合重链包含(i)小鼠CH和(ii)体细胞突变的人重链可变结构域。在一个实施方式中，所述小鼠表达体细胞突变的轻链。在一个实施方式中，所述CL是小鼠Cκ。
在一个实施方式中，所述人可变序列是重排的人Vκ3-20Jκ1序列，并且所述小鼠表达反向嵌合轻链，所述反向嵌合轻链包含(i)衍生自Vκ3-20Jκ1的可变结构域和(ii)小鼠CL；其中所述轻链与反向嵌合重链结合，所述反向嵌合重链包含(i)小鼠CH和(ii)体细胞突变的人重链可变结构域。
在一个实施方式中，所述小鼠包含重排的人Vκ1-39Jκ5序列和重排的人Vκ3-20Jκ1序列，并且所述小鼠表达反向嵌合轻链，所述反向嵌合轻链包含(i)包含衍生自Vκ1-39Jκ5序列或Vκ3-20Jκ1序列的可变结构域的轻链，和(ii)小鼠CL；其中所述轻链与反向嵌合重链结合，所述反向嵌合重链包含(i)小鼠CH和(ii)体细胞突变的人重链可变结构域。在一个实施方式中，所述小鼠表达体细胞突变的轻链。在一个实施方式中，所述CL是小鼠Cκ。
在一个实施方式中，所述小鼠表达反向嵌合抗体，所述反向嵌合抗体包含包括小鼠Cκ和衍生自重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列的体细胞突变的人可变结构域的轻链，以及包括小鼠CH和体细胞突变的人重链可变结构域的重链，其中所述小鼠不表达完全的小鼠抗体，也不表达完全的人抗体。在一个实施方式中，所述小鼠包含包括内源性的小鼠κ轻链基因片段被重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列取代的κ轻链基因座，并且包含全部或基本上全部的内源性小鼠重链V、D和J基因片段被完全或基本上完全人重链V、D和J基因片段的库所取代。
在一个方面，提供了基因修饰小鼠，所述小鼠表达衍生自不超过一个或不超过两个重排的κ轻链序列的单一κ轻链，其中所述小鼠在使用抗原免疫接种后显示出的血清滴度与使用相同抗原免疫的野生型小鼠相当。在一个特定实施方式中，所述小鼠表达单一κ轻链序列，其中所述单一κ轻链序列衍生自不超过一个重排的κ轻链序列。在一个实施方式中，所述血清滴度以总免疫球蛋白表征。在一个特定实施方式中，所述血清滴度以IgM特异性滴度表征。在一个特定实施方式中，血清滴度以IgG特异性滴度表征。在一个更特别的实施方式中，所述重排的κ轻链序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1序列。在一个实施方式中，所 述重排的κ轻链序列是κ1-39Jκ5序列。在一个实施方式中，所述重排的κ轻链序列是Vκ3-20Jκ1序列。
在一个方面，提供了表达多种与单一轻链序列结合的免疫球蛋白重链的基因修饰小鼠。在一个实施方式中，所述重链包含人序列。在不同实施方式中，所述人序列选自可变序列、CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述单一轻链包含人序列。在不同实施方式中，所述人序列选自可变序列、恒定序列及其组合。在一个实施方式中，所述小鼠包含无效的内源性免疫球蛋白基因座并且通过基因修饰或染色体外游离基因表达重链和/或轻链。在一个实施方式中，所述小鼠包含取代，所述取代是指一些或全部内源性小鼠重链基因片段(即，V、D、J)，和/或一些或全部内源性小鼠重链恒定序列(例如，CH1、铰链、CH2、CH3或其组合)，和/或一些或全部内源性小鼠轻链序列(例如，V、J、恒定区或其组合)的内源性小鼠基因座被一个或多个人免疫球蛋白序列取代。
在一个实施方式中，经过一个或多个V、D和J基因片段，或者一个或多个V和J基因片段重排后，所述小鼠在其基因组中包含至少一个编码小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，经过重排后，所述小鼠在其基因组中包含至少两个编码小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，经过重排后，所述小鼠在其基因组中包含至少一个编码小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠在B细胞中包含ADAM6基因或其直系同源物或同系物或功能性片段。
在一个实施方式中，所述雄性小鼠在内源性ADAM6基因座包含单一未经修饰的内源性ADAM6等位基因或其直系同源物或同系物或功能性片段。
在一个实施方式中，所述雄性小鼠在小鼠基因组大致位于内源性小鼠ADAM6等位基因的位置包含ADAM6序列或其同系物或其直系同源物或功能性片段，例如在最后一个V基因片段序列的3’和第一个D基因片段的5’。
在一个实施方式中，所述雄性小鼠在编码免疫球蛋白可变区基因片段的上游、下游或者上游和下游(相对于ADAM6序列的转录方向)的翼侧包含ADAM6序列或其同系物或直系同源物或功能性片段。在一个特定实施方式中，所述免疫 球蛋白可变区基因片段是人基因片段。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变区基因片段是人基因片段，并且在小鼠中编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的序列在人V基因片段之间；在一个实施方式中，所述小鼠包含两个或多个人V基因片段，并且所述序列位于最后一个V基因片段和倒数第二个V基因片段之间；在一个实施方式中，所述序列位于最后一个V基因片段和第一个D基因片段之间。
在一个实施方式中，所述人源化的重链免疫球蛋白可变基因座缺乏内源性的小鼠ADAM6基因。在一个实施方式中，所述人源化的重链免疫球蛋白可变基因座包含在雄性小鼠中具有功能的ADAM6基因。在一个特定实施方式中，在雄性小鼠中具有功能的ADAM6基因是小鼠ADAM6基因，并且所述小鼠ADAM6基因位于人源化的重链免疫球蛋白可变基因座内部或与之紧邻。
在一个实施方式中，所述人源化的重链免疫球蛋白可变基因座缺乏内源性的小鼠ADAM6基因，并且所述小鼠包含在雄性小鼠中具有功能的异位ADAM6序列。在一个实施方式中，在雄性小鼠中具有功能的异位ADAM6基因是小鼠ADAM6基因。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6基因与所述人源化的重链免疫球蛋白可变基因座在相同的染色体上。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6基因与所述人源化的重链免疫球蛋白可变基因座在不同的染色体上。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6基因在游离基因上。
在一个实施方式中，所述小鼠包含第一内源性的重链等位基因和第二内源性的重链等位基因，并且所述第一内源性的重链等位基因包含小鼠ADAM6基因座的缺失，而且所述第一内源性的重链等位基因包含全部或基本上全部的有功能的小鼠V、D和J片段被一个或多个人V、D和J片段取代。在一个实施方式中，所述第一和第二内源性的重链等位基因均包含内源性小鼠ADAM6基因座的缺失，并且所述第一和第二内源性的重链等位基因包含全部或基本上全部的有功能的小鼠V、D和J片段被一个或多个人V、D和J片段取代。在一个实施方式中，所述第一和/或第二等位基因包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的异位核酸序列。在一个实施方式中，所述异位核酸序列位于最后一个小鼠V基因片段的3’(相对于重链可变基因座的转录方向)和位于小鼠(或嵌合的人/小鼠)重链恒定基因或其片段(例如，编码人和/或小鼠的核酸序列： CH1和/或铰链和/或CH2和/或CH3)的5’(相对于恒定序列的转录方向)。在一个实施方式中，所述异位核酸序列位于V片段的下游(相对于V片段基因座的转录方向)和D片段的上游。在一个实施方式中，所述异位核酸序列位于倒数第二个最靠3’的V片段与最后一个最靠3’的V片段之间。在一个特定实施方式中，所述异位核酸序列位于人V片段VH1-2与人V片段VH6-1之间。在一个实施方式中，在两个人V基因片段之间的核苷酸序列与人V基因片段相比位于相反的转录方向。在一个特定实施方式中，相对于ADAM6基因的转录方向，核苷酸序列从5’至3’依次编码ADAM6a序列和ADAM6b序列。在一个特定实施方式中，ADAM6基因的转录方向与V片段翼侧的上游和下游相反。
在一个实施方式中，所述核酸序列包含编码小鼠ADAM6a或其功能性片段的序列和/或编码小鼠ADAM6b或其功能性片段的序列，其中所述ADAM6a和/或ADAM6b或其功能性片段可操作地与启动子连接。在一个实施方式中，所述启动子是人启动子。在一个实施方式中，所述启动子是小鼠ADAM6启动子。在一个特定实施方式中，所述ADAM6启动子包含序列，所述序列位于与小鼠最靠5’的DH基因片段最接近的第一个ADAM6基因的第一个密码子与最靠5’的DH基因片段的重组信号序列之间，其中5’指相对于小鼠免疫球蛋白基因转录的方向。在一个实施方式中，所述启动子是病毒启动子。在一个特定实施方式中，所述病毒启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。在一个实施方式中，所述启动子是泛素启动子。
在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6a和/或ADAM6b选自如SEQ IDNO：1所示的ADAM6a和/或如SEQ ID NO：2所示的ADAM6b序列。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子是如SEQ ID NO：3所示的启动子。在一个特定实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子包含紧靠ADAM6a的第一个密码子上游的(相对于ADAM6a转录的方向)如SEQ ID NO：3所示的核酸序列，并且延伸至ADAM6编码区的上游的SEQ ID NO：3的末端。在另一个特定实施方式中，ADAM6启动子是从ADAM6a起始密码子上游约5至约20个核苷酸延伸至ADAM6a起始密码子上游约0.5kb、1kb、2kb或3kb或更多的片段。
在一个实施方式中，所述核酸序列包含SEQ ID NO：3或其片段，当将其置于由于缺乏ADAM6而不育或生育能力较低的小鼠中时，可以改善生育能力或将 生育能力恢复至约野生型生育能力水平。在一个实施方式中，SEQ ID NO：3或其片段赋予雄性小鼠产生能够穿过雌性小鼠的输卵管以使得小鼠的卵子受精的***细胞的能力。
在一个实施方式中，所述小鼠包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同系物或功能片段的核酸序列。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在包含一个或多个免疫球蛋白可变区基因片段的人核酸序列内或与之邻近。在一个实施方式中，所述一个或多个免疫球蛋白可变区基因片段在经过修饰的内源性小鼠免疫球蛋白重链可变基因座中。在一个实施方式中，所述修饰包括全部或基本上全部有功能的小鼠免疫球蛋白重链可变基因片段被多个与内源性小鼠恒定区基因可操作地连接的未重排的人重链基因片段取代。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在两个人V片段之间。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在人V片段与人D片段之间。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在人D片段与人J片段之间。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在最靠5’端的人V片段上游(相对于V片段转录的方向)。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在人J片段与内源性小鼠重链恒定区基因序列之间。
在一个实施方式中，所述雄性小鼠能够通过交配产生后代，其频率大致与野生型小鼠相同。在一个实施方式中，所述雄性小鼠产生能够由小鼠的子宫转移至小鼠的输卵管使小鼠卵子受精的***；在一个特定实施方式中，小鼠的***转移通过输卵管的效率与野生型小鼠的***相当。在一个实施方式中，在小鼠中产生的约50％或更多的***能够进入和/或穿过输卵管以使小鼠的卵子受精。
在一个实施方式中，所述小鼠缺乏有功能的内源性ADAM6基因座，其中所述小鼠包含补偿了雄性小鼠中缺失的小鼠ADAM6功能的异位核苷酸序列。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列使雄性小鼠产生后代的能力，该能力与含有有功能的内源性ADAM6基因的野生型雄性小鼠相当。在一个实施方式中，所述序列使小鼠能够在小鼠的***细胞表面上形成ADAM2和/或ADAM3和/或ADAM6的复合物。在一个实施方式中，所述序列使小鼠的***能够穿过小鼠子宫进入小鼠输卵管与小鼠卵子接触使得小鼠卵子受精。
在一个实施方式中，所述小鼠缺乏有功能的内源性ADAM6基因座并且包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或其直系同源物或同系物或片段的异位 核苷酸序列，并且其中所述雄性小鼠在6个月内产生的胎仔数为同龄和同品系野生型小鼠的至少约50％、60％、70％、80％或90％。
在一个实施方式中，所述缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且包含异位核苷酸序列的小鼠在喂养6个月时间段内与缺乏有功能的内源性ADAM6基因且缺乏异位核苷酸序列并且在基本上相同的条件下饲养基本上相同时间的同龄和相同或相近品系的小鼠相比产生的后代多至少约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约4倍、约6倍、约7倍、约8倍或约10倍或者更多。
在一个实施方式中，所述缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且包含异位核苷酸序列的小鼠在4或6个月的饲养期内与缺乏有功能的内源性ADAM6基因且缺乏异位核苷酸序列且饲养相同时间的小鼠相比每窝产生平均高至少约2倍、3倍或4倍的胎仔数。
在一个实施方式中，所述缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且包含异位核苷酸序列的小鼠是雄性小鼠，并且所述雄性小鼠产生的***当在交配后约5-6小时从输卵管中回收后其反映出的输卵管迁移为缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠***的至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、100倍、110倍或120倍或者更高。
在一个实施方式中，所述缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且包含异位核苷酸序列的小鼠当与雌性小鼠交配时产生的***能够在约6小时内以与野生型小鼠大致相等的效率穿过子宫并且进入和穿过输卵管。
在一个实施方式中，所述缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且包含异位核苷酸序列的小鼠在相当的时间段内与缺乏有功能的ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠相比产生约1.5倍、约2倍、约3倍或约4倍或者更多的胎仔。
在一个方面，提供了包含人源化的内源性小鼠重链可变免疫球蛋白基因座和经修饰的小鼠轻链免疫球蛋白基因座的小鼠，其中所述小鼠表达包含可操作地与人或小鼠重链恒定区基因序列连接的重排的人重链免疫球蛋白序列的B细胞，并且所述B细胞在其基因组中(例如，在B细胞的染色体中)包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或其直系同源物或同系物或片段的基因(例如小鼠ADAM6基因，例如小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b)，其中所述小鼠免疫球 蛋白λ或κ轻链的可变结构域衍生自不超过一个或不超过两个轻链V基因片段。
在一个实施方式中，可操作地与重链恒定区基因序列连接的重排的免疫球蛋白序列包含人重链V、D和/或J序列；小鼠重链V、D和/或J序列；人或小鼠轻链V和/或J序列。在一个实施方式中，所述重链恒定区基因序列包含选自由CH1、铰链、CH2、CH3及其组合组成的组的人或小鼠重链序列。
在一个方面，提供了适于制备具有相同轻链的抗体的小鼠，其中在小鼠中制备的全部或基本上全部的抗体同相同的轻链一起表达，其中所述轻链包含人可变结构域，并且其中所述抗体包含包括人可变结构域的重链。
在一个方面，提供了一种小鼠，其特征为所述小鼠不能产生表达衍生自非人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1序列的重排轻链序列的免疫球蛋白轻链可变结构域的B细胞。
在一个实施方式中，所述小鼠的κ：λ轻链比大致与包含野生型免疫球蛋白轻链V和J基因片段互补染色体的小鼠相同。
在一个方面，本申请所描述的小鼠表达衍生自人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1序列的免疫球蛋白链，其中所述小鼠包含全部或基本上全部的内源性小鼠重链可变区基因片段被一个或多个人重链可变区基因片段所取代，并且所述小鼠显示出的(a)表达具有λ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞与(b)表达具有κ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞之比为约1至约20。
在一个实施方式中，所述小鼠表达单一的κ轻链，其中所述单一的κ轻链衍生自人Vκ1-39Jκ5序列，并且表达具有λ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞之比为约1至约20；在一个实施方式中，所述比率为约1至至少约66；在一个特定实施方式中，所述比率为约1至66。
在一个实施方式中，所述小鼠表达单一的κ轻链，其中所述单一的κ轻链衍生自人Vκ3-20Jκ5序列，并且表达具有λ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞之比为约1至约20；在一个实施方式中，所述比率为约1至约21。在特定实施方式中，所述比率为1至20，或者1至21。
在一个实施方式中，小鼠中的Igκ+Igλ+B细胞百分率大致与野生型小鼠相 同。在一个特定实施方式中，在小鼠中Igκ+Igλ+B细胞的百分率为约2％至约6％。在一个特定实施方式中，在单一重排的κ轻链衍生自Vκ1-39Jκ5序列的小鼠中Igκ+Igλ+B细胞的百分率为约2至约3；在一个特定实施方式中，约2.6。在一个特定实施方式中，在单一重排的κ轻链衍生自Vκ3-20Jκ1序列的小鼠中Igκ+Igλ+B细胞的百分率为约4至约8；在一个特定实施方式中，约6。
在一个实施方式中，所述小鼠不包含降低或消除小鼠体细胞突变任意有功能的轻链基因座的能力的修饰。在一个实施方式中，在小鼠中所述仅有的功能性轻链基因座表达包含人可变结构域的轻链，所述人可变结构域衍生自选自人Vκ1-39Jκ5序列、人Vκ3-20Jκ1序列及其组合的重排序列。
在一个方面，提供了表达单一κ轻链的基因修饰小鼠，所述κ轻链衍生自不超过一个，或不超过两个重排的κ轻链序列，其中所述小鼠显示出的κ轻链的使用比携带完整的或基本完整的人κ轻链基因座的小鼠显示出的相同κ轻链(即，衍生自相同V片段和相同J片段，或者衍生自相同重排的V/J片段)的使用多至少约100倍或更高、至少约200倍或更高、至少约300倍或更高、至少约400倍或更高、至少约500倍或更高、至少约600倍或更高、至少约700倍或更高、至少约800倍或更高、至少约900倍或更高、至少约1000倍或更高。在一个特定实施方式中，携带完整的或基本完整的人κ轻链基因座的小鼠缺乏有功能的未经重排的小鼠κ轻链序列。在一个特定实施方式中，所述小鼠表达来自不超过一个重排的κ轻链序列的单一κ轻链。在一个实施方式中，所述小鼠包含一个拷贝的重排的κ轻链序列(例如，杂合子)。在一个实施方式中，所述小鼠包含两个拷贝的重排的κ轻链序列(例如，纯合子)。在更特定的实施方式中，所述重排的κ轻链序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1序列。在一个实施方式中，所述重排的κ轻链序列是Vκ1-39Jκ5序列。在一个实施方式中，所述重排的κ轻链序列是Vκ3-20Jκ1序列。
在一个方面，提供了表达衍生自不超过一个或不超过两个重排的κ轻链序列的单一轻链的基因修饰小鼠，其中在基因修饰小鼠中所述轻链的表达水平比携带完整的或基本完整的人κ轻链可变基因座的小鼠显示出的相同重排轻链的表达高至少10倍至约1000倍、100倍至约1000倍、200倍至约1000倍、300倍至约1000倍、400倍至约1000倍、500倍至约1000倍、600倍至约1000倍、700 倍至约1000倍、800倍至约1000倍或900倍至约1000倍。在一个实施方式中，所述轻链包含人序列。在一个实施方式中，所述轻链衍生自选自人Vκ1-39Jκ5、人Vκ3-20Jκ1及其组合的重排的κ轻链序列。
在一个实施方式中，出于对轻链的表达与在包含基本上完整的人源化轻链可变基因座小鼠中的表达进行比较的目的，通过对转录的轻链序列(来自一个或两个重排的序列)的mRNA进行定量表征所述轻链的表达水平，并且将其与携带完整的或基本上完整的轻链基因座的小鼠所转录的轻链序列进行比较。
在一个方面，提供了一种制备抗体的方法，所述方法包括在细胞中表达(a)与人CH基因序列融合的如本申请所述的免疫小鼠的第一人重链可变结构域核酸序列；(b)与人CL基因序列融合的如本申请所述的免疫小鼠的人轻链可变结构域核酸序列；和(c)将所述细胞保持在足以表达全人抗体的条件下，并且分离所述抗体。在一个实施方式中，所述细胞包含与人CH基因序列融合的如本申请所述的第二免疫小鼠的第二人重链可变结构域核酸序列，所述第一重链核酸序列编码识别第一表位的第一重链可变结构域，并且所述第二重链核酸序列编码识别第二表位的第二重链可变结构域，其中所述第一表位和第二表位是不同的。
在一个方面，提供了一种制备表位结合蛋白的方法，所述方法包括将本申请所述的小鼠与包含所关注的表位的抗原接触，将小鼠保持在足以使小鼠产生与所关注的表位特异性结合的免疫球蛋白的条件下，并且分离与所关注的表位特异性结合的免疫球蛋白分子；其中所述表位结合蛋白包括重链，所述重链包括体细胞突变的人可变结构域和小鼠CH，所述小鼠CH与包含小鼠CL和衍生自重排的人Vκ1-39Jκ5或重排的人Vκ3-20Jκ1的人可变结构域的轻链结合。
在一个方面，提供了一种制备双特异性抗原结合蛋白的方法，所述方法包括将如本申请所述的第一小鼠与包含第一表位的所关注的第一抗原接触，将如本申请所述的第二小鼠与包含第二表位的所关注的第二抗原接触，使所述第一和第二小鼠均针对所关注的抗原产生免疫应答，鉴定在第一小鼠中与所关注的第一抗原的第一表位结合的第一人重链可变区，鉴定在第二小鼠中与所关注的第二抗原的第二表位结合的第二人重链可变区，制备编码与所关注的第一抗原的第一表位结合的第一重链的第一全人重链基因，制备编码与所关注的第二抗 原的第二表位结合的第二重链的第二全人重链基因，在表达衍生自人Vκ1-39或人Vκ3-20基因片段的单一全人轻链的细胞中表达第一重链和第二重链以形成双特异性抗原结合蛋白，并且分离所述双特异性抗原结合蛋白。
在一个实施方式中，所述第一抗原和第二抗原是不同的。
在一个实施方式中，所述第一抗原和第二抗原是相同的，但所述第一表位和第二表位是不同的。在一个实施方式中，所述第一重链可变区与第一表位的结合不会阻断所述第二重链可变区域与第二表位的结合。
在一个实施方式中，所述第一抗原选自可溶性抗原和细胞表面抗原(例如，肿瘤抗原)，并且所述第二抗原包含细胞表面受体。在一个特定实施方式中，所述细胞表面受体是免疫球蛋白受体。在一个特定实施方式中，所述免疫球蛋白受体是Fc受体。在一个实施方式中，所述第一抗原和第二抗原是相同的细胞表面受体，并且所述第一重链与第一表位的结合不会阻断所述第二重链与第二表位的结合。
在一个实施方式中，所述轻链的轻链可变结构域包含2至5个体细胞突变。在一个实施方式中，所述轻链可变结构域是体细胞突变的同源轻链，所述同源轻链在第一或第二小鼠的B细胞中同第一或第二重链可变结构域一同表达。
在一个方面，提供了表达表位结合蛋白的细胞，其中所述细胞包括：(a)编码衍生自重排的人Vκ1-39Jκ5或重排的人Vκ3-20Jκ1的人轻链可变结构域的人核苷酸序列，其中所述人核酸序列(直接或通过接头)与人免疫球蛋白轻链恒定结构域核酸序列(例如，人κ恒定结构域DNA序列)融合；和(b)编码衍生自第一人重链可变结构域核苷酸序列的人重链可变结构域的第一人重链可变结构域核酸序列，其中所述第一人重链可变结构域核苷酸序列(直接或通过接头)与人免疫球蛋白重链恒定结构域核酸序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgE序列)融合；其中所述表位结合蛋白识别第一表位。在一个实施方式中，所述表位结合蛋白结合第一表位的解离常数低于10-6M、低于10-8M、低于10-9M、低于10-10M、低于10-11M或低于10-12M。在一个实施方式中，所述细胞包含编码第二人重链可变结构域的第二人核苷酸序列，其中所述第二人序列(直接或通过接头)与人免疫球蛋白重链恒定结构域核酸序列融合，并且其中所述第二人重链可变结构域不特异性地识别第一表位(例如，显示出例如10-6M、10-5 M、10-4M或更高的解离常数)，并且其中所述表位结合蛋白与第一表位和第二表位结合，并且其中所述第一和第二免疫球蛋白重链均与(a)的轻链结合。在一个实施方式中，所述第二VH结构域与第二表位结合的解离常数低于10-6M、低于10-7M、低于10-8M、低于10-9M、低于10-10M、低于10-11M或低于10-12M。
在一个实施方式中，所述表位结合蛋白包含第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白重链，其均与通用轻链(例如，衍生自选自人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1的重排的人轻链可变序列的轻链)结合，其中所述第一免疫球蛋白重链与第一表位结合的解离常数在纳摩(例如，1nM至100nM)至皮摩(例如，1pM至100pM)范围内，所述第二免疫球蛋白重链与第二表位结合的解离常数在纳摩至皮摩范围内(例如，1pM至100nM)，所述第一表位和第二表位是不同的，所述第一免疫球蛋白重链不与第二表位结合或与第二表位以弱于微摩范围(例如，毫摩范围)的解离常数结合，所述第二免疫球蛋白重链不与第一表位结合或与第一表位以弱于微摩范围(例如，毫摩范围)的解离常数结合，并且所述第二免疫球蛋白重链的一个或多个可变结构域(即，一个或多个轻链可变结构域、第一免疫球蛋白重链的重链可变结构域和重链可变结构域)是体细胞突变的。在一个实施方式中，所述表位结合蛋白与第一表位的结合不会阻断所述表位结合蛋白与第二表位的结合。
在一个实施方式中，所述第一免疫球蛋白重链包含野生型蛋白A结合决定簇，并且所述第二重链缺乏野生型蛋白A结合决定簇。在一个实施方式中，在分离条件下所述第一免疫球蛋白重链结合蛋白A，并且在分离条件下所述第二免疫球蛋白重链不结合蛋白A或者其与蛋白A的结合比第一免疫球蛋白重链与蛋白A的结合弱至少10倍、百倍或千倍。在一个特定实施方式中，所述第一和第二重链是IgG1同种型，其中所述第二重链包含选自95R(EU435R)、96F(EU436F)及其组合的修饰，并且其中所述第一重链缺乏这种修饰。
在一个方面，本申请所述的小鼠、胚胎或细胞包含保留了内源性调节或控制元件的κ轻链基因座，例如小鼠κ内含子增强子、小鼠κ3’增强子或者内含子增强子和3’增强子，其中所述调节或控制元件促进κ轻链基因座表达的序列的体细胞突变和亲和突变。
在一个方面，提供了分离自本申请所述的小鼠的小鼠细胞。在一个实施方式中，所述细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述细胞是淋巴细胞。在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述B细胞表达嵌合重链，其包含衍生自人V基因片段的可变结构域；和轻链，其衍生自(a)重排的人Vκ1-39/J序列，(b)重排的人Vκ3-20/J序列或(c)其组合；其中所述重链可变结构域与小鼠的恒定区融合并且所述轻链可变结构域与小鼠或人的恒定区融合。在一个实施方式中，所述小鼠细胞包含至少一个编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的基因。在一个实施方式中，所述细胞是B细胞且B细胞包含编码重排的人重链免疫球蛋白可变结构域的序列和编码通用轻链可变结构域的序列，其中所述B细胞在染色体上包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或同系物或片段的核酸序列；在一个实施方式中，所述小鼠B细胞包含核酸序列的两个等位基因。
在一个方面，提供了一种小鼠细胞，其包含包括人源化的免疫球蛋白重链基因座的第一染色体，所述基因座包含未经重排的人V、D和J片段；包含人源化的免疫球蛋白轻链基因座的第二染色体，所述轻链基因座编码或能够重排以编码轻链，其中所述轻链基因座包含与轻链恒定区基因可操作地连接的不超过一个V片段(或不超过两个V片段)和不超过一个J片段(或不超过两个J片段)，或者与轻链恒定基因可操作地连接的不超过一个或不超过两个重排的轻链V/J序列；和包含编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或片段的核酸序列的第三染色体。在一个实施方式中，第一和第三染色体是相同的。在一个实施方式中，第二和第三染色体是相同的。在一个实施方式中，第一、第二和第三染色体均是不同的。在一个实施方式中，所述编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列存在于两个拷贝中。在一个实施方式中，所述细胞是体细胞。在一个特定实施方式中，所述体细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是干细胞。
在一个方面，提供了一种杂交瘤，其中所述杂交瘤使用如本申请所述的小鼠的B细胞制备。在一个特定实施方式中，所述B细胞来自于经包含所关注表位的抗原免疫的如本申请所述的小鼠，并且所述B细胞表达与所关注的表位结合的结合蛋白，所述结合蛋白具有体细胞突变的人重链可变结构域和小鼠重链 恒定区，并且具有衍生自重排的人Vκ1-39Jκ5或重排的人Vκ3-20Jκ1的人轻链可变结构域和小鼠CL。
在一个方面，提供了一种细胞，其包含全人重链基因，所述基因包含编码如本申请所述的小鼠第一重链可变结构域的核酸序列，和全人轻链基因，所述全人轻链基因包含编码如申请所述的通用轻链序列的核酸序列。在一个实施方式中，所述细胞进一步包含编码如本申请所述的小鼠第二重链可变结构域的核酸序列，其中所述第一和第二重链可变结构域是不同的。在一个实施方式中，所述细胞选自CHO、COS、293、HeLa和表达病毒核酸序列的视网膜细胞(例如，PERC.6TM细胞)。
在一个方面，提供了一种小鼠的胚胎，其中所述胚胎包含衍生自如本申请所述的小鼠的供体ES细胞。
在一个方面，提供了包含如本申请所述的基因修饰的小鼠胚胎的用途，其中所述用途包含制备如本申请所述的基因修饰小鼠。
在一个方面，提供了在如本申请所述的小鼠中制备的抗体的人重链可变结构域和人轻链可变结构域的氨基酸序列。
在一个方面，提供了在如本申请所述的小鼠中制备的抗体的人重链可变结构域和人轻链可变结构域的核苷酸序列。
在一个方面，提供了在如本申请所述的小鼠中制备的抗体或其抗原结合蛋白或抗原结合片段(例如，Fab、F(ab)2、scFv)。
在一个方面，提供了使用如本申请所述的目标载体、核苷酸构建体或细胞制备的小鼠。
在一个方面，提供了如本申请所述的第一小鼠与野生型小鼠或基因修饰的第二小鼠交配得到的后代。
在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠制备全人抗体，或包含免疫球蛋白可变结构域或其功能性片段的全人抗体结合蛋白的用途。
在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠或组织或细胞制备全人双特异性抗体的用途。
在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠制备的核酸序列的用途，其中所述用途包含在人用治疗剂的生产中表达所述核酸序列。
在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠制备永生化的细胞系的用途。
在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠制备杂交瘤或四价体瘤的用途。
在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠制备编码免疫球蛋白可变区或其片段的核酸序列的用途。在一个实施方式中，所述核酸序列用于制备人抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，所述小鼠用于制备选自抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、scFv、双-scFV、双体、三体、四体、V-NAR、VHH、VL、F(ab)、F(ab)2、DVD(即，双可变结构域抗原结合蛋白)、SVD(即，单一可变结构域抗原结合蛋白)或双特异性T细胞接合子(BiTE)的抗原结合蛋白。
在一个方面，提供了为了治疗人类疾病或病变，本申请所述的小鼠用于制备药物(例如，抗原结合蛋白)，或者用于制备编码药物(例如，抗原结合蛋白)的可变序列的序列的用途。
除非另有说明或者从上下文中显而易见，否则本申请中所述的任意实施方式和方面可以彼此结合使用。通过随后描述的概述，其他实施方式对本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图简述
图1A显示了约1兆碱基(Mb)的人免疫球蛋白重链可变基因座(空心符号)对约3兆碱基(Mb)的小鼠免疫球蛋白重链可变基因座(实心符号)的直接基因组置换的大致图示，但未按比例绘制。
图1B显示了约0.5兆碱基(Mb)的人免疫球蛋白κ轻链可变基因座的两个几乎相同的重复单元中的第一个或近端重复单元(空心符号)对约3兆碱基(Mb)的小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座(实心符号)的直接基因组置换的大致图示，但未按比例绘制。
图2A显示了用于对小鼠免疫球蛋白重链可变基因座进行直接基因组置换的三个起始步骤(A-C)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换使得所有小鼠VH、DH和JH基因区段缺失并被三个人VH、所有人DH和JH基因区段置换。示出了用于首次***人免疫球蛋白重链基因区段的目标载体(3hVH BACvec)，其具有67kb5’小鼠同源臂、选择表达盒(空心矩形)、位点特异性重组位点(空心三角形)、145kb人基因组片段和8kb3’小鼠同源臂。示出了从随后的目标载体***的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段、额外的选择表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。
图2B显示了用于对小鼠免疫球蛋白重链可变基因座进行直接基因组置换的六个额外步骤(D-I)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换***了77个额外的人VH基因区段并去除了最后一个选择表达盒。示出了用于将额外的人VH基因区段***到人重链基因区段的初始***物(3hVH-CRE杂合等位基因)中的目标载体(18hVH BACvec)，其具有20kb5’小鼠同源臂、选择表达盒(空心矩形)、196kb人基因组片段和62kb人同源臂，所述人同源臂与人重链基因区段的初始***物的5’端部分重叠，所述5’端被显示具有位于人基因区段5’的位点特异性重组位点(空心三角形)。显示了由随后的目标载体***的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段和额外的选择表达盒(空心矩形)。
图2C显示了用于对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座进行直接基因组置换的三个初始步骤(A-C)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换使所有的小鼠Vκ和Jκ基因区段缺失(Igκ-CRE杂合等位基因)。显示了从目标载体***的选择表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。
图2D显示了用于对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座进行直接基因组置换的五个额外步骤(D-H)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换***了近端重复单元的所有人Vκ和Jκ基因区段并使最后一个选择表达盒缺失(40hVκdHyg杂合等位基因)。显示了由随后的目标载体***的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段和额外的选择表达盒(空心矩形)。
图3A显示了定量PCR(qPCR)引物/探针组的定位，以筛选ES细胞来***人重链基因序列和丧失小鼠重链基因序列的大致图示。显示了在ES细胞和小鼠中筛选第一人重链***物的策略，qPCR引物/探针针对未经修饰的小鼠染色体(上图)和被正确靶向的染色体(下图)上的缺失的区域(“丧失”探针C和D)、***的区域(“hIgH”探针G和H)和侧接区域(“保留”探针A、B、E和F)。
图3B显示了亲本ES细胞和被修饰ES细胞中人免疫球蛋白重链基因区段的 第一***物的实测探针拷贝数量的代表性计算结果。探针A到F的实测探针拷贝数量被计算为2/2ΔΔCt。ΔΔCt被计算为ave[ΔCt(样品)-medΔCt(对照)]，其中ΔCt是测试探针与参考探针(参考探针在4个与6个之间，这取决于分析)之间的Ct差值。术语medΔCt(对照)是来自亲本ES细胞的多个(＞60个)非靶向DNA样品的中值ΔCt。每个被修饰的ES细胞克隆被重复分析六次。为了计算亲本ES细胞中的IgH探针G和H的拷贝数，假定这些探针在被修饰ES细胞中的拷贝数为1，并且使用的最大Ct为35，即使没有观察到扩增。
图3C显示了仅使用探针D和H，以相似的方法计算得到的每种基因型的四只小鼠的拷贝数的代表性计算结果。野生型小鼠：WT小鼠；就人免疫球蛋白基因区段的第一***物来说为杂合型的小鼠：HET小鼠；就人免疫球蛋白基因区段的第一***物来说为纯合型的小鼠：Homo小鼠。
图4A显示了用于通过细菌同源重组(BHR)构建3hVH BACvec的三个步骤的详细图示。显示了从目标载体***的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段、选择表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。
图4B显示了在NotI消化之后的三个BAC克隆(B1、B2和B3)的脉冲场凝胶电泳(PFGE)。标记物M1、M2和M3分别是低范围、中间范围和λ梯度PFG标记物(New EnglandBioLabs，Ipswich，MA)。
图5A显示了增加量的人免疫球蛋白重链基因区段对小鼠免疫球蛋白重链基因座的连续修饰的示意图，但未按比例绘制。从重链人源化的三个不同阶段中的每一个阶段产生了纯合小鼠。空心符号表示人序列，实心符号表示小鼠序列。
图5B显示了增加量的人免疫球蛋白κ轻链基因区段对小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的连续修饰的示意图，但未按比例绘制。从κ轻链人源化的三个不同阶段中的每一个阶段产生了纯合小鼠。空心符号表示人序列，实心符号表示小鼠序列。
图6显示了在野生型和人源化小鼠中的B细胞群体的FACS点阵图。对来自于野生型(wt)或1(V1)、 (V2)或3(V3)小鼠的脾(第1行、 正数第3行、和最后1行)或腹股沟***(正数第2行)的细胞染色，用于检测表面IgM表达性B细胞(第1行和正数第2行)、含有κ或λ轻链的表面免疫球蛋白(正数第3行)或特异性单倍型的表面IgM(最后1行)，并且通过FACS分离群体。
图7A显示了随机选择的抗体VH-DH-JH(CDR3)接头周围的代表性重链CDR3序列，从而证明了接合多样性和核苷酸添加。根据DH基因区段的使用对重链CDR3序列进行分组，其种系以粗体在每组上方提供。每个重链CDR3序列的VH基因区段被记录在每个序列的5’端的括号内(例如3-72是人VH3-72)。每个重链CDR3的JH基因区段被记录在每个序列的3’端的括号内(例如3是人JH3)。显示的每个序列的SEQ ID NO从上到下如下所示：SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ IDNO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ IDNO：32；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；SEQ IDNO：38；SEQ ID NO：39。
图7B显示了随机选择的抗体Vκ-Jκ(CDR3)接头周围的代表性轻链CDR3序列，从而证明了接合多样性和核苷酸添加。每个轻链CDR3序列的Vκ基因区段被记录在每个序列的5’端的括号内(例如1-6是人Vκ1-6)。每个轻链CDR3的Jκ基因区段被记录在每个序列的3’端的括号内(例如1是人Jκ1)。显示的每个序列的SEQ ID NO从上到下如下所示：SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44；SEQ IDNO：45；SEQ ID NO：46；SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：50；SEQ IDNO：51；SEQ ID NO：52；SEQ ID NO：53；SEQ ID NO：54；SEQ ID NO：55；SEQ ID NO：56；SEQ IDNO：57；SEQ ID NO：58。
图8显示了抗体的重链和轻链的体细胞超突变频率，其被计分(与匹配种系序列比对之后)为在各组38个(非经免疫的IgM)、28个(非经免疫的IgG)、32个(来自IgG的非经免疫的Igκ)、36个(经免疫的IgG)或36个(来自IgG的经免疫的Igκ)序列中的每个核苷酸(NT；左列)或氨基酸(AA；右列)位置处发生变化的序列的百分比。阴影条形图指示CDR的位置。
图9A显示了野生型(空心条形图)或小鼠(实心条形图)中的IgM和IgG同种型的血清免疫球蛋白含量。
图9B显示了野生型(空心条形图)或小鼠(实心条形图)中的IgA同种型的血清免疫球蛋白含量。
图9C显示了野生型(空心条形图)或小鼠(实心条形图)中的IgE同种型的血清免疫球蛋白含量。
图10A显示了在用白细胞介素-6受体的胞外域进行两(采血1)或三(采血2)轮免疫之后，针对来自7只(VI)小鼠和5只野生型(WT)小鼠的血清白细胞介素-6受体(IL-6R)的抗原特异性IgG滴度。
图10B显示了来自7只(VI)小鼠和5只野生型(WT)小鼠的抗白细胞介素-6受体-特异性IgG同种型-特异性滴度。
图11A显示了在小鼠中产生的抗白细胞介素-6受体单克隆抗体的亲和力分布。
图11B显示了在(VI)和野生型(WT)小鼠中产生的抗白细胞介素-6受体单克隆抗体的抗原特异性封闭。
图12显示了小鼠免疫球蛋白重链基因座中的小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的示意图，但未按比例绘制。示出了用于将小鼠ADAM6a和ADAM6b***人源化内源重链基因座中的目标载体(mADAM6目标载体)，其具有在位点特异性重组位点(Frt)侧翼的选择表达盒(HYG：潮霉素)，并包含在5’和3’端上的工程修饰的限制位点。
图13显示了位于人重链可变基因区段1-2(VH1-2)与6-1(VH6-1)之间的人ADAM6假基因(hADAM6ψ)的示意图，但未按比例绘制。示出了用于进行细菌同源重组以使人ADAM6假基因缺失并将独特的限制位点***人重链基因座中的目标载体(hADAM6ψ目标载体)，其具有被位点特异性重组位点(loxP)侧接的选择表达盒(NEO：新霉素)，并包含在5’和3’端上的工程修饰的限制位点。显示了得到的被靶向的人源化重链基因座的图示，但未按比例绘制，所述被靶向的人源化重链基因座含有编码小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的基因组片段，并包含被位点特异性重组位点侧接的选择表达盒。
图14A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(H/κ) 和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有包括小鼠ADAM6基因的***的小鼠基因组片段的小鼠(H/κ-A6)的骨髓中，在单线上门控的淋巴细胞中的IgM和B220表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了不成熟(B220intIgM+)和成熟(B220highIgM+)B细胞的百分比。
图14B显示了骨髓中的不成熟(B220intIgM+)和成熟(B220highIgM+)B细胞的总数，所述骨髓分离自就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(H/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H/κ-A6)的股骨。
图15A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(H/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H/κ-A6)的骨髓中，CD19+门控B细胞中的c-kit和CD43表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图的右上象限和左下象限中分别记录了原B(pro-B)(CD19+CD43+ckit+)细胞和(pre-B)前B(CD19+CD43-ckit-)细胞的百分比。
图15B显示了骨髓中的原B细胞(CD19+CD43+ckit+)和前B细胞(CD19+CD43-ckit-)的总数，所述骨髓分离自就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(ADAM6-/-)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有包括小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H/κ-A6)的股骨。
图16A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(H/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的的小鼠(H/κ-A6)的骨髓中，在单线上门控的淋巴细胞中的CD19和CD43表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了不成熟B(CD19+CD43-)、前B(CD19+CD43int)和原B(CD19+CD43+)细胞的百分比。
图16B显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(H/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H/κ-A6)的骨髓中，不成熟B(CD19+CD43-)和前B(CD19+CD43int)细胞的直方图。
图17A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(H/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H/κ-A6)的脾细胞中，在单线上门控的淋巴细胞中的CD19和CD3表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了B(CD19+CD3-)和T(CD19-CD3+)细胞的百分比。
图17B显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(H/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有包含小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H/κ-A6)的脾中，CD19+门控B细胞中的Igλ和Igκ轻链表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了Igλ+(左上象限)和Igκ(右下象限)B细胞的百分比。
图17C显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(H/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有包含小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H/κ-A6)的脾中的CD19+B细胞总数。
图18A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(H/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H/κ-A6)的脾中，CD19+门控B细胞中的IgD和IgM表面表达的FACS等高线图。每个等高线图中记录了成熟B细胞(CD19+IgDhighIgMint)的百分比。右侧等高线图上的箭头说明了与IgM和IgD表面表达有关的B细胞成熟过程。
图18B显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(H/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H/κ-A6)的脾中的B细胞在从CD19+IgMhighIgDint到CD19+IgMintigDhigh的成熟期间的总数。
图19显示了使用人Vκ1-39Jκ5基因区取代内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因片段的靶向策略。
图20显示了使用人Vκ3-20Jκ1基因区取代内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因片段的靶向策略。
图21显示了使用人VpreB/Jλ5基因区取代内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因片段的靶向策略。
图22显示了野生型小鼠(WT)、具有工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区(Vκ1-39Jκ5HO)的小鼠纯合子和具有工程化的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区(Vκ3-20Jκ1HO)的小鼠纯合子外周血CD19+B细胞(y-轴)的百分率。
图23A显示了定量PCR检测的Vκ1-39衍生的轻链的相对mRNA表达情况(y-轴)，其中所述定量PCR检测是在使用对使用人Vκ和Jκ基因片段取代内源性Vκ和Jκ基因片段的小鼠纯合子(Hκ)、野生型小鼠(WT)和具有工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区的小鼠杂合子(Vκ1-39Jκ5HET)中的工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区接头(Vκ1-39Jκ5接头探针)和人Vκ1-39基因片段(Vκ1-39探针)具有特异性的探针的情况下进行的。使用小鼠Cκ的表达情况对信号进行归一化。N.D.：未检测。
图23B显示了定量PCR检测的Vκ1-39衍生的轻链的相对mRNA表达情况(y-轴)，其中所述定量PCR检测是在使用对使用人Vκ和Jκ基因片段取代内源性Vκ和Jκ基因片段的小鼠纯合子(Hκ)、野生型小鼠(WT)和具有工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区的小鼠纯合子(Vκ1-39Jκ5HO)中的工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区接头(Vκ1-39Jκ5接头探针)和人Vκ1-39基因片段(Vκ1-39探针)具有特异性的探针的情况下进行的。使用小鼠Cκ的表达情况对信号进行归一化。
图23C显示了定量PCR检测的Vκ3-20衍生的轻链的相对mRNA表达情况(y-轴)，其中所述定量PCR检测是在使用对使用人Vκ和Jκ基因片段取代内源性Vκ和Jκ基因片段的小鼠纯合子(Hκ)、野生型小鼠(WT)和具有工程化的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区的小鼠杂合子(HET)和纯合子(HO)中的工程化的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区接头(Vκ3-20Jκ1接头探针)和人Vκ3-20基因片段(Vκ3-20探针)具有特异性的探针的情况下进行的。使用小鼠Cκ的表达情况对信号进行归一化。
图24A显示了在使用β-半乳糖苷酶免疫的野生型(WT；N=2)和具有工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区的小鼠纯合子(Vκ1-39Jκ5HO；N=2)的IgM(左图)和IgG(右图)的滴度。
图24B显示了在使用β-半乳糖苷酶免疫的野生型(WT；N=5)和具有工程化的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区的小鼠纯合子(Vκ3-20Jκ1HO；N=5)的总免疫 球蛋白(IgM，IgG，IgA)的滴度。
发明详述
如本申请所使用的，术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包含四条多肽链，中间通过二硫键连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链均包含重链可变(VH)区和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变(VL)区和轻链恒定区(CL)。可以再进一步将VH和VL区分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，其散布的更加保守的称为框架区(FR)的区域。各VH和VL均包含三个CDR和四个FR，其按照下述顺序分布在氨基端至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(可以将重链CDR简称为HCDR1、HCDR2和HCDR3；可以将轻链CDR简称为LCDR1、LCDR2和LCDR3)。术语“高亲和性”抗体指针对其靶表位的KD为约10-9M或更低(例如，约1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M或约1x10-12M)的抗体。在一个实施方式中，KD通过表面等离子体共振检测，例如BIACORETM；在另一个实施方式中，KD通过ELISA检测。
术语“双特异性抗体”包括能够选择性与两个或多个表位结合的抗体。双特异性抗体通常包含两个不同的重链，每条重链特异性与不同的表位结合——所述表位在两个不同的分子上(例如，在两个不同免疫原上的不同表位)或在同一个分子上(例如，在相同免疫原上的不同表位)。如果双特异性抗体能够选择性与两个不同表位(第一表位和第二表位)结合，则第一重链针对第一表位的亲和性将通常比第一重链针对第二抗原的亲和性低至少1或2或3或4或更多个数量级，反之亦然。与双特异性抗体特异性结合的表位可以在相同或不同的靶点(例如，在相同或不同的蛋白上)。可以通过例如将识别相同免疫原的不同表位的重链组合制备双特异性抗体。例如，编码识别相同免疫原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码相同或不同重链恒定区的核酸序列融合，并且可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达这种序列。典型的双特异性抗体具有两条重链，每条均具有三个重链CDR，随后(N-末端至C-末端)为CH1结构域，铰链，CH2结构域和CH3结构域，以及免疫球蛋白轻链，其既不具有表位结合特异性又不能与各重链结合，或者其能够与各条重链结合并且能够与一个或多个 重链表位结合区域结合表位结合，或者能够结合各条重链并且能够使一条或两条重链与一个或多个表位结合。
术语“细胞”包括适于表达重组核酸序列的任意细胞。细胞包括那些原核细胞和真核细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母、栗酒酵母、毕赤酵母、P.methanolica等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合例如杂交瘤或四价体瘤。在一些实施方式中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞并且选自下述细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC5、Colo205、HB8065、HL-60(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT060562、Sertoli细胞、BRL3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和衍生自上述细胞的细胞系。在一些实施方式中，所述细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
术语“互补性决定区”或术语“CDR’包括由通常(即，在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如，抗体或T细胞受体)的轻链或重链可变区的两个框架区之间的生物体免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列。CDR可以由例如天然或成熟B细胞或T细胞的例如种系序列或重排的或未经重排的序列编码。CDR可以是体细胞突变的(例如，与在动物种系中的编码序列不同)、人源化的和/或通过氨基酸取代、添加或缺失修饰的。在一些情况下(例如，针对CDR3)，CDR可以由两个或多个序列(例如种系序列)编码，其是不连续(例如在未经重排的核酸序列中)的，但在B细胞核酸序列中是连续的，例如是序列剪接或连接的结果(例如，V-D-J重组以形成重链CDR3)。
当用于描述保守的氨基酸取代时，术语“保守的”包括氨基酸残基被另一个具有带有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基的氨基酸残基取代。在通常情况下，保守的氨基酸取代将基本上不会改变所关注蛋白的功能性性 质，例如可变区以所需的亲和性与靶表位特异性结合的能力。具有带有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的例子包括脂肪族侧链如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链如丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的侧链如天冬酰胺和谷胺酰胺；芳香侧链如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫侧链如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基酸取代基团包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方式中，保守的氨基酸取代可以是蛋白中的任意天然残基被丙氨酸取代，例如在丙氨酸扫描诱变中所使用的。在一些实施方式中，制备在PAM250log-似然性矩阵中具有正值的保守取代，如Gonnet等，(1992)Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database，Science256：1443-45所公开的，其通过引用并入本申请。在一些实施方式中，所述取代是适度的保守取代，其中所述取代在PAM250log-似然性矩阵中具有非负值。
在一些实施方式中，在免疫球蛋白轻链或重链中的残基存在一个或多个保守的氨基酸取代的差异。在一些实施方式中，在免疫球蛋白轻链或其功能性片段(例如可以在例如B细胞中表达和分泌的片段)中的残基位置不等同于本申请列出氨基酸序列的轻链，其差异为存在一个或多个保守的氨基酸取代。
术语“表位结合蛋白”包括具有至少一个CDR并且能够选择性识别表位例如能够以约1微摩或更低的KD(例如KD为约1x10-6M、1x10-7M、1x10-9M、1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M或约1x10-12M)与表位结合的蛋白。治疗性表位结合蛋白(例如治疗性抗体)通常要求KD在纳摩或皮摩范围。
术语“功能性片段”包括能够表达、分泌并且以在微摩、纳摩或皮摩范围内的KD与表位特异性结合的表位结合蛋白的片段。特异性识别包括KD至少在微摩范围、纳摩范围或皮摩范围。
术语“种系”指在非体细胞突变细胞例如非体细胞突变的B细胞或前-B细胞或造血细胞中的免疫球蛋白核酸序列。
术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括源自任意生物体的免疫球蛋白重链恒定区。除非另有明示，否则重链可变结构域包括三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包括CDR、CDR和FRs及其组合。典型的重链具有下述可变结构域 (从N端到C端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。重链的功能性片段包括能够特异性识别表位(例如以微摩、纳摩或皮摩范围的KD识别表位)的片段，所述片段能够由细胞表达和分泌并且包含至少一个CDR。
术语“同一性”当与序列一起使用时包括由本领域公知的能够用于测定核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多种不同算法确定的同一性。在本申请所述的一些实施方式中，使用空隙开口罚分(open gap penalty)为10.0和空隙扩展罚分(extend gap penalty)为0.1的ClustalW v.1.83(slow)算法和使用Gonnet相似性矩阵(MacVectorTM10.0.2，MacVectorInc.，2008)确定同一性。用于序列同一性比较的序列的长度取决于特定的序列，但是在轻链恒定结构域的情况下，所述长度应含有足够长的序列以折叠成轻链恒定结构域，其能够自身结合以形成标准的轻链恒定结构域，例如能够形成包含β链的两个β片层并且能够与至少一个人或小鼠的CH1结构域相互作用。在CH1结构域的情况下，所述序列的长度应含有足够长的序列以折叠成CH1结构域，其能够形成包含β链的两个β片层并且能够与至少一个人或小鼠的轻链恒定结构域相互作用。
短语“免疫球蛋白分子”包括两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链。所述重链可以是相同的或不同的，并且所述轻链可以是相同的或不同的。
短语“轻链”包括源自任意生物体的免疫球蛋白轻链序列，除非另有明示，否则包括人κ和λ轻链和VpreB以及替代轻链。除非另有明示，否则轻链可变(VL)结构域通常包括三个轻链CDR和四个框架(FR)区。通常地，全长轻链包括由氨基酸端至羧基酸VL结构域，其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，和轻链恒定结构域。轻链包括例如不与第一或第二表位选择性地结合的那些，所述表位由它们的表位结合蛋白选择性结合。轻链还包括结合和识别或者辅助重链的结合和识别的那些，其由它们的表位结合蛋白选择性结合一个或多个表位。
通用轻链或共同轻链指在如本申请所述小鼠中制备的轻链，其中所述小鼠对用于制备轻链可变结构域的基因片段的选择受到严格限制。作为结果，这种小鼠制备的轻链衍生自，在一个实施方式中，不超过一个或两个未经重排的轻链V片段和不超过一个或两个未经重排的轻链J片段(例如，一个V和一个J、两个V和一个J、一个V和两个J、两个V和两个J)。在一个实施方式中，不 超过一个或两个重排的轻链V/J序列，例如重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列。在不同实施方式中，通用轻链包括体细胞突变(例如，亲和成熟)的版本。
短语“体细胞突变的”指来自类别转换的B细胞的核酸序列，其中在类别转换B细胞中的免疫球蛋白可变区(例如重链可变结构域或包括重链CDR或FR序列)的核酸序列不同于在类别转换前的B细胞中的核酸序列，例如未经过类别转换的B细胞和经过类别转换的B细胞的CDR或框架核酸序列存在差异。“体细胞突变的”指亲和性成熟的B细胞的核酸序列，其不同于未经过亲和性成熟的B细胞中相应的免疫球蛋白可变区序列(即，种系基因组中的序列)。短语“体细胞突变的”还指在将B细胞与所关注的抗原接触后B细胞的免疫球蛋白可变区核酸序列，其中所述核酸序列不同于将B细胞与所关注的抗原接触前的相应核酸序列。短语“体细胞突变的”指源自已在动物中产生的抗体的序列，例如具有人免疫球蛋白可变区核酸序列的小鼠，其是对免疫挑战的响应，并且是在这种动物中固有运行的选择过程的结果。
术语“未经重排的”指核酸序列，包括存在于动物种系中的核酸序列。
短语“可变结构域”包括免疫球蛋白轻链或重链的氨基酸序列(根据需要进行了修饰)，其从N端到C端(除非另有明示)包括如下氨基酸区域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
具有人源化的免疫球蛋白基因座的小鼠
已经通过基因修饰和敲除技术大大地强化了作为基因模型的小鼠，这些技术已经允许研究具体基因的定向过表达或缺失的作用。尽管有许多优点，但所述小鼠仍然存在基因障碍，导致它不能成为人疾病的完美模型，并且不能成为用于测试人治疗剂或制造人治疗剂的完美平台。首先，虽然约99％的人基因具有小鼠同源物(Waterston R.H.et a1.，(2002)，Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome，Nature420：520-562)，但是潜在的治疗剂通常无法与预期人靶标的小鼠直系同源物交叉反应，或交叉反应不充分。为了避免这个问题，可以对选定的靶基因进行“人源化”，也就是说，可以消除小鼠基因并用对应的人直系同源基因序列置换小鼠基因(例如US6,586,251、US6,596,541和 US7,105,348，其以引用的方式并入本文中)。起初，通过“敲除加基因修饰人源化”策略对小鼠基因进行人源化的工作需要使携带内源基因的缺失(即敲除)的小鼠与携带随机整合的人基因修饰的小鼠进行杂交(参看例如Bril w.S.et al.，(2006)，Toleranceto factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNAcarrying an Arg(593)to Cys substitution，Thromb Haemost95：341-347；HomanicsG.E.et al.，(2006)，Production and characterization of murine models of classicand intermediate maple syrup urine disease，BMC Med Genet7：33；Jamsai D.et al.，(2006)，A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia，Genomics88(3)：309-15；Pan Q.et al.，(2006)，Different role for mouseand human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor(preTCR)function：human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function inCD3gamma-and CD3gammadelta-deficient mice，Mol Immunol43：1741-1750)。但这些工作受到尺寸限制的阻碍；常规的敲除技术不足以将大的小鼠基因直接替换为其大的人基因组对应物。因为技术性困难，很少尝试直接同源置换的简单方法，其中在小鼠基因的相同精确基因位置处(即在内源小鼠基因座处)用人对应基因直接置换内源小鼠基因。到目前为止，在直接置换方面的工作涉及精细并且繁琐的操作，因而限制了可处理的基因材料的长度和对基因材料操纵的精确性。
外源引入的人免疫球蛋白基因修饰在小鼠的前体B细胞中发生重排(AltF.W.，Blackwell T，K，and Yancopoulos G.D.(1985)，Immunoglobulin genes in transgenicmice，Trends Genet1：231-236)。通过使用敲除加基因修饰方法对小鼠进行工程修饰，以表达人抗体而利用了这一发现(Green L. L. et al.，(1994)，Antigen-specific humanmonoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and lightchain YACs，Nat Genet7：13-21；Lonberg N.et al.，(2005)，Human antibodyies fromtransgenic animals.Nat Biotechnol23.1117-1125；Lonberg N.et al.，(1994).Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct geneticmodifications，Nature368：856-859；Jakobovits A.et al.，(2007)，From XenoMousetechnology to panitumumab，the first fully human antibody product fromtransgenic mice，NatBiotechnol25：1134-1143)。通过使每个内源基因座的较小但 关键的部分定向缺失，随后引入人免疫球蛋白基因座位作为随机整合的较大基因修饰(如上所述)或微染色体，使这些内源性小鼠中的小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座失活(Tomizuka K.et al.，(2000)，Double trans-chromosomic mice：maintenance of twoindividual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci andexpression of fully human antibodies.Proc Natl Acad Sci U SA97：722-727)。所述小鼠代表了基因工程方面的重要进步；从所述小鼠分离的完全人单克隆抗体提供了用于治疗多种人疾病的有希望的治疗潜能(Gibson T.B.et al.，(2006)，Randomized phase IIItrial results of panitumumab，a fully human anti-epidermal growth factorreceptor monoclonal antibody，in metastatic colorectal cancer，Clin ColorectalCancer6：29-31；Jakobovitset al.，2007；Kim Y.H.et al.，(2007)，Clinical efficacyof zanolimumab(HuMax-CD4)：two Phase II studies in refractory cutaneous T-celllymphoma，Blood109(11)：4655-62；Lonberg，2005；Maker A.V.et al.，2005，Tumorregression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4blockade and interleukin2：a phase I/II study，Ann SurgOncol12：1005-1016；McClung M.R.et al.，(2006)，Denosumab in postmenopausal womenwith low bone mineral density，N Engl J Med354：821-831)。但是，如上文所论述，这些小鼠与野生型小鼠相比展现出受损的B细胞发育，并且有免疫缺乏。这些问题可能会限制小鼠支持有力体液应答的能力，并且因此会限制小鼠产生针对一些抗原的完全人抗体的能力。这些缺陷可归因于：(1)因为随机引入人免疫球蛋白基因修饰而导致的不足功能性，和因为缺少上游和下游控制元件而导致的不正确表达(Garrett F.E.et al.，(2005)，Chromatin architecture near a potential3′end of the IgH locus involvesmodular regulation of histone modifications during B-Cell development and invivo occupancy at CTCF sites，Mol CellBiol25：1511-1525；Manis J.P.et al.，(2003)，Elucidation of a downstream boundary of the3′IgH regulatory region，MolImmunol39：753-760；Pawlitzky I.et al.，(2006)，Identification of a candidateregulatory element within the 5′flanking region of the mouse IgH locusdefined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding ofPU.1，Pax5，and E2A，J Immunol 176：6839-6851)；(2)人恒定域与小鼠细胞表面上的B细胞受体信号传导复合物 的组分之间的低效种间相互作用，其可能损害B细胞的正常成熟、增殖和存活所必需的信号传导过程(Hombach J.et al.，(1990)，Molecular components ofthe B-cell antigen receptor complex of the IgM class，Nature343：760-762)；和(3)可溶性人免疫球蛋白与小鼠Fc受体之间的低效种间相互作用，其可能会降低亲和力选择(Rao S.P.et al.，(2002)，Differential expression of the inhibitory IgG Fcreceptor FcgammaRIIB on germinal center cells：implications for selection ofhigh-affinity B cells，JImmunol169：1859-1868)和免疫球蛋白血清浓度(BrambellF.w.et al.，(1964)，A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism，Nature203：1352-1354；Junghans R.P.and Anderson C.L.(1996)，The protection receptor forIgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinaltransport receptor，Proc NatlAcadSci USA93：5512-5516；Rao et al.，2002；HjelmF.et al.，(2006)，Antibody-mediated regulation of the immune response，ScandJImmunol64：177-184；Nimmerjahn F.and Ravetch J.V.(2007)，Fc-receptors asregulators of immunity，Adv Immunol96：179-204)。这些缺陷可以通过仅对小鼠免疫球蛋白基因座的可变区在内源重链和轻链基因座处的天然位置进行原位人源化来校正。这将有效地产生可形成“反转嵌合”(即人V：小鼠C)抗体的小鼠，基于保留的小鼠恒定区，这些抗体将能够与小鼠环境进行正常的相互作用并由其筛选。其它这类反转嵌合抗体可以容易地重新形成用于治疗目的的完全人抗体。
描述了用人种系免疫球蛋白可变基因对小鼠种系免疫球蛋白可变基因进行大型原位基因置换、同时保留小鼠产生后代的能力的方法。具体来说，描述了6兆碱基的小鼠重链和κ轻链免疫球蛋白可变基因座两者被人对应物精确置换，同时仍保持小鼠恒定区完整。因此，已经产生了全体种系免疫球蛋白可变谱系被相应的人种系免疫球蛋白可变序列精确置换、同时保留小鼠恒定区的小鼠。人可变区连接到小鼠恒定区上，形成发生重排并以生理上适当的水平进行表达的嵌合人-小鼠免疫球蛋白基因座。所表达的抗体是“反转嵌合体”，即它们包含人可变区序列和小鼠恒定区序列。具有表达具有人可变区和小鼠恒定区的抗体的人源化免疫球蛋白可变区的这些小鼠被称为人源化小鼠。
人源化小鼠展现出具有完全功能的体液免疫***，其基本上与野生型小鼠的体液免疫***没有区别。它们在B细胞发育的所有阶段显 示正常的细胞群体。它们展现出正常的淋巴样器官形态。人源化小鼠的抗体序列展现出正常的可变片段重排和正常的体细胞超突变。这些小鼠中的抗体群体反映了由正常种型转换(例如正常同种型顺式转换)引起的同种型分布。对人源化小鼠进行免疫导致了强有力的体液应答，其产生适合用作治疗候选物的具有人免疫球蛋白可变区的庞大且多样性的抗体。这个平台提供了适合于形成药学上可接受的抗体和其它抗原结合蛋白的亲和成熟的人免疫球蛋白可变区序列的丰富来源。
用人免疫球蛋白可变序列对小鼠免疫球蛋白可变序列进行精确置换，使得可以形成人源化小鼠。然而，因为在小鼠与人之间的免疫球蛋白基因座的趋异进化，即便通过对非常大的人免疫球蛋白序列链段进行连续重组工程从而用相应的人免疫球蛋白序列精确置换重链和轻链基因座处的内源小鼠免疫球蛋白序列，也可能出现某些问题。举例来说，散布在免疫球蛋白基因座内的基因间序列在小鼠与人之间不一致，并且在一些情况下可能在功能上不等效。小鼠与人在其免疫球蛋白基因座上的差别仍然可能导致人源化小鼠的异常，尤其当对内源小鼠免疫球蛋白重链基因座的某些部分进行人源化或操纵时。在小鼠免疫球蛋白重链基因座处的一些修饰是有害的。有害的修饰可以包括例如被修饰小鼠交配和产生后代的能力的丧失。
用对应的1.4兆碱基人基因组序列对小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因座的6兆碱基可变区(VH-DH-JH和Vκ-Jκ)进行精确的大规模原位置换，同时保持侧接小鼠序列完整并且在杂合基因座内发挥功能，包括所有的小鼠恒定链基因和基因座转录控制区(图1)。具体来说，使用基因工程技术，将13个携带人种系可变基因座重叠片段的嵌合型BAC目标载体逐步***小鼠ES细胞中，从而引入人VH、DH、JH、Vκ和Jκ基因序列(参看例如美国专利号6,586,251和Valenzuela D.M.et al.，(2003)，High-throughput engineering ofthe mouse genome coupled with high-resolution expression analysis，NatBiotechnol 21：652-659)。
小鼠免疫球蛋白基因的人源化代表了迄今为止对小鼠基因组的最大基因修饰。虽然先前用随机整合的人免疫球蛋白基因修饰所进行的工作已经获得了一些成功(上文论述)，但是用人对应物直接置换小鼠免疫球蛋白基因会显著增加 用其在其它方面都正常的小鼠中有效地产生完全人抗体的效率。此外，与携带无效内源基因座和完全人抗体基因修饰的小鼠相比，所述小鼠展现出在用几乎任何抗原进行免疫之后可获得的完全人抗体的显著增加的多样性。与在各个分化阶段均展现出显著减少的B细胞群体的具有随机整合的人基因修饰的小鼠相比，多种型式的被置换的人源化基因座展现出完全正常的成熟和不成熟B细胞水平。虽然增加人基因修饰小鼠中的人基因区段数量的工作减少了所述缺陷，但是与野生型小鼠相比，扩大的免疫球蛋白谱系没有完全校正B细胞群体的减少。
尽管在具有被置换的免疫球蛋白基因座的小鼠中观察到了接近野生型的体液免疫功能，但是当使用免疫球蛋白的直接置换时会遇到在使用随机整合的基因修饰的一些方法中不会遇到的其他问题。免疫球蛋白基因座的基因组成在小鼠与人之间的差别已经导致对具有被置换的免疫球蛋白基因区段的小鼠的繁殖有利的序列的发现。具体来说，在具有被置换的免疫球蛋白基因座的小鼠中最好存在位于内源免疫球蛋白基因座内的小鼠ADAM基因，因为它们在生育力方面发挥功能。
小鼠ADAM6的基因位置和功能
缺少表达任何功能性ADAM6蛋白能力的雄性小鼠展现出严重的小鼠交配和产生后代的能力缺陷。通过用人可变区基因区段置换所有或基本上所有小鼠免疫球蛋白可变区基因区段，使得所述小鼠缺乏表达功能性ADAM6蛋白的能力。ADAM6功能之所以丧失是因为ADAM6基因座位于内源小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座位的邻近VH基因区段基因座3’端的区域中，所述VH基因区段基因座在DH基因区段的上游。为了繁殖就人重链可变基因区段对所有或基本上所有内源小鼠重链可变基因区段的置换来说为纯合型的小鼠，建立就所述置换来说各自为纯合型的雄性和雌性小鼠并等待生殖交配通常是一项繁琐的方法。成功幼仔相当少见并且平均产仔的数量很少。相反地，已经使用了就所述置换来说为杂合型的雄性小鼠与就所述置换来说为纯合型的雌性小鼠进行交配，以产生就所述置换来说为杂合型的后代，然后从所述后代繁殖纯合型小鼠。本发明人已经确定了雄性小鼠生育力丧失的可能原因在于纯合型雄性小鼠中不存在 功能性ADAM6蛋白。
ADAM6蛋白是ADAM蛋白家族的一员，其中ADAM是A去整合素和金属蛋白酶(ADisintegrinAnd Metalloprotease)的首字母缩写。ADAM蛋白家族是庞大并且多样性的，并具有多种功能。ADAM家族的一些成员参与到***产生和受精中。举例来说，ADAM2编码参与到***-卵子相互作用中的蛋白受精素(fertilin)的亚单元。ADAM3或cyritestin似乎是***与透明带的结合所必需的。ADAM2或ADAM3的缺失都会导致不育。已经假设ADAM2、ADAM3和ADAM6在小鼠***表面上形成复合物。
通常在人VH基因区段VH1-2与VH6-1之间存在的人ADAM6基因似乎是假基因(图12)。在小鼠中，有存在于小鼠VH与DH基因区段之间的基因间区域中的两种ADAM6基因——ADAM6a和ADAM6b，并且在小鼠中，a和b基因的转录方向与周围的免疫球蛋白基因区段的转录方向相反(图11)。在小鼠中，功能性ADAM6基因座显然是正常受精所必需的。那么，功能性ADAM6基因座或序列是指能够补偿或挽救在缺少功能性内源ADAM6基因座或具有受损的内源ADAM6基因座的雄性小鼠中所表现的显著降低的受精作用。
小鼠中编码ADAM6a和ADAM6b的基因间序列的位置使得所述基因间序列在修饰内源小鼠重链时容易被修饰。当VH基因区段缺失或被置换时，或者当DH基因区段缺失或被置换时，获得的小鼠有很高的概率会表现出严重的生育力缺陷。为了补偿这种缺陷，对小鼠进行修饰以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码补偿因内源小鼠ADAM6基因座修饰所致的ADAM6活性丧失的蛋白质。在各实施方案中，所述补偿性核苷酸序列是编码挽救生育力缺陷的小鼠ADAM6a、小鼠ADAM6b或其同系物或直系同源物或功能片段的核苷酸序列。
所述挽救生育力的核苷酸序列可以被放置在任何合适位置。其可以被放置在所述基因间区域中，或放置在基因组中的任何合适位置(即异位地)。在一个实施方案中，所述核苷酸序列可以被引入随机整合入小鼠基因组的基因修饰中。在一个实施方案中，所述序列可以被维持在附加体上，也就是说维持在另外的核酸上而不是小鼠染色体上。合适位置包括转录上允许或有活性的位置，例如ROSA26基因座。
术语“异位”旨在包括移位，或在自然界中通常不会遇到的位置处的放置(例 如，核酸序列的放置位置在与野生型小鼠中发现的所述核酸序列的位置不同)。在各实施方案中，所述术语在其对象脱离正常或正确位置的意义上使用。举例来说，短语“编码......的异位核苷酸序列”是指在小鼠中通常不会遇到的位置处出现的核苷酸序列。举例来说，在编码小鼠ADAM6蛋白(或其对雄性小鼠提供相同或类似生育益处的直系同源物或同系物或片段)的异位核苷酸序列的情况下，所述序列可以被放置在小鼠基因组中与野生型小鼠中通常发现的位置不同的位置处。小鼠ADAM6的功能性同系物或直系同源物是对ADAM6-/-小鼠中观察到的生育力丧失(例如雄性小鼠通过交配产生后代的能力的丧失)进行挽救的序列。功能性同系物或直系同源物包括下述的蛋白质：其与ADAM6a的氨基酸序列和/或ADAM6b的氨基酸序列具有至少约89％或更高同一性，例如具有最高达的99％同一性，并且能够补偿或挽救基因型包含ADAM6a和/或ADAM6b缺失或敲除的小鼠成功交配的能力。
异位位置可以是任何地方(例如，与含有小鼠ADAM6序列的基因修饰的随机***一样)，或者可以位于例如接近(但不正好是)其在野生型小鼠中的位置的位置(例如在被修饰的内源小鼠免疫球蛋白基因座中，但在其天然位置的上游或下游，例如在被修饰的免疫球蛋白基因座中，但介于不同基因区段之间，或在小鼠V-D基因间序列中的不同位置处)。异位放置的一个实例是放置在人源化免疫球蛋白重链基因座内。举例来说，可以对包含人VH基因区段对一个或多个内源VH基因区段的置换的小鼠(其中所述置换去除了内源ADAM6序列)进行工程修饰，以具有位于含有人VH基因区段的序列内的小鼠ADAM6序列。得到的修饰将在人基因序列内产生(异位)小鼠ADAM6序列，并且所述小鼠ADAM6序列在人基因序列内的(异位)放置可以接近于人ADAM6假基因的位置(即在两个V区段之间)或可以接近于小鼠ADAM6序列的位置(即在V-D基因间区域内)。
在各个方面，可以产生包含内源重链可变区基因座或其部分的缺失或置换的小鼠，其含有编码赋予与小鼠ADAM6类似的生育力好处的蛋白质(例如在雄性小鼠中发挥功能的其直系同源物或同系物或片段)。异位核苷酸序列可以包括以下核苷酸序列，其编码作为不同小鼠品系或不同种(例如不同啮齿动物种)的ADAM6同系物或直系同源物(或其片段)的蛋白质，并赋予生育力好处，例如 在规定时期内的窝数的增加，和/或每窝幼崽数的增加，和/或雄性小鼠的***通过小鼠输卵管使小鼠卵子受精的能力。
在一个实施方案中，所述ADAM6是与小鼠ADAM6蛋白有至少89％到99％同一性(例如与小鼠ADAM6a或小鼠ADAM6b有至少89％到99％同一性)的同系物或直系同源物。在一个实施方案中，所述异位核苷酸序列编码一种或一种以下蛋白质，所述蛋白质独立选自与小鼠ADAM6a有至少89％同一性的蛋白质、与小鼠ADAM6b有至少89％同一性的蛋白质和其组合。在一个实施方案中，所述同系物或直系同源物是与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b有约89％或以上同一性或者被修饰成与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b有约89％或以上同一性的大鼠、仓鼠、小鼠或豚鼠蛋白质。在一个实施方案中，所述同系物或直系同源物与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在人源化的重链小鼠中的异位ADAM6
形成人抗体的小鼠已经获得了一段时间。虽然这些小鼠代表了人治疗抗体开发上的重要进步，但是这些小鼠显示了限制其实用性的许多显著异常。举例来说，其显示受损的B细胞发育。该受损的发育可能是因为基因修饰小鼠与野生型小鼠之间的多种差异。
人抗体可能不会与小鼠细胞表面上的小鼠前B细胞或B细胞受体进行最佳的相互作用，所述受体在克隆选择期间为成熟、增殖或存活提供信号。完全人抗体可能不会与小鼠Fc受体***进行最佳的相互作用；小鼠表达的Fc受体不显示与人Fc受体的一一对应关系。最后，形成完全人抗体的各种小鼠不包含可能是野生型B细胞发育所必需的所有真小鼠序列，例如下游增强子元件和其它基因座控制元件。
形成完全人抗体的小鼠一般包含以某种方式失能内源免疫球蛋白基因座，并且包含可变和恒定免疫球蛋白基因区段的人基因修饰被引入小鼠基因组的随机位置中。只要内源基因座经过充分失能从而无法重排基因区段以形成功能性免疫球蛋白基因，那么就可以实现在这类小鼠中形成完全人抗体的目标，虽然B细胞发育受损。
虽然不得不从人基因修饰座位形成完全人抗体，但是在小鼠中产生人抗体显然是一种不利的方法。在一些小鼠中，这种方法是如此地不利，以至于会通过反式转换(trans-switching)机制形成嵌合型人可变/小鼠恒定重链(而不是轻链)。通过这种机制，编码完全人抗体的转录物会经历同种型反式转换，从人同种型转换为小鼠同种型。这个过程是反式的，因为完全人基因修饰的位置远离保留小鼠重链恒定区基因的未被破坏拷贝的内源基因座。虽然在所述小鼠中反式转换容易是显而易见的，但是这个现象仍然不足以挽救B细胞发育，B细胞发育仍然是明显受损的。在任何情况下，在所述小鼠中形成的反式转换抗体都保留完全人轻链，因为轻链显然不会发生反式转换现象；据推测，反式转换依赖于正常同种型顺式转换中使用的内源基因座(虽然不同)中的转换序列。因此，即使当经过工程修饰以形成完全人抗体的小鼠选择反式转换机制形成具有小鼠恒定区的抗体时，这种策略仍然不足以挽救正常B细胞发育。
形成基于抗体的人治疗剂中的主要问题在于形成足够大多样化的人免疫球蛋白可变区序列以鉴别可用的可变域，这些可变域特异性地识别特定表位并以期望亲和力(通常以高亲和力，但不总是)与其结合。在开发出 人源化小鼠之前，并没有人指出，表达人可变区和小鼠恒定区的小鼠与从基因修饰形成人抗体的小鼠有任何显著的差别。然而，这个推测是不正确的。
在内源小鼠基因座处含有人免疫球蛋白可变区对小鼠免疫球蛋白可变区的精确置换的人源化小鼠就B细胞发育来说显示与野生型小鼠令人意外并且显著的相似性。在一项令人意外并且令人震惊的研究中， 人源化小鼠对于免疫作用显示了基本正常的野生型反应，其与野生型小鼠仅有一个显著不同，即响应于免疫作用而产生的可变区是完全人可变区。
人源化小鼠在内源基因座处含有对应人免疫球蛋白可变区对小鼠免疫球蛋白重链(IgH)和免疫球蛋白轻链(例如κ轻链、Igκ)的种系可变区的精确大规模置换。总体上，约6兆碱基的小鼠基因座被约1.4兆碱基的人基因组序列置换。这种精确置换产生了具有杂合免疫球蛋白基因座的小鼠，所述杂合免疫球蛋白基因座形成具有人可变区和小鼠恒定区的重链和轻链。小 鼠VH-DH-JH和Vκ-Jκ区段的精确置换使杂合免疫球蛋白基因座处的侧接小鼠序列保持完整并发挥功能。小鼠的体液免疫***像野生型小鼠一样发挥功能。B细胞发育没有在任何重大方面受到阻碍，并且在抗原攻击后在小鼠中产生多种多样的人可变区。
人源化小鼠是可行的，因为重链和κ轻链的免疫球蛋白基因区段在人和小鼠中类似地重排，这并不是说它们的基因座相同甚或几乎相同——显然它们不相同。然而，这些基因座足够类似，导致重链可变基因座的人源化可以通过用约1百万碱基的连续人基因组序列置换约3百万碱基对的连续小鼠序列来实现，所述连续小鼠序列含有所有的VH、DH和JH基因区段，所述连续人基因组序列基本覆盖来自于人免疫球蛋白基因座的同等序列。
在一些实施方案中，用人基因序列进一步置换某些小鼠恒定区基因序列(例如用人CH1序列置换小鼠CH1序列，和用人CL序列置换小鼠CL序列)产生了具有杂合免疫球蛋白基因座的小鼠，所述小鼠产生具有人可变区和部分人恒定区的抗体，所述人可变区和部分人恒定区适合于(例如)产生完全人抗体片段，例如完全人Fab。具有杂合免疫球蛋白基因座的小鼠展现出正常的可变基因区段重排、正常的体细胞超突变和正常的种型转换。这些小鼠展现出与野生型小鼠无法区别的体液免疫***，并显示在B细胞发育所有阶段的正常细胞群体和正常淋巴样器官结构——甚至在所述小鼠缺少人可变区基因区段的完全谱系的情况下。对这些小鼠进行免疫导致了稳固的体液应答，其显示多种多样的可变基因区段使用。
对小鼠种系可变区基因区段的精确置换允许形成具有部分人免疫球蛋白基因座的小鼠。因为所述部分人免疫球蛋白基因座正常地发生重排、超突变和种型转换，所以所述部分人免疫球蛋白基因座在小鼠中产生包含人可变区的抗体。可以鉴别和克隆编码可变区的核苷酸序列，然后使其与任何所选序列(例如适合于特定用途的任何免疫球蛋白同种型)融合(例如在体外***中)，从而产生完全来源于人序列的抗体或抗原结合蛋白。
使用通过重组工程方法进行的大规模人源化来修饰小鼠胚胎干(ES)细胞，以用具有最高达1兆碱基的人基因组序列的相应人基因区段精确置换最高达3兆碱基的小鼠重链免疫球蛋白基因座，所述小鼠重链免疫球蛋白基因座包含基本 上所有的小鼠VH、DH和JH基因区段，所述人基因组序列含有一些或基本上所有的人VH、DH和JH基因区段。使用最高达0.5兆碱基的人基因组区段置换3兆碱基的包含基本上所有小鼠Vκ和Jκ基因区段的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座区段，所述人基因组区段包含编码基本上所有人Vκ和Jκ基因区段的两个重复单元中的一个重复单元。
具有所述被置换的免疫球蛋白基因座的小鼠可以包含内源小鼠ADAM6基因座的破坏或缺失，所述破坏或缺失通常存在于小鼠免疫球蛋白重链基因座处的3’端VH基因区段与5’端DH基因区段之间。这个区域中的破坏可以降低或消除内源小鼠ADAM6基因座的功能性。如果在置换中使用人重链谱系的3’端VH基因区段，那么在这些VH基因区段之间(即在人VH1-2与VH1-6之间)存在的基因间区域含有似乎是人ADAM6假基因的假基因。然而，包含这个人基因间序列的雄性小鼠展现出很少或没有生育力。
描述的小鼠包含如上所述被置换的基因座，而且还包含编码小鼠ADAM6的异位核酸序列，其中所述小鼠展现出基本上正常的生育力。在一个实施方案中，所述异位核酸序列是SEQ ID NO：3，其被放置在被修饰的内源小鼠重链基因座处的人VH1-2与VH1-6之间。SEQID NO：3的ADAM6基因的转录方向与周围人VH基因区段的转录方向是相反的。虽然本文中的实例给出通过在指定人VH基因区段之间放置异位序列来挽救生育力，但是技术人员将认识到，异位序列在小鼠基因组中的任何合适的转录允许基因座处(甚或染色体外)的放置将被预期会以相似的方式挽救雄性小鼠的生育力。
用包含小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同系物或功能片段的异位序列对缺少功能性ADAM6基因座的小鼠进行补偿的现象是可应用来挽救具有非功能性或最小功能性的内源ADAM6基因座的任何小鼠的一种通用方法。因此，可以用本发明的组合物和方法挽救包含免疫球蛋白重链基因座的ADAM6破坏性修饰的很多种小鼠。因此，本发明包括具有多种免疫球蛋白重链基因座修饰的小鼠，这些修饰损害了内源ADAM6功能。本说明书中提供了一些(非限制性)实例。除了描述的人源化小鼠以外，与ADAM6相关的组合物和方法也可以用在很多应用中，例如在以多种方式修饰重链基因座时。
在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白(或 其直系同源物或同系物或功能片段)的异位ADAM6序列、一个或多个人VH基因区段对所有或基本上所有小鼠VH基因区段的置换、人DH和人JH基因区段对所有或基本上所有小鼠DH基因区段和JH基因区段的置换；其中所述小鼠缺少CH1和/或铰链区。在一个实施方案中，所述小鼠产生单可变区结合蛋白，其是免疫球蛋白链的二聚体，选自：(a)人VH-小鼠CH1-小鼠CH2-小鼠CH3；(b)人VH-小鼠铰链-小鼠CH2-小鼠CH3；和(c)人VH-小鼠CH2-小鼠CH3。
在一个方面，所述挽救生育力的核苷酸序列被放置在小鼠中的人免疫球蛋白重链可变区序列内(例如在人VH1-2与VH1-6基因区段之间)，其中所述小鼠的全部或几乎全部小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段(mVH的、mDH的和mJH的)被一个或多个人免疫球蛋白重链可变基因区段(hVH的、hDH的和hJH的)置换，并且所述小鼠进一步包含一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(hVκ的和hJκ的)对全部或几乎全部小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(mVκ的和mJκ的)的置换。在一个实施方案中，所述核苷酸序列被放置在人源化小鼠的人VH1-2基因区段与人VH1-6基因区段之间(US6,596,541和US7,105,348，其以引用的方式并入本文)。在一个实施方案中，如此修饰的人源化小鼠包含全部或几乎全部的人免疫球蛋白重链可变基因片段(全部hVH的、hDH的和/或hJH的)和全部或几乎全部的人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(hVκ的和hJκ的)的取代。
在一个方面，功能性小鼠ADAM6基因座(或其直系同源物或同系物或功能片段)可以位于取代内源小鼠VH基因区段的人VH基因片段的中间。在一个实施方案中，去除全部或几乎全部的小鼠VH基因区段并用一个或多个人VH基因区段置换，并且所述小鼠ADAM6基因座紧邻人VH基因区段的3’端，或存在于两个人VH基因区段之间。在一个特定实施方式中，小鼠的ADAM6基因座位于***的人VH基因片段3’端附近的两个VH基因片段之间。在一个特定实施方式中，取代包括人VH基因片段VH1-2和VH6-1，并且小鼠ADAM6基因座位于VH1-2基因片段的下游和VH6-1基因片段的上游。在一个特定实施方式中，然后人VH基因片段的排布如下(相对于人VH基因片段的转录方向由上游至下游)：人VH1-2-小鼠ADAM6基因座-人VH6-1。在一个特定实施方式中，在人VH1-2和人VH6-1之间的ADAM6假基因被小鼠ADAM6基因座取代。在一个实施方 式中，一个或多个小鼠ADAM6基因座的小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b转录的方向与人VH基因片段的方向相反。或者，小鼠ADAM6基因座可以位于3’-端人VH基因片段和5’-端DH基因片段之间的基因间区域。无论5’-端DH基因片段是小鼠的还是人的均可以是这样的情况。
类似地，可以对被置换所有或基本上所有内源小鼠VH基因区段的一个或多个人VL基因区段(例如Vκ或Vλ区段)修饰的小鼠进行修饰，目的是维持内源小鼠ADAM6基因座(如上所述)，例如通过使用具有包含小鼠ADAM6基因座或其功能片段的下游同源臂的目标载体；或者目的是用被放置在两个人VL基因区段之间或者所述人VL基因区段与DH基因区段(无论人还是小鼠，例如Vλ+m/hDH)或J基因区段(无论人还是小鼠，例如Vκ+JH)之间的异位序列置换受损的小鼠ADAM6基因座。在一个实施方案中，所述置换包括两个或两个以上人VL基因区段，并且所述小鼠ADAM6基因座或其功能片段位于所述两个3’端VL基因区段之间。在一个具体实施方案中，然后发生人VL基因区段的重排(就人基因区段的转录方向来说从上游到下游)：人VL3’-1-小鼠ADAM6基因座-人VL3’。在一个实施方案中，就转录方向来说，所述小鼠ADAM6基因座的一个或多个小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的方向与人VL基因区段的方向相反。或者，所述小鼠ADAM6基因座位于3’端人VL基因区段与5’端DH基因区段之间的基因间区域中。无论5’端DH区段是小鼠的还是人的，情况都是如此。
在一个方面，提供了一种具有一个或多个内源小鼠VH基因区段的置换并包含至少一个内源小鼠DH基因区段的小鼠。在这类小鼠中，所述内源小鼠VH基因区段的修饰可以包含对一个或多个3’端VH基因区段但不是5’端DH基因区段的修饰，其中应当小心以使得所述一个或多个3’端VH基因区段的修饰不会破坏内源小鼠ADAM6基因座或使内源小鼠ADAM6基因座不具有功能。举例来说，在一个实施方案中，所述小鼠包含一个或多个人VH基因区段对所有或基本上所有内源小鼠VH基因区段的置换，并且所述小鼠包含一个或多个内源DH基因区段和功能性内源小鼠ADAM6基因座。
在另一个实施方案中，所述小鼠包含内源小鼠3’端VH基因区段的修饰和一个或多个内源小鼠DH基因区段的修饰，并且进行所述修饰以将所述内源小鼠ADAM6基因座的完整性维持到所述内源ADAM6基因座保持功能的程度。在一 个实施例中，以两个步骤进行这种修饰：(1)利用具有上游同源臂和下游同源臂的目标载体，用一个或多个人VH基因区段置换3’端内源小鼠VH基因区段，其中所述下游同源臂包含功能性小鼠ADAM6基因座的全部或一部分；(2)然后用具有包含小鼠ADAM6基因座的全部或功能部分的上游同源臂的目标载体置换内源小鼠DH基因区段。
在各个方面，在修饰会破坏内源小鼠ADAM6的功能时，利用含有对小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同系物或功能性片段进行编码的异位序列的小鼠是有用的。当对小鼠免疫球蛋白基因座进行修饰时，尤其当修饰小鼠免疫球蛋白重链可变区和周围序列时，破坏内源小鼠ADAM6功能的概率很高。因此，当产生免疫球蛋白重链基因座完全或部分缺失、被完全或部分人源化或被完全或部分置换(例如用Vκ或Vλ序列置换)的小鼠时，所述小鼠提供了特别的益处。针对以下描述的小鼠所描述的进行基因修饰的方法对于所属领域技术人员是已知的。
含有下述的异位序列的小鼠在与对小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座位所作的破坏内源小鼠ADAM6序列或使之缺失的修饰结合时特别有用，所述异位序列编码小鼠ADAM6蛋白或赋予小鼠ADAM6蛋白的生育力益处的基本相同或类似的蛋白质。虽然主要结合表达具有人可变区和小鼠恒定区的抗体的小鼠进行了描述，但是所述小鼠也可与破坏内源小鼠ADAM6基因的任何基因修饰结合使用。技术人员将认识到这涵盖含有小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座位的修饰的多种基因修饰小鼠。例如，这些小鼠包括全部或一部分小鼠免疫球蛋白重链基因区段缺失或被置换的小鼠，而不管其它修饰如何。以下描述非限制性实例。
在一些方面，提供了下述的基因修饰小鼠，其包含在小鼠中发挥功能的异位小鼠、啮齿动物或其它ADAM6基因(或直系同源物或同系物或片段)，和一个或多个人免疫球蛋白可变区和/或恒定区基因区段。
在一个方面，提供了一种下述的小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列、一个或多个人VH基因区段对所有或基本上所有小鼠VH基因区段的置换、一个或多个人DH基因区段对所有或基本上所有小鼠DH基因区段的置换、和一个或多个人JH基因区段对所有或基本上所有小鼠JH基因区段的 置换。
在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人CH1核苷酸序列对小鼠CH1核苷酸序列的置换。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人铰链核苷酸序列对小鼠铰链核苷酸序列的置换。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人免疫球蛋白轻链可变基因座对免疫球蛋白轻链可变基因座(VL和JL)的置换。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列对小鼠免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列的置换。在一个具体实施方案中，所述VL、JL和CL是免疫球蛋白κ轻链序列。在一个具体实施方案中，所述小鼠包含与人铰链和人CH1序列融合的小鼠CH2和小鼠CH3免疫球蛋白恒定区序列，使得所述小鼠免疫球蛋白基因座重排形成编码结合蛋白的基因，所述结合蛋白包含(a)具有人可变区、人CH1区、人铰链区以及小鼠CH2和小鼠CH3区的重链，和(b)编码包含人可变域和人恒定区的免疫球蛋白轻链的基因。
在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列、一个或多个人VL基因区段对所有或基本上所有小鼠VH基因区段的置换，和任选的一个或多个人DH基因区段和/或人JH基因区段对所有或基本上所有DH基因区段和/或JH基因区段的置换，或任选的一个或多个人JL基因区段对所有或基本上所有DH基因区段和/或JH基因区段的置换。
在一个实施方案中，所述小鼠包含一个或多个VL、一个或多个DH和一个或多个J基因区段(例如Jκ或Jλ)对所有或基本上所有小鼠VH、DH和JH基因区段的置换，其中所述基因区段可操作地连接到内源小鼠铰链区上，其中所述小鼠形成重排的免疫球蛋白链基因，其在转录方向上从5’到3’含有人VL-人或小鼠DH-人或小鼠J-小鼠铰链-小鼠CH2-小鼠CH3。在一个实施方案中，所述J区是人Jκ区。在一个实施方案中，所述J区是人JH区。在一个实施方案中，所述J区是人Jλ区。在一个实施方案中，所述人VL区选自人Vλ区和人Vκ区。
在具体实施方案中，所述小鼠表达具有小鼠或人恒定区和来源于以下的可变区的单可变域抗体：人Vκ、人DH和人Jκ；人Vκ、人DH和人JH；人Vλ、人DH和人Jλ；人Vλ、人DH和人JH；人Vκ、人DH和人Jλ；人Vλ、人DH和人Jκ。在具体实施方案中，对重组识别序列进行修饰以允许在所叙述的V、D和J基因 区段之间或在所叙述的V和J基因区段之间发生大量重排。
在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白(或其直系同源物或同系物或功能片段)的异位ADAM6序列、一个或多个人VL基因区段对所有或基本上所有小鼠VH基因区段的置换、人JL基因区段对所有或基本上所有小鼠DH基因区段和JH基因区段的置换；其中所述小鼠缺少CH1和/或铰链区。
在一个实施方案中，所述小鼠缺少编码CH1结构域的序列。在一个实施方案中，所述小鼠缺少编码铰链区的序列。在一个实施方案中，所述小鼠缺少编码CH1结构域和铰链区的序列。
在一个具体实施方案中，所述小鼠表达的结合蛋白包含融合到小鼠CH2结构域上的人免疫球蛋白轻链可变域(λ或κ)，所述小鼠CH2结构域连接到小鼠CH3结构域上。
在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白(或其直系同源物或同系物或功能片段)的异位ADAM6序列、一个或多个人VL基因区段对所有或基本上所有小鼠VH基因区段的置换、人JL基因区段对所有或基本上所有小鼠DH和JH基因区段的置换。
在一个实施方案中，所述小鼠包含编码CH1区、铰链区、CH1和铰链区、或者CH1区和铰链区和CH2区的免疫球蛋白重链恒定区基因序列的缺失。
在一个实施方案中，所述小鼠产生单可变域结合蛋白，其包含选自以下的同型二聚体：(a)人VL-小鼠CH1-小鼠CH2-小鼠CH3；(b)人VL-小鼠铰链-小鼠CH2-小鼠CH3；(c)人VL-小鼠CH2-小鼠CH3。
在一个方面，提供了一种具有失能内源重链免疫球蛋白基因座的小鼠，所述失能内源重链免疫球蛋白基因座包括失能或缺失的内源小鼠ADAM6基因座，其中所述小鼠包含表达人或小鼠或人/小鼠或其它嵌合抗体的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列存在于随机整合入小鼠基因组中的整合基因修饰。在一个实施方案中，所述核酸序列位于不存在于野生型小鼠中的附加体(例如染色体)上。
共同的或通用的轻链
此前制备有用的多特异性表位结合蛋白例如双特异性抗体的努力，受到了各种各样问题的阻碍，这些问题通常具有一个共同的模式：对序列进行体外选择或操作以合理设计或通过试错法设计用于配对异二聚体双特异性人免疫球蛋白的适宜形式。不幸的是，如果不是全部的话，大部分提供的体外设计方法在很大程度上仅是临时性的，如果有的话，也仅针对个别分子。另一方面，尚未实现引入复杂的生物体选择能够用于人类治疗的适宜配对的体内方法。
在通常情况下，天然的小鼠序列通常不是人治疗序列的好来源。至少是因为这个原因，产生与共同人轻链配对的小鼠重链免疫球蛋白可变区的实用价值有限。更多的体外工程的努力均花费在通过试错法尝试将小鼠重链可变序列人源化上，同时希望保持表位特异性和亲和性并保持与共同人轻链偶联的能力，但其结果还是个未知数。在这样一个过程结束时，最终产品可能维持一些特异性和亲和性，并且与共同轻链结合，但是其最终在人体内的免疫原性可能仍具有较高的风险。
因此，用于制备人用治疗剂的适宜小鼠将包括适宜的使用人重链可变区基因片段的较大库取代内源性小鼠重链可变区基因片段。所述人重链可变区基因片段应能够重排并与内源性小鼠重链恒定结构域再结合以形成反向嵌合重链(即包含人可变结构域和小鼠恒定区的重链)。所述重链应能够类别转换和体细胞超突变以产生适宜的重链可变结构域的较大库以供小鼠选择一个能够与人轻链可变区的有限库结合的部分。
具有针对多个重链的共同轻链的小鼠具有实用价值。在不同实施方式中，在仅能表达共同轻链的小鼠中表达的抗体将具有能够与相同或基本相同的轻链结合并表达的重链。这在制备双特异性抗体中特别有用。例如，可以使用第一免疫原对这种小鼠进行免疫以产生表达特异性与第一表位结合的抗体的B细胞。可以使用第二免疫原对所述小鼠(或基因相同的小鼠)进行免疫以产生表达特异性与第二表位结合的抗体的B细胞。可以从B细胞中克隆可变重链区并与相同的重链恒定区和相同的轻链一同表达，并且在细胞中表达以制备双特异性抗体，其中通过结合并表达轻链组分的小鼠选择双特异性抗体的轻链组分。
发明人已经设计了用于制备免疫球蛋白轻链的小鼠，所述轻链适宜地与非常多样化的重链家族配对，包括可变区脱离种系序列的重链，例如亲和性成熟 或体细胞突变的可变区。在不同实施方式中，将所述小鼠设计成将人轻链可变结构域与包含体细胞突变的人重链可变结构域配对，这样能够找到一种制备适用于人类治疗的高亲和性结合蛋白的方法。
基因工程小鼠通过生物体内漫长而复杂的抗体选择过程将人重链可变结构域的多种选择与数量有限的人轻链选择配对以获得生物学上适宜的选择。为了达到这个目的，将所述小鼠工程化修饰以使数量有限的人轻链可变结构域的选择与广泛多样的人重链可变结构域的选择相结合。在使用抗原攻击后，小鼠将其库中解决方式的数量最大化以产生针对抗原的抗体，主要或单独地限制其库中轻链选择的数量。在不同实施方式中，这包括允许小鼠的轻链可变结构域进行适宜的和相容的体细胞突变，这将不仅仅是与相对多种多样的人重链可变结构域具有相容性，还特别地包括体细胞突变的人重链可变结构域。
为获得有限的轻链选择的库，对小鼠进行工程化修饰以使其不能或基本上不能制备或重排天然的小鼠轻链可变结构域。这可以通过例如将小鼠的轻链可变区基因片段缺失实现。然后以使得所述外源性人可变区基因片段能够与所述内源性小鼠轻链恒定区基因组合并且形成重排的反向嵌合轻链基因(人可变区，小鼠恒定区)的方式，通过选择外源性适宜的人轻链可变区基因片段对内源性小鼠基因座进行修饰，外源性人可变区基因片段可操作地与内源性小鼠轻链恒定结构域连接。在不同实施方式中，所述轻链可变区是能够被体细胞突变的。在不同实施方式中，为了使轻链可变区获得体细胞突变的能力达到最大，在小鼠中保留适宜的增强子。例如，在经修饰的小鼠κ轻链基因座中使用人κ轻链基因片段取代内源性小鼠κ轻链基因片段，使小鼠κ内含子增强子和小鼠κ3’增强子的功能保留或未被破坏。
提供了一种基因工程小鼠，所述小鼠表达有限的与多种反向嵌合(人可变区，小鼠恒定区)重链结合的反向嵌合(人可变区，小鼠恒定区)轻链库。在不同实施方式中，内源性小鼠κ轻链基因片段缺失并被与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接的单一(或两个)重排的人轻链区取代。在重排的人轻链区体细胞超突变最大化的实施方式中，保留了小鼠κ内含子增强子和小鼠κ3’增强子。在不同实施方式中，所述小鼠还包含无功能的λ轻链基因座或该基因座的缺失，或者使得所述基因座无法产生λ轻链的缺失。
提供了一种基因工程小鼠，在不同实施方式中，所述小鼠包含缺乏内源性小鼠轻链VL和JL基因片段并且包含重排的人轻链可变区的轻链可变区基因座，在一个实施方式中重排的人VL/JL序列可操作地与小鼠恒定区连接，其中所述基因座能够经历体细胞超突变，并且其中所述基因座表达包含与小鼠恒定区连接的人VL/JL序列的轻链。因此，在不同实施方式中，所述基因座包含小鼠κ3’增强子，其与正常或野生水平的体细胞超突变相关。
在不同实施方式中，当使用所关注的抗原免疫时，基因工程小鼠产生显示出多种人免疫球蛋白重链可变区重排的B细胞，所述人免疫球蛋白重链可变区与一个或两个重排的轻链一同表达并发挥功能，包括其中一个或两个轻链包含人轻链可变区的实施方式，其中所述轻链可变区包括例如1至5个体细胞突变。在不同实施方式中，这样表达的人轻链能够与在小鼠中表达的任意人免疫球蛋白重链可变区结合并一同表达。
与一个以上表位结合的表位结合蛋白
本申请所述的组合物和方法能够用于制备以高亲和性结合一个以上表位的结合蛋白，例如双特异性抗体。本发明的益处包括能够选择适宜的高结合性(例如，亲和成熟的)重链免疫球蛋白链，其均与单一轻链结合。
双特异性结合蛋白的合成和表达仍存在问题，一部分是与鉴定能够与两条不同的重链结合并表达的适宜轻链相关的问题，一部分是分离问题。本申请所述的方法和组合物可以使基因修饰小鼠通过自然过程以外的方法选择能够与一个以上重链结合并表达的适宜轻链，所述重链包括体细胞突变的重链(例如亲和成熟)。来自本申请所述人源化小鼠适宜B细胞的人VL和VH序列能够在具有适宜人恒定区基因序列(例如人IgG1)的表达载体的框架中鉴定和克隆，其中所述小鼠表达具有反向嵌合重链(即人可变区和小鼠恒定区)的亲和成熟的抗体。可以制备两种这种构建体，其中各构建体均编码与不同表位结合的人重链可变结构域。在种系序列中或来自序列已经体细胞突变的B细胞的一种人VLS(例如人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1)可以与适宜人恒定区基因(例如人κ恒定基因)在框架内融合。可以将这三种全人重链和轻链构建体置于适宜细胞中表达。所述细胞将表达两大类：具有相同轻链的同源二聚体重链和具有相同轻链 的异源二聚体重链。为了便于将这些大类分离，对一条重链进行修饰以使其省去蛋白A结合决定簇，这使得同源二聚体结合蛋白与异源二聚体结合蛋白的亲和性出现差异。解决这一问题的组合物和方法参见USSN12/832,838，2010年6月25日提交，名称为“Readily Isolated Bispecific Antibodies with NativeImmunoglobulinFormat”，公开为US2010/0331527A1，其通过引用并入本申请。
在一个方面，提供了本申请所述的表位结合蛋白，其中人VL和VH序列衍生自本申请所述的小鼠，所述小鼠已被包含所关注表位的抗原免疫。
在一个实施方式中，提供了表位结合蛋白，所述蛋白包含第一和第二多肽，所述第一多肽由N端至C端包含选择性与第一表位结合的第一表位结合区，后接包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人IgG的第一CH3区的恒定区；和第二多肽，所述第二多肽由N端至C端包含选择性与第二表位结合的第二表位结合区，后接包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人IgG的第二CH3区的恒定区，其中所述第二CH3区包含降低或消除第二CH3结构域与蛋白A结合的修饰。
在一个实施方式中，所述第二CH3区包含H95R修饰(外显子编号为IMGT；EU编号为H435R)。在另一个实施方式中，所述第二CH3区进一步包含Y96F修饰(IMGT；EU为Y436F)。
在一个实施方式中，所述第二CH3区来自经修饰的人IgG1，并且进一步包括选自由D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)组成的组的修饰。
在一个实施方式中，所述第二CH3区来自经修饰的人IgG2，并且进一步包括选自由N44S、K52N和V82I(IMGT；EU为N384S、K392N和V422I)组成的组的修饰。
在一个实施方式中，所述CH3区来自经修饰的人IgG4，并且进一步包括选自由Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)组成的组的修饰。
一种制备与一种以上表位结合的表位结合蛋白的方法是使用包含所关注的 第一表位的抗原免疫根据本发明的第一小鼠，其中所述小鼠包含内源性免疫球蛋白轻链可变区基因座，所述轻链可变区基因座不含能够重排并形成轻链的内源性小鼠VL，其中在内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因座的是可操作地与小鼠内源性轻链恒定区基因连接的单一重排的人VL区，并且所述重排的人VL区选自人Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1，并且所述内源性小鼠VH基因片段已全部或部分被人VH基因片段取代，以使得由小鼠制备的免疫球蛋白重链完全或基本上是仅包含人可变结构域和小鼠恒定结构域的重链。当免疫后，这种小鼠将制备反向嵌合抗体，所述抗体仅包含两种人轻链可变结构域中的一种(例如人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1中的一种)。一旦编码与所关注表位结合的VH(并且，可选择的VL)的B细胞被鉴定，则可以将VH的核苷酸序列提取(例如通过PRC)并克隆至框架中具有适宜人免疫球蛋白恒定结构域的表达构建体。可以重复这一过程以鉴定与第二表位结合的第二VH结构域，并且可以提取第二VH基因序列并将其克隆至框架中具有第二适宜免疫球蛋白恒定结构域的表达载体。所述第一和第二免疫球蛋白恒定结构域可以是相同或不同的同种型，可以如本申请或US2010/0331527A1所述对免疫球蛋白恒定结构域之一(但不是其他的)进行修饰，并且可以在适宜的细胞中表达表位结合蛋白并基于与同源二聚体表位结合蛋白相比其对蛋白A具有不同的亲和性而进行分离，例如如US2010/0331527A1所述。
在一个实施方式中，提供了一种制备双特异性表位结合蛋白的方法，所述方法包括从本申请所述的小鼠中鉴定第一亲和成熟的(例如包含一个或多个体细胞超突变)人VH核苷酸序列(VH1)，从本申请所述的小鼠中鉴定第二亲和成熟的(例如包含一个或多个体细胞超突变)人VH核苷酸序列(VH2)，如US2010/0331527A1所述，将VH1和缺乏蛋白A决定簇修饰的人重链在框架中克隆以形成重链1(HC1)，如US2010/0331527A1所述，将VH2与含有蛋白A决定簇的人重链在框架中克隆以形成重链2(HC2)，将含有HC1的表达载体和含有HC2的相同或不同的表达载体引入细胞，其中所述细胞还表达包含与人轻链恒定结构域融合的人Vκ1-39/人Jκ5或人Vκ3-20/人Jκ1的人免疫球蛋白轻链，以使得细胞表达包含由VH1编码的VH结构域和由VH2编码的VH结构域的双特异性表位结合蛋白，并且基于与单特异性同源二聚体表位结合蛋白相比其对蛋白 A的亲和性不同而分离双特异性表位结合蛋白。在一个特定实施方式中，HC1是IgG1，和HC2是包含经修饰的H95R(IMGT；EU为H435R)并且进一步包含经修饰的Y96F(IMGT；EU为Y436F)的IgG1。在一个实施方式中，由VH1编码的所述VH结构域、由VH2编码的VH结构域或者这两者为体细胞突变的。
与共同人VL一起表达的人VH基因
将由四种不同抗原激发的亲和性成熟的抗体的多种人可变区与其同源轻链或者至少一个选自人Vκ1-39Jκ5、人Vκ3-20Jκ1或人VpreBJλ5的人轻链一起表达(参见实施例10)。对于针对各抗原的抗体而言，来自不同基因家族的体细胞突变的高亲和重链成功与重排的人种系Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1区配对并且由表达重链和轻链的细胞分泌。对于Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1而言，衍生自下述人VH基因家族的VH结构域优先表达：1-2、1-8、1-24、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、4-31、4-39、4-59、5-51和6-1。因此，被工程化修饰以表达来自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1之一或二者的有限人VL结构域库的小鼠将产生来自被修饰以使用人VH基因片段取代小鼠VH基因片段的VH基因座的多样性体细胞突变的人VH结构域群。
基因工程化修饰小鼠以表达与单一重排轻链(例如Vκ1-39/J或Vκ3-20/J)结合的反向嵌合(人可变区，小鼠恒定区)免疫球蛋白重链，当使用所关注的抗原免疫时，所述小鼠产生的B细胞包含多样性的人VH重排并且表达具有多样性的高亲和抗原特异性抗体，所述抗体具有多种与阻断抗原与其配体结合的能力和能够与抗体的变体结合的能力相关的性质(参见实施例14至15)。
因此，本申请中描述的小鼠和方法对制备和选择包括体细胞突变的人重链可变结构域的人免疫球蛋白重链可变结构域是有用的，该结果是由多样性重排产生的，其显示出多种多样的亲和性(包括显示出约为纳摩或以下的KD)，多种多样的特异性(包括与相同抗原的不同表位结合)，并且其与相同或基本相同的人免疫球蛋白轻链可变区结合并表达。
在一个方面，将包含人源化的重链可变区基因座的第一小鼠与包含编码如本申请所述的共同或通用轻链基因座的核酸序列的第二小鼠交配。在一个实施方式中，所述第一或第二小鼠包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或 功能性片段的异位核酸序列。繁殖后代以获得对人源化的重链基因座纯合并对通用轻链基因座纯合的小鼠。在一个实施方式中，所述第一或第二小鼠包含对内源性小鼠轻链基因座的修饰以使得内源性小鼠轻链不具有功能(例如缺失或敲除例如λ和/或κ内源性基因座)。在一个实施方式中，所述第一小鼠包含全部或基本上全部功能性内源性小鼠V、D和J基因片段被一个或多个未经重排的人V、D和J基因片段(例如全部或基本上全部功能性人V、D和J基因片段)取代；并且所述小鼠包含全部或基本上全部功能性轻链V和J基因片段被不超过一个或不超过两个重排的轻链V/J序列取代。在一个实施方式中，所述第一小鼠进一步包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的异位核酸序列。在一个实施方式中，所述异位核酸序列在人源化的免疫球蛋白重链基因座。
在一个实施方式中，使用所关注的抗原对包含异位序列并且针对通用轻链基因座和人源化的重链基因座纯合的小鼠进行免疫以产生包含多种体细胞突变的人可变结构域的抗体，所述人可变结构域与通用轻链结合并表达。在一个实施方式中，将在小鼠中鉴定得到的人重链可变结构域核酸序列引入表达***以制备包含人重链可变结构域和含有小鼠通用轻链序列的轻链的全人抗体。
提供下述实施例以便向本领域普通技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而并非旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已尽力确保所使用的数字(例如量，温度等)的准确性，但是应对一些实验误差和偏差予以考虑。除非另有明示，否则份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度以摄氏度表示和压力处于或接近大气压。
实施例
实施例I
小鼠免疫球蛋白基因的人源化
使用人和小鼠细菌人工染色体(BAC)对13种不同的BAC目标载体(BACvec)进行工程改造，以对小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座进行人源化。表1和表2分别给出了构建用于小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座的人源化的所有BACvec所执行的步骤的详细描述。
人和小鼠BAC的鉴别
通过具有BAC文库的滤器的杂交或通过PCR筛选小鼠BAC文库DNA池，鉴别了跨越免疫球蛋白重链和κ轻链基因座的5’和3’端的小鼠BAC。使用与目的区域相对应的探针，在标准条件下杂交滤器。通过PCR并使用侧接被靶向的目的区域的独特引物对筛选文库池。使用相同引物执行另外的PCR以对给定孔进行去卷积(deconvolute)，并分离对应的目的BAC。BAC滤器和文库池两者都是从129SvJ小鼠ES细胞(Incyte Genomics/Invitrogen)产生的。通过具有BAC文库(Caltech B、C或D文库和RPCI-11文库，Research Genetics/Invitrogen)的滤器的杂交，通过采用基于PCR的方法筛选人BAC文库池(Caltech文库，Invitrogen)，或通过使用BAC末端序列数据库(Caltech D文库，TIGR)，鉴别了覆盖全部免疫球蛋白重链和κ轻链基因座的人BAC。
通过细菌同源重组和连接来构建BACvec
如所描述(Valenzuelaet al.，2003；Zhang Y.et al.，(1998)，A new logic forDNA engineering using recombination in Escherichia coli，Nat Genet20：123-128)的那样进行细菌同源重组(BHR)。在大多数情况下，通过将衍生自PCR的同源盒与被克隆的表达盒连接，随后对连接产物进行凝胶分离并将其电穿孔入携带目标BAC的BHR感受态细菌中，从而产生线性片段。在适当的抗生素皮氏培养皿上进行选择之后，通过跨越两个新接合点之间的PCR，随后在脉冲场凝胶上进行限制酶分析(Schwartz D.C.和Cantor C.R.，(1984)，Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gelelectrophoresis，Cell37：67-75)，并通过使用分布在人序列之间的引物的PCR抽查，从而鉴别正确重组的BAC。
使用3个连续BHR步骤构建了3hVH BACvec，用于免疫球蛋白重链基因座的人源化的初始步骤(图4A和表1)。在第一步(步骤1)中，将一个表达盒引入人亲本BAC中的人VH1-3基因区段上游，所述表达盒含有小鼠免疫球蛋白重链基因座的同源区域(HB1)、在细菌中赋予卡那霉素抗性并且在动物细胞中赋予G418抗性的基因(kanR)以及位点特异性重组位点(例如loxP)。在第二 步(步骤2)中，将第二个表达盒引入到紧邻最后一个JH区段的下游，所述第二个表达盒含有小鼠免疫球蛋白重链基因座的第二同源区域(HB2)和在细菌中赋予大观霉素抗性的基因(specR)。所述第二步包括使JH6下游的人免疫球蛋白重链基因座序列和BAC载体氯霉素抗性基因(cmR)缺失。在第三步(步骤3)中，被双重修饰的人BAC(B1)然后使用已经在前两个步骤中添加的I-CeuI位点进行线性化，并且通过经由所述两个同源区域(HB1和HB2)的BHR整合入小鼠BAC(B2)中。第一(cm/kan)、第二(spec/kan)和第三(cm/kan)步中的药物选择被设计成对期望产物具有特异性。在用限制酶消化之后，通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析被修饰的BAC克隆，以确定适当构建(图4B)。
以类似方式，对12种另外的BACvec进行工程改造，用于重链和κ轻链基因座的人源化。在一些情况下，通过BHR以及对选择性标记物的仔细放置，将稀有的限制位点引入两个亲本BACvec中，藉此进行BAC连接以代替BHR，从而联合两个较大的BAC。这允许期望连接产物在用特异性药物标记物组合进行选择时可以存活。在用稀有限制酶消化之后通过连接所获得的重组BAC以与通过BHR所获得的方式(如上所述)类似的方式进行鉴别和筛选。
表1
表2
胚胎干(ES)细胞的修饰和小鼠的产生。
使用所描述(Valenzuelaet al.，2003)的基因工程方法进行ES细胞(F1H4)靶向。如所述，通过胚泡(Valenzuela et al.，2003)或8细胞注射(Poueymirou etal.，2007)从被修饰的ES细胞产生小鼠。通过在基于PCR的分析中利用多组独特的探针和引物筛选来自ES细胞或小鼠的DNA，从而确认被靶向的ES细胞和小鼠(例如图3A、3B和3C)。所有小鼠研究都经过Regeneron的实验动物护理和使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee；IACUC)监督和批准。
核型分析和荧光原位杂交(FISH)。
通过卡瑞尔细胞库(Coriell Cell Repositories)(Coriell Institute forMedical Research，Camden，NJ)进行染色体组型分析。如所描述(Valenzuelaet al.，2003)的那样对被靶向的ES细胞进行FISH。通过缺口平移(nicktranslation)(Invitrogen)，利用经过荧光标记的dUTP核苷酸光谱橙(spectrum orange)或光谱绿(spectrum green)(Vysis)标记对应于小鼠BAC DNA或人BAC DNA的探针。
免疫球蛋白重链可变基因的基因座。
使用基因工程技术(参看例如美国专利第6,586,251号，和Valenzuelaet al.，2003)，通过用约1百万碱基对(Mb)的含有对应人基因区段的连续人基因组序列直接置换约3Mb的含有所有VH、DH和JH基因区段的连续小鼠基因组序列(图1A和表1)，以9个连续步骤实现重链基因座的可变区的人源化。
JH基因区段与恒定区基因之间的内含子(J-C内含子)含有转录增强子(NeubergerM.S.，(1983)，Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain genetransfected into lymphoid cells，EMBO J2：1373-1378)，在所述转录增强子之后是同种型转换期间的重组所必需的简单重复单元的区域(Kataoka T.et al.，(1980)，Rearrangement of immunoglobulin gamma1-chain gene and mechanism for heavy-chain class switch，PNAS USA77：919-923)。选择人VH-DH-JH区与小鼠 CH区之间的接合点(近端接合点)以维持小鼠重链基因内增强子和转换结构域，从而保持人源化重链基因座在小鼠内的有效表达和种型转换。通过使用 基因工程方法(上文)，这一结合点和随后的接合点在所有置换中的精确核苷酸位置都是可能实现的，其中所述基因工程方法使用由合成的寡核苷酸驱动的细菌同源重组。因此，近端接合点被放置在最后一个JH基因区段下游约200bp处，并且远端接合点被放置在人基因座的5’端的VH基因区段上游几百kb处，并在小鼠VH1-86基因区段(也称为J558.55)下游约9kb处。小鼠VH1-86(J558.55)基因区段是最远端的重链可变基因区段，据报道其是C57BL/6小鼠中的假基因，但在被靶向的129等位基因中可能有活性，虽然其具有不良的RSS序列。小鼠重链基因座的远端据报道可能含有调控基因座表达和/或重排的控制元件(Pawlitzky et al.，2006)。
使用***小鼠IgH基因座近端的含有3个VH、所有27个DH和9个JH人基因区段的144kb人重链基因座近端，并使用约75kb的小鼠同源臂，实现了人免疫球蛋白DNA序列在小鼠中的首次***，与之相伴的是16.6kb的小鼠基因组序列缺失(图2A的步骤A；表1和3的3hVH)。这一144kb大***和伴随的16.6kb缺失是在单个步骤(步骤A)中进行的，发生频率为0.2％(表3)。通过天然等位基因丧失(LONA)分析(Valenzuelaet al.，2003)，使用缺失小鼠序列以内和两边的探针以及在被***的人序列以内的探针，对被正确靶向的ES细胞进行评分，并使用跨越整个***的多个探针验证大的人***物的完整性(图3A、3B和3C)。因为先要进行多轮的连续ES细胞靶向，所以要对这一步以及所有随后步骤的被靶向的ES细胞克隆进行染色体组型分析(上文)，并且只有在17/20展开染色体(spread)中显示正常染色体组型的克隆才被用于随后步骤。
利用BACvec对来自步骤A的被靶向ES细胞进行再靶向，这在重链基因座的远端产生了19kb的缺失(图2A的步骤B)。与步骤A的BACvec上含有新霉素抗性基因(neo)不同，步骤B的BACvec含有潮霉素抗性基因(hyg)。来自两种BACvec的抗性基因经过设计，使得在成功靶向到同一染色体时，大约3Mb的含有所有小鼠VH基因区段而非VH1-86和所有DH基因区段而非DQ52的小鼠重链可变基因座以及所述两个抗性基因被loxP位点侧接；DQ52和所有的小鼠JH链基因区段在步骤A中缺失。通过驱使3hVH近端表达盒在高G418中获 得纯合性(Mortensen R.M.et al.，(1992)，Production of homozygous mutant ES cells with asingle targeting construct，Mol Cell Biol12：2391-2395)并遵从远端hyg表达盒的命运来鉴别同一染色体上被双重靶向的ES细胞克隆。已经通过CRE重组酶的瞬时表达，高效地(最高达约11％)、成功地使最长达4Mb、且已经通过被loxP位点侧接的方式修饰的小鼠区段缺失，即使在不存在药物选择的情况下也如此(Zheng B.et al.，(2000)，Engineeringmouse chromosomes with Cre-loxP：range，efficiency，and somatic applications，MolCell Biol20：648-655)。以类似方式，本发明人实现了在瞬时CRE表达之后在8％的ES细胞克隆中的3Mb缺失(图2A的步骤C；表3)。通过使用在缺失小鼠序列任一端的探针的LONA分析，以及neo和hyg的丧失和在含有唯一剩下的loxP位点的缺失点之间的PCR产物的出现，对所述缺失进行评分。此外，通过荧光原位杂交(数据未显示)证实了所述缺失。
使用基因工程方法，以一系列的5个步骤(图2B的步骤E-H)，将剩余的人重链可变区添加到3hVH等位基因中，其中每个步骤涉及精确***最高达210kb的人基因序列。对于每个步骤，设计每个新的BACvec的近端以部分重叠前一步的最远端人序列，并且每个新的BACvec的远端含有与步骤A中所用的相同的远端小鼠同源区域。步骤D、F和H的BACvec含有neo选择表达盒，而步骤E和G的BACvec则含有hyg选择表达盒，因此在G418与潮霉素之间交替进行选择。通过在3hVH杂合等位基因的远端loxP位点之间的独特PCR产物的丧失来分析步骤D中的靶向。通过前一选择表达盒的丧失来分析步骤E到I中的靶向。在最后一步(图2B的步骤I)中，通过瞬时FLPe表达(Buchholz F.et al.，(1998)，Improvedproperties ofFLP recombinase evolved by cycling mutagenesis，NatBiotechnol16：657-662)去除了被Frt位点侧接的neo选择表达盒(McLeod M.et al.，(1986)，Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in theSaccharomyces cerevisiae plasmid2microns circle，Mol CellBiol6：3357-3367)。步骤D、E和G中的BACvec的人序列是各自来源于两种亲本人BAC，而来自步骤F和H的BACvec的人序列则是来源于单一BAC。使用跨越被***的人序列的多个探针在每个步骤中证实了人序列的保留(如上所述，例如图3A、3B和3C)。只有那些具有正常染色体组型和种 系潜能的克隆才在每个步骤中被继续使用。来自最后一步的ES细胞仍然能够在9个连续操纵之后产生种系(表3)。就每个重链等位基因来说为纯合型的小鼠有活力，表现健康并且显示了基本上为野生型的体液免疫***(参看实施例3)。
表3
免疫球蛋白轻链可变基因的基因座。
通过以与重链所用方式类似的方式，用约0.5Mb的含有近端人Vκ和Jκ基因区段的人序列直接置换约3Mb的含有所有Vκ和Jκ基因区段的小鼠序列，以8个连续步骤对κ轻链可变区进行人源化(图1B；表2和4)。
人κ轻链基因座的可变区含有两个几乎相同的400kb重复单元，这两个重复单元被800kb间隔子隔开(Weichhold G.M.et al.，(1993)，The human immunoglobulin kappalocus consists of two copies that are organized in opposite polarity，Genomics16：503-511)。因为这些重复单元如此类似，所以几乎所有的基因座多样性都可以通过使用所述近端重复单元在小鼠中再现。此外，已经报道了缺少远端重复单元的κ轻链基因座的天然人等位基因(Schaible G.et al.，1993，The immunoglobulin kappa locus：polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid individuals，HumGenet91：261-267)。用约0.5Mb的人κ轻链可变基因序列置换了约3Mb的小鼠κ轻链可变基因序列，以用近端人Vκ和所有的 人Jκ基因区段有效地置换所有的小鼠Vκ和Jκ基因区段(图2C和2D；表2和4)。与实施例1中对于重链基因座所述的方法相反，在添加任何人序列之前，以3步法使整个小鼠Vκ基因区域——其含有所有的Vκ和Jκ基因区段——缺失。首先，在可变区的近端引入neo表达盒(图2C的步骤A)。其次，在κ基因座的远端***hyg表达盒(图2C的步骤B)。loxP位点依然位于每个选择表达盒内，使得CRE处理诱导剩余的3Mb小鼠Vκ区连同两个抗性基因一起缺失(图2C的步骤C)。
使用与重链所用方法(参看实施例1)类似的方法，以4个连续步骤***大小为约480kb并且含有整个免疫球蛋白κ轻链可变区的人基因组片段(图2D；表2和4)，其中最高达150kb的人免疫球蛋白κ轻链序列是在单个步骤中***的。通过瞬时FLPe表达去除最后的潮霉素抗性基因。如同重链一样，在每个步骤之后评估被靶向的ES细胞克隆中的整个人***物的完整性、正常染色体组型和种系潜能。产生了就每个κ轻链等位基因来说为纯合型的小鼠，并且发现这些小鼠是健康的并表现正常。
表4
实施例II
通过将多种人源化的免疫球蛋白等位基因组合产生全人源化的小鼠
在若干位置显微注射如实施例1所描述的携带一部分人免疫球蛋白重链或κ轻链可变谱系的ES细胞，并使所获得的小鼠交配繁殖以产生多种型式的 人源化小鼠，这些小鼠具有比例逐渐增加的人种系免疫球蛋白谱系(表5；图5A和5B)。1(V1)人源化小鼠具有18个人VH基因区段和所有的人DH和JH基因区段，以及16个人Vκ基因区段和所有的人Jκ基因区段。2(V2)人源化小鼠和(V3)人源化小鼠具有增加的可变谱系，分别具有总共39个VH和30个Vκ，以及80个VH和40个Vκ。因为编码小鼠VH、DH和JH基因区段以及Vκ和Jκ基因区段的基因组区域已经被完全置换，所以由任何版本的 人源化小鼠产生的抗体均含有连接到小鼠恒定区上的人可变区。小鼠λ轻链基因座在人源化小鼠的所有版本中保持完整，并且用作各人源化κ轻链基因座的表达效率的比较物。
从实施例1中所描述的一小组等位基因产生了就免疫球蛋白重链和κ轻链人源化来说为双重纯合型的小鼠。在产生双重纯合型小鼠的交配繁殖过程期间所观察到的所有基因型都以粗略的孟德尔比例存在。就每种人重链等位基因来说为纯合型的雄性后代展示了下降的生育力，这是由小鼠ADAM6活性的丧失所引起的。小鼠重链可变基因座含有两个嵌入其中的功能性ADAM6基因(ADAM6a和ADAM6b)。在小鼠重链可变基因座的人源化期间，被***的人基因组序列含有ADAM6假基因。小鼠ADAM6可能是生育力所必需的，因此在人源化重链可变基因座中缺少小鼠ADAM6基因可能会引起这些小鼠生育力下降，尽管存在有人假基因。实施例7-9描述将缺失的小鼠ADAM6基因精确地置换回人源化重链可变基因座中，并用人源化重链免疫球蛋白基因座使小鼠的生育力恢复到野生型水平。
表5
实施例III
在具有人源化免疫球蛋白基因的小鼠中的淋巴细胞群
通过流式细胞术评估了三种不同型式的小鼠中的成熟B细胞群体。
简言之，使用标准方法获得来自于骨髓、脾和胸腺的细胞悬浮液。根据制造商的说明书，将细胞以5×105个细胞/毫升再悬浮于BD Pharmingen FACS染色缓冲液中，用抗小鼠CD16/32(BD Pharmingen)封闭，用适当的抗体混合液染色，并用BD CYTOFIXTM固定。将最后的细胞团再悬浮于0.5mL染色缓冲液中，并使用BD FACSCALIBURTM和BD CELLQUEST PROTM软件进行分析。所有抗体(BD Pharmingen)均是在物质稀释液/混合液中制备的并添加到0.5毫克/105个细胞的最终浓度。用于骨髓染色的抗体混合液(A-D)如下所示：A：抗小鼠IgMb-FITC，抗小鼠IgMa-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC；B：抗小鼠CD43(S7)-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC；C：抗小鼠CD24(HSA)-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC；D：抗小鼠BP-1-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC。用于脾和腹股沟***染色的抗体混合液(E-H)如下所示：E：抗小鼠IgMb-FITC，抗小鼠IgMa-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC；F：抗小鼠Ig，λ1，λ2，λ3轻链-FITC，抗小鼠Igκ轻链-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC；G：抗小鼠Ly6G/C-FITC，抗小鼠CD49b(DX5)-PE，抗小鼠CD11b-APC；H：抗小鼠CD4(L3T4)-FITC，抗小鼠CD45R(B220)-PE，抗小鼠CD8a-APC。结果展示在图6中。
针对标记物B220和IgM的表面表达，对从纯合型人源化小鼠的脾或***分离的淋巴细胞染色，并使用流式细胞术进行分析(图6)。在被测试的所有型式的人源化小鼠中，B220+IgM+成熟B细胞群体的规模与野生型小鼠中的情况几乎相同，而不管它们所含的VH基因区段的数目如何。此外，含有纯合型杂合子人源化的免疫球蛋白重链基因座、但小鼠免疫球蛋白κ轻链正常的小鼠——甚至是只具有3个VH基因区段的那些小鼠，或含有纯合型杂合子人源化的κ轻链基因座并且具有正常小鼠免疫球蛋白重链基因座的小鼠，在其外周隔室中也具有正常数目的B220+IgM+细胞(结果未给出)。这些结果表明，具有人可变基因区段和小鼠恒定区的嵌合基因座可以充 分地存在于成熟B细胞室中。此外，在重链或κ轻链基因座处的可变基因区段的数目与产生野生型成熟B细胞群体的能力无关，因此抗体谱系的理论多样性也与所述能力无关。相反，具有随机整合的完全人免疫球蛋白基因修饰和失活的小鼠免疫球蛋白基因座的小鼠在这些隔室中具有减少的B细胞数目，其中所述缺陷的严重性依赖于基因修饰中所包含的可变基因区段的数目(GreenL. L.and Jakobovits A.，(1998)，Regulation of B cell development by variablegene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeastartificial chromosomes，JExp Med188：483-495)。这证明了“原位基因人源化”策略导致与在“敲除加基因修饰”方法中获得的随机整合的基因修饰根本不同的功能结果。
等位基因的排除和基因座的选择。
在就不同型式的人源化免疫球蛋白重链基因座来说为杂合型的小鼠中检查维持等位基因排除的能力。
免疫球蛋白基因座的人源化在F1ES细胞系(F1H4，Valenzuela et al.，2003)中进行，所述F1ES细胞系来源于129S6/SvEvTac和C57BL/6NTac杂合型胚胎。人重链种系可变基因序列被靶向到129S6等位基因上，所述129S6等位基因携带IgMa单倍型，而未经修饰的小鼠C576BL/6N等位基因则携带IgMb单倍型。这些IgM的等位基因形式可以通过流式细胞术，使用对存在于IgMa或IgMb等位基因中的多态性具有特异性的抗体进行区分。如图6(最后一行)所示，在就每种型式的人源化重链基因座来说为杂合型的小鼠中鉴别的B细胞只表达单一等位基因IgMa(人源化等位基因)或IgMb(野生型等位基因)。这证明了等位基因排除中所涉及的机制在人源化小鼠中是完整的。此外，人源化等位基因(IgMa)阳性的B细胞的相对数目与所存在的VH基因区段的数目大致成正比。在1人源化杂合小鼠中，大约30％的B细胞表达人源化免疫球蛋白基因座，其具有18个人VH基因区段，而在 2和3人源化杂合小鼠中，50％的B细胞表达人源化免疫球蛋白基因座，其分别具有39个和80个人VH基因区段(未显示)。值得注意地，表达人源化小鼠等位基因的细胞与表达野生型小鼠等位基因的细胞的比率(在 1人源化小鼠中为0.5，在2人源化小鼠 中为0.9)大于人源化基因座中所含的可变基因区段的数目与野生型基因座中所含的可变基因区段的数目的比率(在1人源化小鼠中为0.2，在2人源化小鼠中为0.4)。这可表明等位基因选择的概率介于对一条或另一条染色体的随机选择与对任何特定V区段RSS的随机选择中间。此外，可能有一部分、但不是全部的B细胞(其中一个等位基因变得可以重组)完成了这个过程并且在另一个等位基因变得可以重组之前关闭重组。此外，具有来源于杂合子人源化的重链基因座或野生型小鼠重链基因座的表面IgM(sIgM)的细胞的水平相当的分布证明了杂合基因座在正常水平下工作。相反，随机整合的人免疫球蛋白基因修饰竞争不过野生型小鼠免疫球蛋白基因座(Bruggemann M.et al.，(1989)，A repertoireof monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice，PNAS86：6709-6713；Green et al.，(1994)；Tuaillon N.et al.，(1993)，Human immunoglobulinheavy-chain minilocus recombination in transgenic mice：gene-segment use in muand gamma transcripts，Proc Natl Acad Sci USA90：3720-3724)。这进一步证明了由人源化小鼠产生的免疫球蛋白在功能上与在由“敲除加基因修饰”方法形成的小鼠中通过随机整合的基因修饰所产生的免疫球蛋白不同。
129S6或C57BL/6N中的Cκ区的多态性不能用于检查人源化κ轻链基因座对非人源化κ轻链基因座的等位基因排除。然而，人源化小鼠都具有野生型小鼠λ轻链基因座，因此，可以观察人源化κ轻链基因座的重排和表达是否能够阻止小鼠λ轻链的表达。与野生型小鼠相比，在 人源化小鼠中，表达人源化κ轻链的细胞的数目相对于表达小鼠λ轻链的细胞的数目的比率相对没有改变，而不管在κ轻链基因座处***的人Vκ基因区段的数目如何(图6，正数第三行)。此外，双阳性(κ加λ)细胞的数目没有增加，表明杂合κ轻链基因座处的大量重组导致小鼠λ轻链基因座的重组被适当抑制。相反，含有随机整合的κ轻链基因修饰并且具有失活的小鼠κ轻链基因座——但小鼠λ轻链基因座为野生型——的小鼠展现出显著增加的λ/κ比率(Jakobovits，1998)，暗示引入的κ轻链基因修饰在这样的小鼠中没有很好地发挥功能。这进一步证明，与由“敲除加基因修饰”小鼠所形成的免疫球蛋白相比，在由人源化小鼠所形成的免疫球蛋白中观察到了不同 的功能结果。
B细胞发育。
因为小鼠中的成熟B细胞群体类似于野生型小鼠中的成熟B细胞群体(如上所述)，所以早期B细胞分化的缺陷可以通过成熟B细胞群体的扩增而被补偿。通过使用流式细胞术分析B细胞群体来检查B细胞分化的各个阶段。表6列出了小鼠相比于野生型同窝幼崽中的每种B细胞谱系中的细胞分数的比率，所述细胞分数是使用特异性细胞表面标记物通过FACS确定的。
早期B细胞发育在骨髓中发生，并且B细胞分化的不同阶段的特征在于细胞表面标记物表达的类型和量的变化。表面表达的这些差异与细胞内部的免疫球蛋白基因座处发生的分子变化有关。原B细胞(pro-B cell)到前B细胞(pre-B cell)的转变需要功能性重链蛋白的成功重排和表达，而从前B阶段到成熟B阶段的转变是通过κ或λ轻链的正确重排和表达来控制的。因此，B细胞分化的各个阶段之间的无效转变可以通过指定阶段的相对B细胞群体的变化来检测。
表6
在任何人源化小鼠中都没有观察到B细胞分化的重大缺陷。在人源化小鼠中，人重链基因区段的引入似乎并不影响原B到前B的转变，并且人κ轻链基因区段的引入并不影响前B到B的转变。这证明了具有人可变区和小鼠恒定区的“反转嵌合”免疫球蛋白分子在B细胞 信号传导和共受体分子的背景下正常发挥功能，从而在小鼠环境中引起适当的B细胞分化。相反，在含有随机整合的免疫球蛋白基因修饰和失活的内源重链或κ轻链基因座的小鼠中，在B细胞分化期间不同群体之间的平衡受到不同程度的干扰(Green and Jakobovits，(1998))。
实施例IV
在人源化免疫球蛋白小鼠中的可变基因库
通过来自于多种来源(包括脾细胞和杂交瘤细胞)的人可变区的反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)，分析了人源化小鼠的人源化抗体谱系中的人可变基因区段的使用情况。测定了可变区序列、基因区段的使用、体细胞超突变、以及重排的可变区基因区段的接合多样性。
简言之，使用TRIZOLTM(Invitrogen)或Qiagen RNEASYTM迷你试剂盒(Qiagen)从1×107-2×107个脾细胞或约104-105个杂交瘤细胞提取总RNA，并使用SUPERSCRIPTTM III一步RT-PCR***(Invitrogen)，用小鼠恒定区特异性引物引发。使用前述3’恒定区特异性引物，用2-5tL来自每种样品的RNA进行反应，所述3’恒定区特异性引物与重链和κ轻链两者的每个人可变区家族的汇集的前导引物分别配对。试剂和引物的体积以及RT-PCR/PCR条件根据制造商的说明书进行。引物序列基于多种来源(Wang X.and Stollar B.D.，(2000)，Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR，JImmunol Methods244：217-225；Ig-primer sets，Novagen)。适当时，用汇集的家族特异性框架引物和在初级反应中使用的相同小鼠3’免疫球蛋白恒定区特异性引物进行巢式二级PCR反应。通过琼脂糖电泳分析来自于每个反应系的等分试样(5μL)，并使用MONTAGETM凝胶提取试剂盒(Millipore)从琼脂糖纯化反应产物。使用TOPOTM TA克隆***(Invitrogen)克隆被纯化的产物，并通过电穿孔将其转化入DH10β大肠杆菌细胞中。从每个转化反应系中选择单独的克隆，并使其在2mL存在抗生素选择的LB肉汤培养物中在37℃下生长过夜。通过基于试剂盒的方法(Qiagen)从细菌培养物纯化质粒DNA。
免疫球蛋白可变基因的使用。
在ABI3100基因分析仪(Applied Biosystems)上，用T7或M13反向引物对重链和κ轻链克隆两者的质粒DNA测序。将原始序列数据输入SEQUENCHERTM(v4.5，Gene Codes)。将每个序列组装成毗连序列群，并使用IMGT V-Quest(Brochet X.et al.，(2008)，IMGT/V-QUEST：the highly customized and integrated system for IG and TR standardizedV-J and V-D-J sequence analysis，NucleicAcidsRes36：W503-508)搜索功能与人免疫球蛋白序列进行比对，以鉴别人VH、DH、JH和Vκ、Jκ区段的使用。将序列与种系序列相比较以分析体细胞超突变和重组接合。
通过RAG补偿法(Chen J.et al.，(1993)，RAG-2-deficient blastocystcomplementation：an assay of gene function in lymphocyte development，Proc NatlAcad Sci USA90：4528-4532)从含有初始重链修饰(3hVH-CRE杂合等位基因，图2A的底部)的ES细胞产生小鼠，并从脾细胞RNA制备cDNA。使用针对所预测的嵌合重链mRNA具有特异性的引物组(上文描述)扩增cDNA，所述嵌合重链mRNA将通过被***的人基因区段内的V(D)J重组和随后的与小鼠IgM或IgG恒定域的剪接而产生。来源于这些cDNA克隆的序列(未显示)表明，已经在人可变基因序列内发生了正确的V(D)J重组，重排的人V(D)J基因区段与小鼠恒定域发生了正确的框内剪接，并且已经发生了种型转换重组。对随后的杂合免疫球蛋白基因座的mRNA产物进行了进一步的序列分析。
在一项类似实验中，基于B220和IgM或者IgG的表面表达，通过流式细胞术分离来自于非经免疫的野生型和人源化小鼠的B细胞。汇集B220+IgM+或表面IgG+(sIgG+)细胞，并在RT-PCR扩增和克隆(如上所述)之后获得VH和Vκ序列。记录了来自于非经免疫的1人源化小鼠(表7)和3人源化小鼠(表8)的一组RT-PCR扩增的cDNA中的代表性基因的使用(*缺陷型RSS；缺失或假基因)。*：具有缺陷型RSS的基因区段。：基因区段缺失或为假基因。
表7
表8
如表7和8所示，利用了几乎所有的功能性人VH、DH、JH、Vκ和Jκ基因区段。在已被描述但未在这个实验的人源化小鼠中检测到的功能性可变基因区段中，已经报道了其中的一些具有缺陷型重组信号序列(RSS)，并且因此预期不会被表达(FeeneyA.J.(2000)，Factors that influence formation ofB cell repertoire，ImmunolRes21：195-202)。对来自于各 人源化小鼠的一些其它组的免疫球蛋白序列(分离自原初和经免疫谱系)的分析已经显示了对这些基因区段的使用，但是频率较低(数据未显示)。合计的基因使用数据显示，在人源化小鼠中所含的所有功能性人VH、DH、JH、Vκ和Jκ基因区段都已经在各原初和经免疫谱系中观察到(数据未显示)。虽然已经在对人重链基因座序列的分析中鉴别了人VH7-81基因区段(Matsuda F.et al.，(1998)，The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavychain variable region locus，J Exp Med188：2151-2162)，但是其并不存在于人源化小鼠中，这通过对整个3人源化小鼠基因组的重新测序所证实。
已知抗体的重链和轻链序列显示不同寻常的可变性，特别是在重排的可变区内的短多肽区段中。这些区域被称为高变区或互补决定区(CDR)，其产生抗 体分子结构中的抗原结合位点。居间的多肽序列被称为框架区(FR)。在重链和轻链中有3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)和4个FR(FR1、FR2、FR3、FR4)。有一个CDR，即CDR3，是独特的，原因在于这个CDR是通过VH、DH和JH以及Vκ和Jκ基因区段的重组产生的，并且在遇到抗原之前产生大量的谱系多样性。由于经由核酸外切酶活性的核苷酸缺失和经由末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的非模板编码的添加物，这种接合是不精确的，因此重组过程可能会产生新的序列。尽管，由于可变区作为整体具有较高的可突变性，FR可以显示出显著的体细胞突变，但是可变性并不均匀地分布在可变区之间。CDR是抗体分子表面中允许抗原结合的集中且局部化的高变区。图7A和7B分别显示了来自于人源化小鼠的所选抗体在证明了接合多样性的CDR3接合点周围的重链和轻链序列。
如图7A所示，在来自人源化小鼠的抗体中的VH-DH和DH-JH接点处都观察到非模板编码的核苷酸添加(N-添加)，表明TdT与所述人区段有着正确的功能。VH、DH和JH区段相对于其种系对应区段的端点表明还存在核酸外切酶活性。与重链基因座不同，人κ轻链重排在CDR3处展现了很少的TdT添加，或不展现TdT添加，所述CDR3是通过Vκ和Jκ区段的重组形成的(图7B)。这是预期得到的，因为在前B到B细胞的转变中在轻链重排期间在小鼠中缺少TdT表达。在重排的人Vκ区的CDR3中观察到的多样性主要是通过核酸外切酶活性在重组事件期间被引入的。
体细胞超突变
通过被称为体细胞超突变的方法，在生发中心反应期间，将额外的多样性添加到重排的免疫球蛋白基因的可变区中。表达经过体细胞突变的可变区的B细胞与其它B细胞竞争结合由滤泡树突细胞所呈递的抗原。对所述抗原具有更高亲和力的那些B细胞将进一步扩增并经历种型转换，然后退回到外周。因此，典型地，表达转换的同种型的B细胞已经遇到了抗原并且经历了生发中心反应，并且相对于原初B细胞将具有增加数目的突变。还预期，与来自于已经历了抗原选择的sIgG+B细胞的可变序列相比，来自于主要为原初sIgM+B细胞的可变区序列将具有相对更少的突变。
将来自于非经免疫的人源化小鼠的sIgM+或sIgG+B细胞或来自于经免疫的小鼠的sIgG+B细胞的随机VH或Vκ克隆的序列与其种系可变基因区段进行比较，并且对相对于种系序列的变化进行注释。以电脑模拟法(in silico)翻译得到的核苷酸序列，并且也注释了导致氨基酸变化的突变。核对来自所有的可变区的数据，并且计算指定位置的变化百分比(图8)。
如图8所示，来源于非经免疫的人源化小鼠的sIgG+B细胞的人重链可变区相对于来自于相同脾细胞池的sIgM+B细胞展现出更多的核苷酸，并且来源于经免疫的小鼠的重链可变区甚至展现出更多的变化。相对于框架区，在互补决定区(CDR)中的变化数增加，表明有抗原选择。相对于IgM，IgG中来自于人重链可变区的对应氨基酸序列也展现了显著更高数目的突变，并且在经免疫的IgG中甚至更多。同样地，与框架序列相比，这些突变似乎在CDR中更为频繁，暗示所述抗体是在体内经过抗原选择的。在来源于经免疫的小鼠的IgG+B细胞的Vκ序列中，观察到核苷酸和氨基酸突变数目的类似增加。
在人源化小鼠中观察到的基因使用和体细胞超突变频率证明了所存在的基本上所有基因区段都能够重排从而在这些小鼠中形成完全功能反转的嵌合抗体。此外，人源化小鼠衍生的抗体充分参与到小鼠免疫***中，以经历亲和力选择和成熟，从而产生可有效中和其目标抗原的完全成熟人抗体。人源化小鼠能够针对多种类别的抗原产生稳固的免疫应答，从而可使用具有高亲和力并且适合于治疗应用的大量抗体(数据未显示)。
实施例V
***构和血清同种型分析
通过光学显微术检查来自于野生型或人源化小鼠并用H&E染色的组织样品的脾、腹股沟***、派氏结(Peyer's patches)和胸腺的总体结构。使用LUMINEXTM技术分析从野生型和人源化小鼠收集的血清中的免疫球蛋白同种型的水平。
淋巴器官的结构
淋巴样组织的结构和功能部分依赖于造血细胞的正确发育。B细胞发育或功能的缺陷可以表现为淋巴样组织的结构的变化。在分析被染色的组织切片时，没有发现野生型与人源化小鼠之间的二级淋巴样器官的外观有显著差异(数据未显示)。
血清免疫球蛋白水平
每种同种型的表达水平在野生型和人源化小鼠中是类似的(图9A、9B和9C)。这证明了可变基因区段的人源化对种型转换或免疫球蛋白表达和分泌不具有明显的不利影响，因此显然会维持这些功能所必需的所有内源小鼠序列。
实施例VI
在人源化免疫球蛋白的小鼠中免疫和产生抗体
用抗原对不同型式的人源化小鼠进行免疫以检查针对外来抗原攻击的体液应答。
免疫和杂交瘤的开发。
可以用以下形式的抗原对人源化和野生型小鼠进行免疫：蛋白质、DNA、DNA和蛋白质的组合、或表达所述抗原的细胞。通常会每三周对动物进行一次加强免疫，总共2到3次。在每次抗原加强免疫之后，收集来自于每个动物的血清样品，并通过血清滴度测定法分析抗原特异性抗体应答。在融合之前，小鼠通过腹膜内和/或静脉内注射接受最后一次的5μg蛋白质或DNA(根据需要)的融合前加强免疫。收获脾细胞并根据制造商建议的方案(Cyto Pulse Sciences Inc.，Glen Burnie，MD)在电融合室内将其与Ag8.653骨髓瘤细胞融合。在培养后10天，使用ELISA分析(HarlowE.和Lane，D.(1988)，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，New York)就抗原特异性筛选杂交瘤。或者，直接从经免疫的人源化小鼠分离抗原特异性B细胞，并使用标准技术(包括本文所描述的那些技术)进行筛选， 以获得对目的抗原具有特异性的人抗体(例如参看US2007/0280945A1，其以全文引用的方式并入本文中)。
血清滴度测定。
为了监测动物抗抗原血清应答，在每次加强免疫后约10天时收集血清样品，并使用抗原特异性ELISA测定滴度。简言之，将Nunc MAXISORPTM96孔板在4℃用2μg/mL抗原涂布过夜，并用牛血清白蛋白(Sigma，St.Louis，MO)封闭。使3倍系列稀释的血清样品在室温下结合到平板上，持续1小时。然后用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤平板，并使用HRP缀合的山羊抗小鼠Fc(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.，West Grove，PA)或使用生物素标记的同种型特异性或轻链特异性多克隆抗体(Southern Biotech Inc.)分别检测结合的IgG的总IgG滴度或同种型特异的滴度。对于生物素标记的抗体，在平板洗涤之后添加HRP缀合的抗生蛋白链菌素(Pierce，Rockford，IL)。使用例如BD OPTEIATM(BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA)等比色底物使所有平板显色。在用1M磷酸终止反应之后，记录450nm下的光吸收，并使用来自于Graph Pad的PRISMTM软件分析数据。获得两倍背景信号所需的稀释度被定义为滴度。
在一个实验中，用人白细胞介素-6受体(hIL-6R)对人源化小鼠进行免疫。图10A和10B显示了用hIL-6R免疫的和野生型小鼠的一组代表性的血清滴度。
人源化和野生型小鼠针对IL-6R产生了强有力的应答，并且滴度范围相当(图10A)。来自于人源化和同龄野生型的若干小鼠在单次抗原加强免疫后达到最大应答。这些结果表明，针对这种抗原的免疫应答强度和动力学在人源化和野生型小鼠中是类似的。进一步分析这些抗原特异性抗体应答，以检查存在于血清中的抗原特异性抗体的具体同种型。人源化和野生型组两者主要引发IgG1应答(图10B)，暗示体液应答期间的种型转换在每种类型的小鼠中都是类似的。
与抗原在溶液中结合的抗体的亲和性测定。
典型地设计基于ELISA的溶液竞争分析以测定抗体对抗原的结合亲和力。
简言之，将条件培养基中的抗体预先与系列稀释的0到10mg/mL的抗原蛋白混合。然后将该抗体和抗原混合物的溶液在室温下孵育2到4小时，以达到结合平衡。然后使用定量夹心ELISA测量混合物中游离抗体的量。将96孔MAXISORBTM板(VWR，West Chester，PA)在4℃用PBS溶液中的1μg/mL抗原蛋白涂布，随后进行BSA非特异性封闭。然后将该抗体-抗原混合物溶液转移到这些平板上，随后孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤平板，并用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体试剂(Jackson Immuno Research Lab)检测平板结合的抗体，并使用例如BD OPTEIATM(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)等比色底物进行显色。在用1M磷酸终止反应之后，记录450nm下的光吸收，并使用来自于Graph Pad的PRISMTM软件分析数据。用4参数拟合分析法分析所述信号对溶液中的抗原浓度的依赖性，并报道为IC50，IC50是在溶液中不存在抗原的情况下使来自抗体样品的信号实现50％下降所需的抗原浓度。
在一个实验中，用hIL-6R对人源化小鼠进行免疫(如上所述)。图11A和11B显示对来自于人源化和野生型小鼠的抗hIL6R抗体的一组代表性的亲和力测量值。
在经免疫的小鼠接受第三次抗原加强免疫之后，使用ELISA测定血清滴度。从所选的野生型和人源化同龄小鼠分离脾细胞，并与Ag8.653骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤并在选择(如上所述)下生长。在产生的总共671个抗IL-6R杂交瘤中，发现236个表达抗原特异性抗体。使用溶液竞争ELISA，利用从抗原阳性孔收获的培养基测定抗体与抗原的结合亲和力。来源于人源化小鼠的抗体展现出宽范围的与溶液中的抗原结合的亲和力(图11A)。此外，发现236个抗IL-6R杂交瘤中有49个在离体生物分析中封闭了IL-6与受体的结合(数据未显示)。此外，这49个抗IL-6R封闭抗体展现了与来源于平行免疫的野生型小鼠的封闭抗体类似的高溶液亲和力范围(图11B)。
实施例VII
小鼠ADAM6目标载体的构建
使用基因工程技术(上文)构建了用于将小鼠ADAM6a和ADAM6b基因***人源化重链基因座的目标载体，以修饰细菌人工染色体(BAC)929d24，其获自FredAlt博士(哈佛大学)。对929d24BAC DNA进行工程改造以使其包含含有小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的基因组片段和用于使人ADAM6假基因(hADAM6Ψ)定点缺失的潮霉素表达盒，所述人ADAM6假基因位于人源化重链基因座的人VH1-2与VH6-1基因区段之间(图12)。
首先，从929d24BAC克隆亚克隆含有小鼠ADAM6b基因、约800bp的上游(5’)序列和约4800bp的下游(3’)序列的基因组片段。另行从929d24BAC克隆亚克隆含有小鼠ADAM6a基因、约300bp的上游(5’)序列和约3400bp的下游(3’)序列的第二基因组片段。将含有小鼠ADAM6b和ADAM6a基因的这两个基因组片段连接到被Frt重组位点侧接的潮霉素表达盒上，以产生目标载体(小鼠ADAM6目标载体，图20；SEQ ID NO：3)。将不同的限制酶位点工程改造到该目标载体小鼠ADAM6b之后的5’端上和小鼠ADAM6a基因之后的3’端上(图12底部)，用于连接到人源化重链基因座中。
对含有人重链可变基因座(包括位于人源化基因座的人VH1-2与VH6-1基因区段之间的人ADAM6假基因)置换了小鼠重链基因座位的BAC克隆进行另外的修饰，用于随后连接小鼠ADAM6目标载体(图13)。
简言之，对被loxP重组位点侧接的新霉素表达盒进行工程改造以包含含有人VH1-2基因区段的3’位置(对于hADAM6Ψ是5’)和人VH6-1基因区段的5’位置(对于hADAM6Ψ是3’；参看图13中间)的人基因组序列的同源臂。这个靶向构建体的***位点的位置是人ADAM6假基因5’的约1.3kb和3’的约350bp。该靶向构建体还包含与小鼠ADAM6目标载体相同的限制位点，以允许在被修饰的含有人ADAM6假基因缺失的BAC克隆与小鼠ADAM6目标载体之间随后进行BAC连接。
在来源于两个构建体的BAC DNA被消化之后，将基因组片段连接到一起以构建经工程改造的含有人源化重链基因座的BAC克隆，所述人源化重链基因座含有异位放置的包含小鼠ADAM6a和ADAM6b核苷酸序列的基因组序列。用于在ES细胞中使人源化重链基因座内的人ADAM6基因缺失并***小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的最终靶向构建体从5’到3’含有：含有人VH1-2基因 区段的3’的约13kb人基因组序列的5’基因组片段，小鼠ADAM6b基因下游约800bp的小鼠基因组序列，小鼠ADAM6b基因，小鼠ADAM6b基因上游约4800bp的基因组序列，5’Frt位点，潮霉素表达盒，3’Frt位点，小鼠ADAM6a基因下游约300bp的小鼠基因组序列，小鼠ADAM6a基因，小鼠ADAM6a基因上游约3400bp的小鼠基因组序列，和含有人VH6-1基因区段的5’的约30kb人基因组序列的3’基因组片段(图13底部)。
使用被工程改造的BAC克隆(如上所述)对含有人源化重链基因座的小鼠ES细胞进行电穿孔，以产生被修饰的ES细胞，其包含在人源化重链基因座内异位放置的包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的小鼠基因组序列。使用TAQMANTM探针，通过定量PCR分析(Lie Y.S.和Petropoulos C.J.，(1998)，Advances in quantitative PCR technology：5’nucleaseassays，Curr OpinBiotechnol 9(1)：43-48)鉴别在人源化重链基因座内含有异位小鼠基因组片段的阳性ES细胞。使用位于被修饰区域内的引物和探针，通过PCR证实在人源化重链基因座的被修饰部分外部的上游和下游区域，从而证实人源化重链基因座内的异位小鼠基因组序列以及潮霉素表达盒的存在情况。在上游***点之间的核苷酸序列包括以下序列，其指示该***点上游的人重链基因组序列和与存在于***点处的小鼠基因组序列邻接地连接的I-CeuI限制位点(下文中包含在括号内的序列)：
(CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGATGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTATAACGGTCCT AAGGTAGCGA G)GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCCTCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG (SEQ ID NO：4)。在被靶向区域的3’端的下游***点之间的核苷酸序列包括以下序列，其指示小鼠基因组序列和与***点下游的人重链基因组序列邻接地连接的PI-SceI限制位点(下文中包含在括号内的序列)：(AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAAGCGGG CATCTGCTGACATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGAGCTCCA CCGCGGTGGC GCCATTTCAT TACCTCTTTCTCCGCACCCG ACATAGATAAAGCTT)ATCCCCCACC AAGCAAATCC CCCTACCTGG GGCCGAGCTTCCCGTATGTG GGAAAATGAA TCCCTGAGGT CGATTGCTGC ATGCAATGAA ATTCAACTAG(SEQ ID NO：5)。
将如上所述的被靶向ES细胞用作供体ES细胞，并通过小鼠工程方法(参看例如美国专利号7,6598,442、7,576,259、7,294,754)引入8细胞阶段的小鼠胚胎中。使用检测人源化重链基因座内小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的存在的等位基因分析的一种改良方法(Valenzuelaet a1.，2003)，通过基因分型来鉴别携带人源化重链基因座的小鼠，所述人源化重链基因座含有包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位小鼠基因组序列。
使携带含有小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的人源化重链基因座的小鼠交配繁殖获得FLPe缺失小鼠品系(参看例如Rodríguez C.I.et a1.，(2000)，High-efficiency deletermice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP.Nature Genetics25：139-140)，以去除由目标载体引入的任何具有Frt的潮霉素表达盒，所述潮霉素表达盒例如在ES细胞阶段或在胚胎中没有被去除。任选地，潮霉素表达盒保留在小鼠中。
对幼崽进行基因分型，并选择就含有异位小鼠基因组片段(其包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列)的人源化重链基因座来说为杂合型的幼崽，用于表征小鼠ADAM6基因表达和生育力。
实施例VIII
ADAM6挽救小鼠的表征
流式细胞术。
处死就人重链和人κ轻链可变基因座(H/κ)来说为纯合型的25周大的3只小鼠和就人重链和人κ轻链来说为纯合型并在人重链基因座的两个等位基因内具有编码小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的异位小鼠基因组片段的18-20周大的3只小鼠(H/κ-A6)，用于在BD LSR IISystem(BD Bioscience)上通过FACS鉴别和分析淋巴细胞群体。针对特异性细胞谱系对淋巴细胞进行门控，并通过B细胞发育的各阶段分析这些淋巴细胞的发展。从动物收集的组织包括血液、脾和骨髓。将血液收集到含有EDTA的BD microtainer管(BD Biosciences)中。通过用补充有胎牛血清、丙酮酸钠、HEPES、2-巯基乙醇、非必需氨基酸和庆大霉素的完全RPMI培养基进行冲洗而从股骨收集骨髓。用基于氯化铵的裂解缓冲液(例如ACK裂解缓冲液)裂解来自于血液、脾和骨髓制剂的红细胞，随后用完全RPMI培养基洗涤。
为了对细胞群体染色，将来自于各种组织来源的1×106个细胞与抗小鼠CD16/CD32(2.4G2，BD Biosciences)在冰上一起孵育10分钟，随后用以下抗体混合液中的一种或其组合在冰上标记30分钟。
骨髓：抗小鼠FITC-CD43(1B11，BioLegend)，PE-ckit(2B8，BioLegend)，PeCy7-IgM(II/41，eBioscience)，PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a，BioLegend)，APC-eFluor780-B220(RA3-6B2，eBioscience)，A700-CD19(1D3，BD Biosciences)。
外周血和脾：抗小鼠FITC-κ(187.1，BD Biosciences)，PE-λ(RML-42，BioLegend)，PeCy7-IgM(II/41，eBioscience)，PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a，BioLegend)，APC-CD3(145-2C11，BD)，A700-CD19(1D3，BD)，APC-eFluor780-B220(RA3-6B2，eBioscience)。在与被标记的抗体一起孵育之后，对细胞进行洗涤并固定在2％甲醛中。在LSRII流式细胞仪上进行数据采集并用FlowJo分析。图14-18显示了来自于代表性H/κ和H/κ-A6小鼠的结果。
这些结果证明了H/κ-A6小鼠的B细胞以类似于H/κ小鼠的方式在骨髓和外周隔室中经历B细胞发育的各阶段，并且这些B细胞一旦进入外周就显示正常的成熟模式。H/κ-A6小鼠与H/κ小鼠相比展示了增加的CD43intCD19+细胞群体(图16B)。这可能表明在H/κ-A6小鼠中，含有包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位小鼠基因组片段的人源化重链基因座中的IgM表达被加速。在外周，H/κ-A6小鼠的B和T细胞群体表现正常并且与H/κ小鼠类似。
睾丸形态和***表征
为了确定具有人源化免疫球蛋白重链可变基因座的小鼠的不育是否是因为睾丸和/或***产生缺陷，检查了睾丸形态以及附睾的***含量。
简言之，在保持附睾完整的情况下切下来自两组，每组五只老鼠(第1组：就人重链和κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠，mADAM6-/-；第2组：就人 重链可变基因座来说为杂合型并且就κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠，mADAM6+/-)的睾丸，并称重。然后将样本固定，埋入石蜡中，切片并用苏木精和曙红(HE)染色剂染色。对睾丸切片(每只小鼠2个睾丸，总共20个)检查形态缺陷和***产生证据，而对附睾切片则检查***的存在。
在这个实验中，在mADAM6-/-小鼠与mADAM6+/-小鼠之间没有观察到睾丸重量或形态的差别。在所有基因型的睾丸和附睾中都观察到了***。这些结果证实了不存在小鼠ADAM6a和ADAM6b基因并不会导致睾丸形态的可检测的变化，并且在存在和不存在这两种基因的情况下在小鼠中都产生了***。雄性ADAM6-/-小鼠的生育力缺陷因此不可能是因为***产量低的缘故。
***运动性和迁移。
因为***运动性或迁移性的缺陷，缺少其它ADAM基因家族成员的小鼠是不育的。***迁移性被定义为***从子宫进入输卵管的能力，并且通常是小鼠受精所必需的。为了确定小鼠ADAM6a和ADAM6b的缺失是否影响这个过程，评估了mADAM6-/-小鼠中的***迁移性。还评估了***的运动性。
简言之，从以下小鼠的睾丸获得***：(1)就人重链可变基因座来说为杂合型并且就人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(ADAM6+/-)；(2)就人重链可变基因座来说为纯合型并且就人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(ADAM6-/-)；(3)就人重链可变基因座来说为纯合型并且就野生型κ轻链来说为纯合型的小鼠(ADAM6-/-m)；和(4)野生型C57BL/6小鼠(WT)。通过检查没有在***计数或总体***运动性方面观察到显著异常。对于所有小鼠，观察到卵丘分散，表明每个***样品均能够在体外穿透卵丘细胞并结合透明带。这些结果证明了ADAM6-/-小鼠具有能够穿透卵丘并结合透明带的***。
使用来自于如上所述的小鼠的***进行小鼠卵子的体外受精(IVF)。在IVF后第二天，在ADAM6-/-小鼠中存在略微更少数目的裂解胚胎，以及更小数目的与卵子结合的***。这些结果证明了来自于ADAM6-/-小鼠的***一旦接触卵子就能够穿透卵丘并结合透明带。
在另一个实验中，在***迁移性分析中测定来自于ADAM6-/-小鼠的***从子宫迁移通过输卵管的能力。
简言之，为第一组5只超***的雌性小鼠提供5只ADAM6-/-雄性小鼠。为第二组5只超***的雌性小鼠提供5只ADAM6+/-雄性小鼠。观察交配小鼠对的***，并且在***后5到6小时从所有雌性小鼠取出子宫和所连接的输卵管，并对其进行冲洗，用于分析。检查冲洗溶液中的卵子以验证***并获得***计数。以两种不同方式评估***迁移性。第一种方式是，从子宫取下两条输卵管，用生理盐水冲洗，并对所鉴别的任何***计数。卵子的存在也被记录为***的证据。第二种方式是，保持输卵管与子宫连接并将两个组织固定，埋入石蜡中，切片并染色(如上所述)。对切片检查子宫和两条输卵管中的***的存在。
对于和5只ADAM6-/-雄性小鼠交配的雌性小鼠，在输卵管的冲洗溶液中发现非常少的***。来自和5只ADAM6+/-雄性小鼠交配的5只雌性小鼠的输卵管的冲洗溶液所展现的***水平是来自和5只ADAM6-/-雄性小鼠交配的5只雌性小鼠的输卵管的冲洗溶液中的***水平的大约25到30倍(平均值，n=10条输卵管)。
制备了子宫和输卵管的组织切片。对切片检查子宫和输卵管(colliculustubarius)中的***存在。对输卵管和子宫的组织切片的检查揭露了对于和ADAM6-/-小鼠交配的雌性小鼠来说，在子宫中发现了***，但在输卵管中没有发现***。此外，来自和ADAM6-/-小鼠交配的雌性小鼠的切片揭露了在子宫输卵管接头(UTJ)没有发现***。在来自于和ADAM6+/-小鼠交配的雌性小鼠的切片中，在UTJ和输卵管中鉴别到了***。
这些结果证明，缺少ADAM6a和ADAM6b基因的小鼠所产生的***展现出体内迁移缺陷。在所有情况下，在子宫内均观察到了***，表明***和***释放明显正常地发生，但在***后在输卵管内观察到很少***，甚至没有观察到***，这是通过***计数或组织学观察所测量的。这些结果证明，缺少ADAM6a和ADAM6b基因的小鼠所产生的***不能从子宫迁移到输卵管。这种缺陷显然会导致不育，因为***不能跨越子宫输卵管接头进入卵子在其中受精的输卵管。总之，所有这些结果一起支持以下假设：小鼠ADAM6基因帮助引导具有正常运动性的***从子宫中迁移出来，通过子宫输卵管接头和输卵管，并因此到达卵子从而实现受精事件。使ADAM6实现这一目的的机制可以被这 些ADAM6蛋白中的行为引导，或者通过与***中的其它蛋白(例如其它ADAM蛋白)协同表达而被引导，如下所述。
ADAM基因家族的表达。
已知ADAM蛋白的复合物作为成熟***表面上的复合物存在。缺少其它ADAM基因家族成员的小鼠随着***成熟而丧失这种复合物，并且展现出成熟***中的多种ADAM蛋白的减少。为了确定ADAM6a和ADAM6b基因的缺少是否以类似方式影响其它ADAM蛋白，分析了来自于睾丸(不成熟***)和附睾(成熟***)的蛋白提取物的Western印迹物，以测定其它ADAM基因家族成员的表达水平。
在这个实验中，分析了来自4只ADAM6-/-和4只ADAM6+/-小鼠组的蛋白提取物。结果显示，睾丸提取物中的ADAM2和ADAM3的表达不受影响。然而，附睾提取物中的ADAM2和ADAM3均显著减少。这证明，在ADAM6-/-小鼠的***中不存在ADAM6a和ADAM6b，可能会在***成熟时对其它ADAM蛋白(例如ADAM2和ADAM3)的表达和(可能)功能具有直接影响。这暗示ADAM6a和ADAM6b是***表面上的ADAM蛋白复合物的一部分，而该复合物可能正确的***迁移是关键性的。
实施例IX
在ADAM6挽救小鼠中任重链可变基因的使用
通过定量PCR分析，使用TAQMANTM探针(如上所述)，针对就人重链和κ轻链可变基因座来说为纯合型的并且缺少小鼠ADAM6a和ADAM6b基因(mADAM6-/-)或含有编码小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的异位基因组片段(ADAM6+/+；参见实施例1)的小鼠测定所选人重链可变基因的使用情况。
简言之，使用小鼠CD19微珠(Miltenyi Biotec)从mADAM6-/-和ADAM6+/+小鼠的脾纯化CD19+B细胞，并使用RNEASYTM迷你试剂盒(Qiagen)纯化总RNA。使用RNase-free DNase柱上处理(Qiagen)取出基因组RNA。使用First Stand cDNA合成试剂盒(Invitrogen)将约200ng mRNA反转录为cDNA中，然后使用ABI7900序列检测***(Applied Biosystems)，用TAQMANTM Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)扩增。将每个基因的相对表达针对小鼠κ恒定区(mCκ)的表达标准化。表10列出了在这个实验中使用的正义/反义/TAQMANTM MGB探针组合。
表9
在这个实验中，在所分析样品中观察了所有四个人VH基因的表达。此外，mADAM6-/-与ADAM6+/+小鼠之间的表达水平是相当的。这些结果证明了远离修饰位点的人VH基因(VH3-23和VH1-69)和邻近修饰位点的人VH基因(VH1-2和VH6-1)都能够重组形成功能性表达的人重链。这些结果证明，包含***人重链基因组序列中的小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位基因组片段不影响基因座内的人重链基因区段的V(D)J重组，并且这些小鼠能够以正常方式重组人重链基因区段以产生功能性重链免疫球蛋白。
实施例X
与所选择的人轻链可变区结合的人重链可变区的鉴定
构建体外表达***以确定单一重排的人种系轻链能否与抗原特异性人抗体 的人重链共表达。
在基因修饰小鼠中产生人抗体的方法是公知的(参见例如，US6,596,541,Regeneron Pharmaceuticals，humanized mouse)。 人源化小鼠技术涉及产生基因修饰小鼠，所述小鼠具有包含与内源性小鼠恒定区的基因组可操作地连接的人重链和轻链可变区的基因组，以使得在对抗原的刺激的应答过程中，小鼠产生包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。编码由人源化小鼠产生的抗体的重链和轻链可变区的DNA是全人的。首先，分离具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和性嵌合抗体。如下文所述，对抗体进行表征并对所需特性进行选择，包括亲和性、选择性、表位等。使用所需的人恒定区取代小鼠的恒定区以产生含有非-IgM同种型的全人抗体，例如野生型或经修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。尽管对恒定区的选择可能根据特定用途而改变，但是在可变区中应保留高亲和性抗原结合和靶特异性特征。
使用促进血管发生的生长因子(抗原C)免疫人源化小鼠，并使用本领域公知的标准技术分离抗原特异性人抗体并针对V基因的使用情况进行测序。将所选择的抗体克隆进入人重链和轻链恒定区并且选择69条重链与3条人轻链之一配对：(1)与人κ恒定区连接的同源κ轻链，(2)与人κ恒定区连接的重排的人种系Vκ1-39Jκ5或(3)与人κ恒定区连接的重排的人种系Vκ3-20Jκ1。使用标准技术将各重链和轻链对共转染至CHO-K1细胞。在ELISA检测中利用抗-人IgG检测上清液中存在的抗体。测定各重链/轻链对的抗体滴度(ng/ml)并将不同重排的种系轻链的滴度与从亲本抗体分子(即重链与同源轻链配对)获得的滴度进行比较以及计算天然滴度的百分率(表10)。VH：重链可变基因。ND：在目前实验条件下未检测到表达。
表10
在一项类似实验中，使用若干不同抗原免疫人源化小鼠并检测抗原特异性人抗体的重链与不同的重排人种系轻链(如上文所述)配对的能力。在这项实验中使用的抗原包括参与胆固醇稳态的酶(抗原A)、参与调节葡萄糖稳态的血清激素(抗原B)、促进血管发生的生长因子(抗原C)和细胞表面受体(抗原D)。从各免疫组的小鼠中分离抗原特异性抗体并且对重链和轻链可变区进行克隆和测序。从重链和轻链序列中，测定V基因的使用情况并选择与其同源轻链或重排的人种系Vκ1-39Jκ5区配对的重链。将各重链/轻链对共转染至CHO-K1细胞并且在ELISA检测中利用抗-人IgG检测上清液中存在的抗体。测定各重链/轻链对的抗体滴度(μg/ml)并将不同重排的种系轻链的滴度与从亲本抗体分子(即重链与同源轻链配对)获得的滴度进行比较以及计算天然滴度的百分率(表11)。VH：重链可变基因。Vκ：κ轻链可变基因。ND：在目前实验条件下未检测到表达。
表11
从这些实验中获得的结果表明来自不同基因家族的体细胞突变的、高亲和性重链能够与重排的人种系Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1区配对并且能够作为正常的抗体分子从细胞分泌。如表10所示，与亲本抗体的同源轻链相比，当与重排的人Vκ1-39Jκ5轻链配对时约61％(42/69)重链的抗体滴度增加，当与重排的人Vκ3-20Jκ1轻链配对时约29％(20/69)重链的抗体滴度增加。对于约20％(14/69)的重链而言，与亲本抗体的同源轻链相比，这两种重排的人种系轻链均使得表达增加。如表11所示，与亲本抗体的同源轻链相比，重排的人种系Vκ1-39Jκ5区使得针对不同类型范围的抗原具有特异性的若干重链的表达增加。与亲本抗体的同源轻链相比，约35％(15/43)重链的抗体滴度增加两倍以上。对于两条重链(315和316)而言，与母本抗体相比，增加在10倍以上。在与母本抗体的同源轻链相比显示出表达增加的所有重链中，与其他重链可变区基因家族相比家族3(VH3)重链表现最佳。这表明人VH3重链与重排的人种系Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1轻链具有良好的配对关系。
实施例XI
重排的人种系轻链基因座的产生
使用基因工程技术(参见例如，美国专利号6,586,251和Valenzuela等(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupledwith high-resolution expression analysis，Nature Biotech.21(6)：652-659)制备多种重排的人种系轻链目标载体以修饰小鼠基因细菌人工染色体(BAC)克隆302g12和254m04(Invitrogen)。使用这两种BAC克隆，设计含有单一重排的人种系轻链区的基因组构建体并***到内源性κ轻链基因座，所述基因座此前已经过修饰使内源性的κ可变区缺失，并与基因片段连接。
重排的人种系轻链目标载体的构建。
使用本领域公知的标准分子生物学技术制备三种不同的重排的人种系轻链区。用于构建这三个区域的人可变基因片段包括重排的人Vκ1-39Jκ5序列、重排的人Vκ3-20Jκ1序列和重排的人VpreBJI5序列。
通过从头DAN合成(整合DNA技术)制备含有小鼠Vκ3-7基因的外显子1(编码前导肽)和内含子1的DNA片段。5’非翻译区至天然存在的B1pI限制性内切酶位点的部分包括在内。从人基因组BAC文库中利用PCR扩增人Vκ1-39和Vκ3-20基因的外显子。正向引物具有5’延伸，其含有小鼠Vκ3-7基因内含子1的剪接受***点。用于人Vκ1-39序列PCR的反向引物包括编码人Jκ5的延伸，而用于人Vκ3-20序列PCR的反向引物包括编码人Jκ1的延伸。人VpreBJλ5序列由从头DNA合成(整合DNA技术)制备。从质粒pBS-296-HA18-PISceI PCR扩增包括剪接供***点的人Jκ-Cκ内含子部分。正向PCR引物包括编码人Jκ5、Jκ1或Jλ5序列部分的延伸。反向引物包括PI-SceI位点，此前已通过工程化将其引入内含子中。
通过重叠延伸PCR将小鼠的Vκ3-7外显子1/内含子1、人可变轻链外显子和人Jκ-Cκ内含子片段连接在一起，使用B1pI和PI-SceI消化并与质粒pBS-296-HA18-PISceI连接，所述质粒含有来自人Vκ3-15可变基因片段的启动子。使用翼侧为Notl和Ascl位点的FRTed潮霉素表达盒取代质粒pBS-296-HA18-PISceI中的loxed潮霉素表达盒。将该质粒的NotI/PI-SceI片段与经修饰的小鼠BAC254m04连接，其含有小鼠Jκ-Cκ内含子、小鼠Cκ外显子和提供用于在小鼠ES细胞中进行同源重组的3’同源臂的小鼠κ基因座下游约75kb的基因序列。然后将该BAC的NotI/AscI片段与经修饰的小鼠BAC302g12连接，其含有FRTed新霉素表达盒和用于在小鼠ES细胞中进行同源重组的内源性κ基因座上游约23kb的基因序列。
重排的人种系Vκ1-39Jκ5目标载体(图19)
在工程化轻链***体的5’和3’端引入限制性内切酶位点以克隆入目标载体：在5’端为Ascl位点和在3’端为PI-SceI位点。在5’AscI位点和3’PI-SceI位点之间，靶构建体从5’至3’包括：含有源自小鼠BAC克隆302g12的5’至内源性小鼠κ轻链基因座序列的5’同源臂、FRTed新霉素抗性基因、包括人Vκ3-15启动子的基因序列、小鼠Vκ3-7可变基因片段的前导序列、小鼠Vκ3-7可变基因片段的内含子序列、重排的人种系Vκ1-39Jκ5区的开放阅读框架、含有人Jκ-Cκ内含子部分的基因序列和含有源自小鼠BAC克隆254m04的内源性小鼠Jκ5基因 片段的3’序列的3’同源臂(图19，中部)。内源性小鼠κ轻链基因座上游和大部分3’Jκ基因片段下游(例如内源性3’增强子)的基因和/或序列未经过靶构建体修饰(见图19)。工程化的人Vκ1-39Jκ5基因座序列如SEQ ID NO：59所示。
使用序列位于重排的人种系轻链区内的引物通过聚合酶链反应(PCR)确证了重排的人种系Vκ1-39Jκ5区靶向***了BAC DNA。简言之，使用引物ULC-m1F(AGGTGAGGGTACAGATAAGT GTTATGAG；SEQ ID NO：60)和ULC-m1R(TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA；SEQID NO：61)确证了3’内含子序列至小鼠Vκ3-7前导序列。使用引物1633-h2F(GGGCAAGTCAGAGCATTAGC A；SEQ ID NO：62)和1633-h2R(TGCAAACTGG ATGCAGCATA G；SEQ IDNO：63)确证了重排的人种系Vκ1-39Jκ5区的开放阅读框架。使用引物neoF(ggtggagagg ctattcggc；SEQID NO：64)和neoR(gaacacggcg gcatcag；SEQ ID NO：65)确证了新霉素表达盒。然后将靶BAC DNA用于电转染小鼠ES细胞以形成用于产生表达重排的人种系Vκ1-39Jκ5区的嵌合小鼠的经修饰的ES细胞。
使用对***内源性基因座的工程化的Vκ1-39Jκ5轻链区具有特异性的探针通过TaqmanTM筛选和核型分析确证了阳性ES细胞克隆。简言之，探针neop(TGGGCACAACAGACAATCGG CTG；SEQ ID NO：66)，其与新霉素标记物基因结合，探针ULC-m1P(CCATTATGATGCTCCATGCC TCTCTGTTC；SEQ ID NO：67)，其与3’内含子序列至小鼠Vκ3-7前导序列结合和探针1633h2P(ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT；SEQ ID NO：68)，其与重排的人种系Vκ1-39Jκ5开放阅读框架结合。然后将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠中以产生表达种系Vκ1-39Jκ5轻链区的整窝胎仔。
或者，将携带重排的人种系Vκ1-39Jκ5轻链区的ES细胞转染至表达FLP的构建体以除去通过靶构建体引入的FRTed新霉素表达盒。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠(例如US6,774,279)交配除去新霉素表达盒。任选地，在小鼠中保留新霉素表达盒。
重排的人种系Vκ3-20Jκ1目标载体(图20)
以类似方式，使用靶构建体制备表达重排的人种系Vκ3-20Jκ1区的工程化的轻链基因座，所述靶构建体从5’至3’包括含有源自小鼠BAC克隆302g12的5’ 序列至内源性小鼠κ轻链基因座的5’同源臂、FRTed新霉素抗性基因、包括人Vκ3-15启动子的基因序列、小鼠Vκ3-7可变基因片段的前导序列、小鼠Vκ3-7可变基因片段的内含子序列、重排的人种系Vκ3-20Jκ1区的开放阅读框架、含有部分人Jκ-Cκ内含子的基因序列和含有源自小鼠BAC克隆254m04的内源性小鼠Jκ5基因片段的3’序列(图20，中部)。工程化的人Vκ3-20Jκ1基因座序列如SEQ ID NO：69所示。
使用序列位于重排的人种系Vκ3-20Jκ1轻链区内的引物通过聚合酶链反应(PCR)确证了靶向***BAC DNA的重排的人种系Vκ3-20Jκ1区。简言之，使用引物ULC-m1F(SEQ IDNO：60)和ULC-m1R(SEQ ID NO：61)确证了3’内含子序列至小鼠Vκ3-7前导序列。使用引物1635-h2F(TCCAGGCACC CTGTCTTTG；SEQ ID NO：70)和1635-h2R(AAGTAGCTGC TGCTAACACTCTGACT；SEQ ID NO：71)确证了重排的人种系Vκ3-20Jκ1区的开放阅读框架。使用引物neoF(SEQ ID NO：64)和neoR(SEQ ID NO：65)确证了新霉素表达盒。然后将靶BAC DNA用于电转染至小鼠ES细胞以形成用于产生表达重排的人种系Vκ3-20Jκ1轻链的嵌合小鼠的经修饰的ES细胞。
使用对***内源性κ轻链基因座的工程化的Vκ3-20Jκ1轻链区具有特异性的探针通过TaqmanTM筛选和核型分析确证了阳性ES细胞克隆。简言之，探针neop(SEQ ID NO：66)，其与新霉素标记物基因结合，探针ULC-m1P(SEQ ID NO：67)，其与小鼠Vκ3-7前导序列结合和探针1635h2P(AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG；SEQ ID NO：72)，其与人Vκ3-20Jκ1开放阅读框架结合。然后将阳性ES细胞克隆植入雌性小鼠。整窝胎仔表达人种系Vκ3-20Jκ1轻链区。
或者，将携带重排的人种系Vκ3-20Jκ1轻链区的ES细胞转染至表达FLP的构建体以除去通过靶构建体引入的FRTed新霉素表达盒。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠(例如US6,774,279)交配除去新霉素表达盒。任选地，在小鼠中保留新霉素表达盒。
重组的人种系VpreBJI5目标载体(图21)
以类似方式，使用靶构建体制备表达重排的人种系VpreBJI5区的工程化的轻链基因座，所述靶构建体从5’至3’包括含有源自小鼠BAC克隆302g12的5’ 序列至内源性小鼠κ轻链基因座的5’同源臂、FRTed新霉素抗性基因、包括人Vκ3-15启动子的基因序列、小鼠Vκ3-7可变基因片段的前导序列、小鼠Vκ3-7可变基因片段的内含子序列、重排的人种系VpreBJλ5区的开发阅读框架、含有部分人Jκ-Cκ内含子的基因序列和含有源自小鼠BAC克隆254m04的内源性小鼠Jκ5基因片段的3’序列的3’同源臂(图21，中部)。工程化的人VpreBJI5基因座序列如SEQ ID NO：73所示。
使用序列位于重排的人种系VpreBJλ5轻链区内的引物通过聚合酶链反应(PCR)确证了靶向***BAC DNA的重排的人种系VpreBJλ5区。简言之，使用引物ULC-m1F(SEQ ID NO：60和ULC-m1R(SEQ ID NO：61)确证了3’内含子序列至小鼠Vκ3-7前导序列。使用引物1616-h1F(TGTCCTCGGC CCTTGGA；SEQ ID NO：74)和1616-h1R(CCGATGTCAT GGTCGTTCCT；SEQ IDNO：75)确证了重排的人种系VpreBJλ5区的开放阅读框架。使用引物neoF(SEQ ID NO：64)和neoR(SEQ ID NO：65)确证了新霉素表达盒。然后将靶BAC DNA用于电转染至小鼠ES细胞以形成用于产生表达重排的人种系VpreBJλ5轻链的嵌合小鼠的经修饰的ES细胞。
使用对***内源性κ轻链基因座的工程化的VpreBJλ5轻链区具有特异性的探针通过TaqmanTM筛选和核型分析确证了阳性ES细胞克隆。简言之，探针neop(SEQ ID NO：66)，其与新霉素标记物基因结合，探针ULC-m1P(SEQ ID NO：67)，其与小鼠IgVκ3-7前导序列结合和探针1616h1P(ACAATCCGCCTCACCTGCAC CCT；SEQ ID NO：76)，其与人VpreBJλ5开放阅读框架结合。然后将阳性ES细胞克隆植入雌性小鼠中以产生表达种系轻链区的整窝胎仔。
或者，将携带重排的人种系VpreBJI5轻链区的ES细胞转染至表达FLP的构建体以除去通过靶构建体引入的FRTed新霉素表达盒。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠(例如US6,774,279)交配除去新霉素表达盒。任选地，在小鼠中保留新霉素表达盒。
实施例XII
表达单一重排的人轻链的小鼠的制备
使用上文所述的靶ES细胞作为供体ES细胞并通过法引 入8-细胞阶段的小鼠胚胎(参见例如美国专利号7,294,754和Poueymirou等(2007)F0generationmice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cellsallowing immediate phenotypic analyses，Nature Biotech.25(1)：91-99)。使用改良的等位基因检测法(Valenzuela等，如上文所述)对独立地携带工程化的人种系Vκ1-39Jκ5轻链区、Vκ3-20Jκ1轻链区或VpreBJλ5轻链区的的基因型进行鉴定，所述方法检测独特的重排的人种系轻链区的存在情况。
检测胎仔的基因型并选择针对独特的重排的人种系轻链区是杂合子或纯合子的胎仔用于表征重排的人种系轻链区的表达情况。
流式细胞术。
通过分析在共同轻链小鼠的脾细胞和外周血中免疫球蛋白κ和λ的表达情况对在共同轻链小鼠的正常抗体库中重排的人轻链区的表达情况进行分析。使用标准方法制备从野生型(n=5)、Vκ1-39Jκ5共同轻链杂合子(n=3)、Vκ1-39Jκ5共同轻链纯合子(n=3)、Vκ3-20Jκ1共同轻链杂合子(n=2)和Vκ3-20Jκ1共同轻链纯合子(n=2)小鼠收集的脾脏和外周血的细胞悬液并使用荧光标记的抗体(BD Pharmigen)对CD19+、IgI+和IgK+染色。
简言之，将1x106个细胞在冰上与抗-小鼠CD16/CD32(克隆2.4G2，BDPharmigen)孵育10分钟，随后使用下述抗体混合物在冰上标记30分钟：APC偶联的抗-小鼠CD19(克隆1D3，BD Pharmigen)、PerCP-Cy5.5偶联的抗-小鼠CD3(克隆17A2，BioLegend)、FITC偶联的抗-小鼠Igκ(克隆187.1，BD Pharmigen)、PE偶联的抗-小鼠Igλ(克隆RML-42，BioLegend)。染色后，在2％的甲醛中洗涤细胞并固定。在LSRII流式细胞仪上进行数据采集并使用FlowJoTM分析。门控：总B细胞(CD19+CD3-)、Igk+B细胞(Igk+IgI-CD19+CD3-)、IgI+B细胞(Igκ-IgI+CD19+CD3-)。从血液和脾脏中收集的数据显示出了相似的结果。表12列出了从IgI+、Igk+或IgI+Igk+组中各取一只典型小鼠的外周血阳性CD19+B细胞的百分率。野生型(WT)和Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1共同轻链纯合子小鼠外周血中CD19+B细胞的百分率如图22所示。
表12
共同轻链的表达。
使用定量PCR检测(例如TaqmanTM)分析杂合子和纯合子小鼠中各共同轻链(Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1)的表达情况。
简言之，使用小鼠CD19微珠(Miltenyi Biotec)根据生产厂商的说明书从野生型、使用相应的人重链和κ轻链可变区基因座(Hκ)取代小鼠重链和κ轻链可变区基因座的纯合子小鼠以及针对各重排的人轻链区(Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1)是纯合子和杂合子的小鼠的脾脏中纯化CD19+B细胞。使用RNeasyTM微量试剂盒(Qiagen)根据生产厂商的说明从CD19+B细胞中纯化总RNA并且使用无RNase的DNase柱上处理(Qiagen)除去基因组RNA。使用FirstStand cDNA合成试剂盒(Invitrogen)将200ng mRNA逆转录为cDNA，然后使用TaqmanTMUniversal PCR Master Mix(Applied Biosystems)将所得到的cDNA扩增。所有的反应均使用ABI7900序列检测***(Applied Biosystems)进行，其使用的引物和TaqmanTM MGB探针覆盖(1)两条轻链的Vκ-Jκ接头，(2)仅Vκ基因(即Vκ1-39和Vκ3-20)和(3)小鼠Cκ区。表13中列出了该检测中使用的引物和探针序列。将相对表达归一化至小鼠Cκ区的表达。结果如图23A、23B和23C所示。
表13
抗原特异性共同轻链抗体。
使用β-半乳糖苷酶免疫在内源性小鼠κ轻链基因座携带Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1共同轻链的共同轻链小鼠，并测定抗体滴度。
简言之，根据生产厂商的说明将β-半乳糖苷酶(Sigma)在TITERMAXTM佐剂(Sigma)中乳化。通过皮下注射100μgβ-半乳糖苷酶/TITERMAXTM来免疫野生型(n=7)、Vκ1-39Jκ5共同轻链纯合子(n=2)和Vκ3-20Jκ1共同轻链纯合子(n=5)。皮下注射强化免疫小鼠两次，之间间隔3周，每次使用50μgβ-半乳糖苷酶/TITERMAXTM。第二次强化免疫后，根据生产厂商的说明通过球后静脉取血将麻醉小鼠的血液收集至血清分离管(BD Biosciences)。为检测抗-β-半乳糖苷酶IgM或IgG抗体，使用1μg/mLβ-半乳糖苷酶在4C下将ELISA板(Nunc)包被过夜。洗涤除去过量的抗原，随后使用含1％BSA的PBS在室温下封闭1小时。将系列稀释的血清加入板中并在室温下孵育1小时，随后洗涤。然后将板与HRP偶联的抗-IgM(Southern Biotech)或抗-IgG(Southern Biotech)在室温下孵育1小时。再次洗涤后，使用TMB底物(BDBiosciences)使板显色。加入1N硫酸终止反应并使用Victor X5酶标仪(Perkin Elmer)在OD450下读数。使用GRAPHPADTM Prism分析数据，以高于背景两倍的血清稀释度计算信号。结果见图24A和24B。
如本实施例所示，在Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1共同轻链小鼠脾脏和外周隔室中的κ/λB细胞比例与野生型接近(表12和图22)。然而，VpreBJλ5共同轻链小鼠显示出减少的外周B细胞，其中约1-2％表达为工程化的人轻链区(数据未列出)。与含有小鼠Vκ和Jκ基因片段被人Vκ和Jκ基因片段完全取代的内源性κ轻链基因座相比，Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1重排的人轻链区在内源性κ轻链基因 座中的表达水平升高(图23A、23B和23C)。在杂合子和纯合子小鼠中VpreBJλ5重排的人轻链区的表达水平与内源性κ轻链基因座相似均高表达(数据未列出)。这表明与小鼠λ、κ或这两个内源性轻链基因座的直接竞争使得单一重排的人VL/JL序列能够产生优于内源性κ轻链基因座野生型表达水平的表达水平，并且其产生正常的脾脏和血液B细胞频率。此外，小鼠对具有人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1序列的工程化的κ轻链基因座的存在具有良好的耐受性，并且其通过在免疫应答体液组件中表现为轻链库的重要部分从而表现出以野生型方式发挥功能(图24A和24B)。
实施例XIII
表达单一重排的人种系轻链小鼠的交配
本实施例描述了一些其他的基因修饰小鼠品系，其能够与本申请所述的任意共同轻链小鼠交配以形成携带多重基因修饰免疫球蛋白基因座的多重基因修饰小鼠品系。
内源性Igλ的敲除(KO)
为优化工程化轻链基因座的使用情况，将携带一种重排的人种系轻链区的小鼠与含有内源性λ轻链基因座缺失的另一种小鼠交配。在这种方法中，所获得的子代将表达作为其唯一的轻链的实施例11中所描述的重排的人种系轻链区。采用本领域公知的标准技术进行交配，或者通过商业繁殖机构(例如The Jackson Laboratory)。针对存在独特的轻链区和缺乏内源性小鼠λ轻链对携带工程化的轻链基因座和缺失内源性λ轻链基因座的小鼠品系进行筛选。
人源化的内源性重链基因座
将携带工程化的人种系轻链基因座的小鼠与含有内源性小鼠重链可变基因座被人重链可变基因座取代的小鼠进行交配(参见US6,596,541；the humanized mouse，Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)。 人源化的小鼠包含含有与内源性小鼠恒定区基因座可操作地连接的人重链可变区的基因组，以使得所述小鼠针对抗原刺激产生包含人重链可 变区和小鼠重链恒定区的抗体。分离编码抗体重链可变区的DNA并与编码人重链恒定区的DNA可操作地连接。然后在能够表达抗体全人重链的细胞中表达所述DNA。
获得携带内源性小鼠VH基因座被人VH基因座取代且在内源性κ轻链基因座存在单一重排的人种系VL区的小鼠。通过使用所关注的抗原免疫获得具有单一人轻链(人VL和小鼠CL)且含有体细胞突变的重链(人VH和小鼠CH)的反向嵌合抗体。鉴定表达抗体的B细胞的VH和VL核苷酸序列并且通过在适宜的表达***中将VH和VL核苷酸序列与人CH和CL核苷酸序列融合制备全人抗体。
实施例XIV
从表达人重链和重排的人种系轻链区的小鼠制备抗体
在将含有工程化的人轻链区的小鼠与多种含有其他内源性Ig基因座修饰和缺失的所需品系的小鼠(如实施例12所述)交配后，选择能够被所关注抗原免疫的小鼠。
在通常情况下，使用抗原对含有一种单一重排的人种系轻链区的人源化小鼠进行攻击，并且从动物血清中回收淋巴细胞(如B细胞)。将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以制备永生化的杂交瘤细胞系，对这种杂交瘤细胞系进行筛选并选择鉴定产生含有人重链可变区和重排的人种系轻链并且对用于免疫的抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。分离编码重链和轻链可变区的DNA并连接至所需的重链和轻链的同种型恒定区。由于存在内源性小鼠序列并且在内源性基因座中存在任意附加的顺式作用元件，因此各抗体的单一轻链可以发生体细胞突变。这会向包括单一轻链和多样性的重链序列的抗原特异性库加入附加多样性。随后在细胞，如CHO细胞，中表达克隆得到的抗体序列。或者，从抗原特异性淋巴细胞中直接鉴定编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链可变结构域的DNA。
首先，分离具有人可变结构域和小鼠恒定区的高亲和性嵌合抗体。如上文所述，鉴定并针对所需特征选择抗体，包括亲和性、选择性、表位等。使用所需的人恒定区取代小鼠恒定区以制备含有体细胞突变的人重链和衍生自本发明的重排的人种系轻链区的单一轻链的全人抗体。适宜的人恒定区包括例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。
使用人细胞表面受体蛋白(抗原E)免疫含有使用人VH、DH和JH基因片段取代内源性小鼠重链基因座并且使用工程化的种系Vκ1-39Jκ5人轻链区或工程化的种系Vκ3-20Jκ1人轻链区(如上文所述)取代内源性小鼠κ轻链基因座的 人源化小鼠的各队列。将抗原E直接给予小鼠的后足跖，每3-4天给予一次连续注射6次。在注射前将2至3微克抗原E与10μgCpG寡核苷酸(目录号#tlrl-modn-ODN1826oligonucleotide；InVivogen，San Diego，CA)和25μgAdju-Phos(磷酸铝凝胶佐剂，目录号#H-71639-250；BrenntagBiosector，Frederikssund，Denmark)混合。在最终抗原回收前共计注射6次，回收在处死前3-5天进行。在第4次和第6次注射后取血并且通过标准抗原特异性免疫检测监测抗体免疫应答。
当达到所需的免疫应答时，收集脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其活力并形成杂交瘤细胞系。筛选杂交瘤细胞系并选择鉴定产生抗原E-特异性共同轻链抗体的细胞系。使用该技术获得了若干抗-抗原E-特异性共同轻链抗体(即具有人重链可变结构域，相同的人轻链可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)。
或者，从抗原阳性B细胞中直接分离抗-抗原E共同轻链抗体，而不与骨髓瘤细胞融合，如U.S.2007/0280945A1所述，其全部内容通过引用特别地并入本申请。使用这种方法，获得了若干全人抗-抗原E共同轻链抗体(即具有人重链可变结构域，工程化的人Vκ1-39Jκ5轻链或工程化的人Vκ3-20Jκ1轻链区，和人恒定结构域的抗体)。
根据本实施例的方法产生的示例性抗-抗原E共同轻链抗体的生物学性质将在下文中详述。
实施例XV
在抗原特异性共同轻链抗体中重链基因片段的使用情况
为分析所产生的人抗-抗原E共同轻链抗体的结构，将编码重链抗体可变区的核酸克隆并测序。从抗体的核酸序列和预计氨基酸序列中，对来自含工程化的人Vκ1-39Jκ5轻链或工程化的人Vκ3-20Jκ1轻链区的经过免疫的 人源化小鼠中得到的选定共同轻链抗体重链可变区(HCVR)的基因使用情况进行鉴定。结果见表14和15，结果表明当使用表达仅衍生自人 Vκ1-39-或人Vκ3-20-衍生的轻链的小鼠时，由于重排的多样性，所以根据本发明的小鼠产生源自多种人重链基因片段的抗原特异性共同轻链抗体。2、3、4和5家族的人VH基因片段与多种人DH片段和人JH片段重排以产生抗原特异性抗体。
表14
表15
实施例XVI
利用LUMINEXTM检测测定抗原特异性共同轻链抗体的阻断能力
在基于小珠的检测中测定了由抗原E激发产生的98个人共同轻链抗体在阻断抗原E的天然配体(配体Y)与抗原E结合的能力。
将抗原E的细胞外结构域(ECD)与两个myc表位标签和6X组氨酸标签(抗原E-mmH)偶联并且在在MES缓冲液中20μg/mL浓度下将其胺基与羧基化的微球偶联。将该混合物在室温下孵育2小时，随后使用1M Tris pH8.0使小珠失活，接下来在含0.05％(v/v)吐温-20的PBS中洗涤。然后使用含2％(w/v)BSA(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)的PBS(IrvineScientific，Santa Ana，CA)封闭小珠。在96孔过滤板中，使用缓冲液按照1：15的比例稀释含抗原E-特异性共同轻链抗体的上清液。采用与抗体上清液相同的方法制备含有具有相同培养基组分的模拟上清液的阴性对照。将抗原E-标记的小珠加入上清液中并在4℃下孵育过夜。加入生物素化的-配体Y蛋白使其终浓度为0.06nM并在室温下孵育2小时。使用与R-藻红蛋白偶联的抗生物素蛋白链菌素(Moss Inc，Pasadena，MD)检测与抗原E-myc-myc-6His标记的小珠结合的生物素化的-配体Y，随后在基于LUMINEXTM流式细胞仪的分析仪中进行检测。从所有样品中扣除不含配体Y的样品的背景平均荧光强度(MFI)。通过将各样品扣除本底的MFI除以经调整的阴性对照值再乘以100并用100减去该结果计算阻断百分率。
在一项类似的实验中，检测由抗原E激发的相同的98个人共同轻链抗体对抗原E与配体Y标记的小珠结合的阻断能力。
简言之，在使用MES缓冲液稀释的20μg/mL浓度下将配体Y的氨基与羧基化的微球偶联。将该混合物在室温下孵育2小时，随后使用1M Tris pH8使小珠失活，接下来在含0.05％(v/v)吐温-20的PBS中洗涤。然后使用含2％(w/v)BSA(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)的PBS(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)封闭小珠。在96孔过滤板中，使用缓冲液按照1：15的比例稀释含抗原E-特异性共同轻链抗体的上清液。采用与抗体上清液相同的方法制备含有具有相同培养基组分的模拟上清液的阴性对照。加入生物素化的-抗原E-mmH使其终浓度为0.42nM并在4℃下孵育过夜。然后将配体Y标记的小珠加入抗体/抗原E混合物中 并在室温下孵育2小时。使用与R-藻红蛋白偶联的抗生物素蛋白链菌素(MossInc，Pasadena，MD)检测与配体Y-小珠结合的生物素化的-抗原E-mmH，随后在基于LUMINEXTM流式细胞仪的分析仪中进行检测。从所有样品中扣除不含抗原E的样品的背景平均荧光强度(MFI)。通过将各样品扣除本底的MFI除以经调整的阴性对照值再乘以100并用100减去该结果计算阻断百分率。
表16和17显示了在这两项LUMINEXTM检测中测定的全部98个抗-抗原E共同轻链抗体的阻断百分率。ND：在目前的实验条件下未检测到。
表16
表17
在上文所述的第一项LUMINEXTM实验中，检测了含有Vκ1-39Jκ5工程化轻链的80个共同轻链抗体阻断配体Y与抗原E-标记的小珠结合的能力。在这80个共同轻链抗体中，有68个阻断＞50％，12个阻断＜50％(6个阻断为25-50％，6个阻断＜25％)。对于含Vκ3-20Jκ1工程化轻链的18个共同轻链抗体而言，在阻断配体Y与抗原E标记的小珠结合方面，有12个阻断＞50％，而6个阻断＜50％(3个阻断为25-50％，3个阻断为＜25％)。
在上文所述的第二项LUMINEXTM实验中，检测了含有Vκ1-39Jκ5工程化轻链的相同的80个共同轻链抗体阻断抗原E与配体Y标记的小珠结合的能力。在这80个共同轻链抗体中，有36个阻断＞50％，而44个阻断＜50％(27个阻断为25-50％，17个阻断为＜25％)。对于含Vκ3-20Jκ1工程化轻链的18个共同轻链抗体而言，在阻断抗原E与配体Y标记的小珠结合方面，有1个阻断＞50％，而17个阻断＜50％(5个阻断为25-50％，12个阻断为＜25％)。
表16和17中的数据表明表14和15所述的重排产生的抗-抗原E特异性共同轻链抗体以不同的效能程度阻断配体Y与其同源受体抗原E的结合，这与表 14和15中的包含具有重叠和非重叠的针对抗原E的表位特异性的抗-抗原E共同轻链抗体一致。
实施例XVII
利用ELISA测定抗原特异性共同轻链抗体的阻断能力
在一项ELISA检测中测定了由抗原E激发的人共同轻链抗体阻断抗原E与配体Y包被表面结合的能力。
将经PBS稀释的浓度为2μg/mL的配体Y包被于96孔板并孵育过夜，随后使用含0.05％吐温-20的PBS洗涤四次。然后使用含0.5％(w/v)BSA(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)的PBS(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)在室温下将板封闭1小时。在一个单独的板中，使用缓冲液按照1：10的比例稀释含抗-抗原E共同轻链抗体的上清液。使用与抗体具有相同组分的假上清液作为阴性对照。加入抗原E-mmH(如上文所述)使其终浓度为0.150nM并在室温下孵育1小时。然后将抗体/抗原E-mmH混合物加入含有配体Y的板中并在室温下孵育1小时。使用抗-戊-His抗体(Qiagen，Valencia，CA)偶联的辣根过氧化物酶(HRP)检测与配体Y结合的抗原，并且使用由硫酸中和的四甲基联苯胺(TMB)底物(BDBiosciences，San Jose，CA)的标准比色应答显色。在OD450下读取0.1sec吸光度。从所有样品中扣除未加入抗原E的样品的本底吸光度。通过将各样品扣除本底的MFI除以经调整的阴性对照值再乘以100并用100减去该结果计算阻断百分率。
表18和19显示了在ELISA检测中检测的全部98个抗-抗原E共同轻链抗体的阻断百分率。ND：在目前的实验条件下未检测到。
表18
表19
如在本实施例中所述的，在检测了其阻断抗原E与配体Y包被表面结合能力的含有Vκ1-39Jκ5工程化轻链的80个共同轻链抗体中，有22个阻断＞50％，而58个阻断＜50％(20个阻断为25-50％，38个阻断＜25％)。对于含Vκ3-20Jκ1工程化轻链的18个共同轻链抗体而言，在阻断抗原E与配体Y包被表面的结合方面，有1个阻断＞50％，而17个阻断＜50％(5个阻断为25-50％，12个阻断为＜25％)。
这些结果亦与包含具有重叠和非重叠的针对抗原E的表位特异性的抗体的抗原E-特异性共同轻链抗体池一致。
实施例XVIII
抗原-特异性共同轻链抗体的BIACORETM亲和性检测
使用BIAcoreTM T100仪器(GE Healthcare)通过SPR(表面等离子体共振) 测定了针对选定的抗体上清液的平衡解离常数(KD)。所有数据均为在25℃下使用HBS-EP(10mMHEPES，150mM NaCl，0.3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH7.4)作为检测和样品缓冲液获得。在CM5传感器芯片表面从粗上清液样品中捕获抗体，所述芯片表面此前已使用标准胺偶联化学衍生化了高密度的抗-人Fc抗体进行。在捕获步骤中，以3μL/min的流速将上清液注入流过抗-人Fc表面，共进行3分钟。捕获步骤后，注入检测缓冲液或浓度为100nM的分析物，流速为35μL/min，进行2分钟。监测6分钟抗原从所捕获抗体上的解离。通过短暂注入10mM甘氨酸，pH1.5除去所捕获的抗体。所有传感图均由分析物的传感图减去注入缓冲液的传感图进行双重参考，以消除人为导致的抗体从捕获表面上的解离。使用BIACORETM T100评估软件v2.1将各抗体的结合数据均拟合至具有重量传输的1：1结合模型。结果见表20和表21。
表20
表21
包含重排的共同轻链抗体的结合亲和性见表14和表15，其几乎均显示出在纳摩范围的KD。亲和性数据与表14和表15中所述的重排可变结构域组合的共同轻链抗体的结果一致，即具有高亲和性、克隆选择性和体细胞突变。结合此前显示的数据，表14和表15中所述的共同轻链抗体包含了具有多样性、高亲和性 的一批抗体，其对抗原E上的一个或多个表位显示出特异性。
实施例XIX
利用LUMINEXTM检测确定抗原-特异性共同轻链抗体的结合特异性
对选定的抗-抗原E共同轻链抗体与抗原E的ECD和抗原E ECD变体的结合能力进行检测，所述变体包括食蟹猴直系同源物(Mf抗原E)，其氨基酸残基与人蛋白存在约10％的差异；抗原E的缺失突变，缺乏ECD C-末端最后10个氨基酸(抗原E-ΔCT)；以及两个突变体，在疑似与配体Y相互作用的位置含有丙氨酸取代(抗原E-Alal和抗原E-Ala2)。在CHO细胞中生产抗原E蛋白并且其均含有myc-myc-His C-末端标签。
对于结合研究而言，通过与共价包被了抗-myc单克隆抗体(MAb9E10，杂交瘤细胞系CRL-1729TM；ATCC，Manassas，VA)的1x106个微球(LuminexTM)小珠在室温下孵育2小时从1mL培养基中捕获抗原E ECD蛋白或变体蛋白(如上文所述)。然后在使用前使用PBS洗涤小珠。在缓冲液中按照1：4的比例稀释含有抗-抗原E共同轻链抗体的上清液并将其加入96孔过滤板。使用不含抗体的假上清液作为阴性对照。然后将含有捕获了抗原E蛋白的小珠加入抗体样品中(每孔3000个小珠)并且在4℃下孵育过夜。次日，洗涤样品小珠并使用R-藻红蛋白偶联的抗-人IgG抗体检测结合的共同轻链抗体。使用基于LuminexTM流式细胞仪的分析仪测定小珠的荧光强度(与各抗原E蛋白结合的各抗体样品种均计数约100个小珠)，并且每个小珠/抗体反应均记录至少100个计数小珠的中位荧光强度(MFI)。结果见表22和表23。
表22
表23
抗-抗原E共同轻链抗体上清液显示出与抗原E-ECD连接的小珠具有较高的特异性结合。对于这些小珠而言，当与抗原E-ECD小珠样品组合使用时，阴性对照假上清液的结果为检测不到信号(＜10MFI)，而含有抗-抗原E共同轻链抗体的上清液显示出较强的结合信号(98个抗体上清液的平均MFI为2627；91/98个抗体样品MFI＞500)。
如对所选择的抗-抗原E共同轻链抗体识别抗原E ECD上不同表位的能力的检测那样，评估了抗体与变体的相对结合。如上文所述针对天然抗E-ECD结合的研究中那样，所有四个抗原E变体均捕获至抗-myc LUMINEXTM小珠，并且确 定相对结合比率(MFI变体/MFI抗原E-ECD)。98个已检测的共同轻链抗体上清液的结果见表21和表22，各变体的平均比率(MFI变体/MFI抗原E-ECD)存在差异，这可能反映了小珠上捕获的蛋白量不同(抗原E-ΔCT、抗原E-Alal、抗原E-Ala2和Mf抗原E的平均比率为0.61、2.9、2.0和1.0)。对于各蛋白变体而言，由98个已检测的共同轻链抗体组成的子集的结合显示出较强的结合减弱，这表明给定变体具有对突变敏感的特征。例如，19个共同轻链抗体样品与Mf抗原E结合的MFI变体/MFI抗原E-ECD＜8％。由于在该组中包括了多个具有较高或中度亲和性的抗体(5个KD＜5nM，15个KD＜50nM)，因而该组中较低的信号可能是由于天然抗原E-ECD与给定变体之间的序列(表位)敏感性不同而不是由于具有较低的亲和性。
这些数据表明表14和表15中所述的共同轻链抗体代表了抗原-E特异性共同轻链抗体是特异性识别抗原E上的一个以上表位的多样性群体。

Claims (31)

1.一种制备小鼠的方法，所述小鼠在其种系中包括：
(a) 人源化的免疫球蛋白重链可变基因座，包括至少一个未重排的人VH基因区段、至少一个未重排的人DH基因区段和至少一个未重排的人JH基因区段，所述人源化的免疫球蛋白重链可变基因座可操作地与免疫球蛋白重链恒定区基因连接；
(b) 人源化的免疫球蛋白轻链可变基因座包括一个人轻链V基因区段和一个人轻链J基因区段，其中所述一个人轻链V基因区段是人Vκ1-39或Vκ3-20，并且所述一个人轻链J基因区段是Jκ1或Jκ5，其中所述人源化的免疫球蛋白轻链可变基因座可操作地与免疫球蛋白轻链恒定区基因连接；和
(c) 表达小鼠ADAM6蛋白的异位核酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中人源化的免疫球蛋白轻链可变基因座包括单一重排的人轻链V/J序列，其中所述单一重排的人轻链V/J序列是重排的人Vκ1-39/Jκ序列或重排的人Vκ3-20/Jκ序列，其中所述Jκ是Jκ1或Jκ5。
3.一种制备雄性小鼠的方法，所述雄性小鼠在其种系中包括：
人源化的免疫球蛋白重链可变基因座，和人源化的免疫球蛋白轻链可变基因座，以及表达小鼠ADAM6蛋白的异位核酸序列，
其中所述人源化的免疫球蛋白重链可变基因座包含在内源性小鼠重链可变基因座中全部有功能的小鼠免疫球蛋白重链V、D和J基因区段被一个或多个未重排的人VH基因区段、一个或多个未重排的人DH基因区段和一个或多个未重排的人JH基因区段所取代，其中所述的一个或多个未重排的人VH基因区段、一个或多个未重排的人DH基因区段和一个或多个未重排的人JH基因区段被可操作地连接并且能够重排以形成可操作地与免疫球蛋白重链恒定区基因连接的重排的VH/DH/JH基因，
其中所述人源化的免疫球蛋白轻链可变基因座包含：
一个人轻链V基因区段和一个人轻链J基因区段，其中所述一个人轻链V基因区段是人Vκ1-39或Vκ3-20，并且所述一个人轻链J基因区段是Jκ1或Jκ5。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述人源化的免疫球蛋白轻链可变基因座包含单一重排的人轻链V/J序列，其中所述单一重排的人轻链V/J序列是重排的人Vκ1-39/Jκ序列或重排的人Vκ3-20/Jκ序列，其中所述Jκ是Jκ1或Jκ5。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达小鼠ADAM6蛋白的异位核酸序列位于免疫球蛋白重链可变基因座以外的基因座。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述表达小鼠ADAM6蛋白的异位核酸序列位于免疫球蛋白重链可变基因座以外的基因座。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定区基因是小鼠免疫球蛋白重链恒定区基因。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定区基因是小鼠免疫球蛋白重链恒定区基因。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区基因是小鼠免疫球蛋白轻链恒定区基因。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达小鼠ADAM6蛋白的异位核酸序列的位置不在内源性免疫球蛋白重链可变基因座内。
11.一种制备遗传修饰的小鼠的方法，所述小鼠表达多个不同的IgG抗体，各个所述IgG抗体均包含：
免疫球蛋白重链，其包含人免疫球蛋白重链可变结构域，其中在所述多个不同的IgG抗体中的不同抗体具有不同的免疫球蛋白重链；和
免疫球蛋白轻链，其中各个免疫球蛋白轻链包含由相同的单一重排的人轻链V/J序列编码的人免疫球蛋白轻链可变结构域，其中所述单一重排的人轻链V/J序列存在于所述小鼠的种系中，并且其中所述单一重排的人轻链V/J序列是重排的人Vκ1-39/Jκ序列或重排的人Vκ3-20/Jκ序列，其中所述Jκ是Jκ1或Jκ5；和
其中所述小鼠在其基因组中包含表达小鼠ADAM6蛋白的异位核酸序列。
12.一种分离的小鼠细胞，所述小鼠细胞分离自根据权利要求1-11中任意一项所述方法制备的小鼠。
13.根据权利要求12所述的分离的小鼠细胞，其中所述分离的小鼠细胞是分离的小鼠B细胞。
14.根据权利要求13所述的分离的小鼠细胞，其中所述分离的小鼠B细胞表达：
嵌合的免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含衍生自人重链V基因区段的免疫球蛋白重链可变结构域，所述免疫球蛋白重链可变结构域与非人免疫球蛋白重链恒定结构域融合；以及
嵌合的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含免疫球蛋白轻链可变结构域，所述免疫球蛋白轻链可变结构域衍生自
(a) 重排的人Vκ1-39/J序列；或
(b) 重排的人Vκ3-20/J序列；
其中所述J是Jκ1或Jκ5，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域与非人免疫球蛋白轻链恒定结构域融合。
15.一种杂交瘤，其中所述杂交瘤使用根据权利要求13所述的分离的小鼠B细胞制备。
16.小鼠制备全人抗体、或全人抗原结合蛋白、包含免疫球蛋白可变结构域或其功能片段的全人抗体或全人抗原结合蛋白的用途，其中所述小鼠使用根据权利要求1-11中任一项所述的方法制备。
17.小鼠制备全人双特异性抗体的用途，其中所述小鼠使用根据权利要求1-11中任一项所述的方法制备。
18.根据权利要求12中所述的分离的小鼠细胞在制备全人双特异性抗体的方法中的用途。
19.根据权利要求15中所述的杂交瘤在制备全人双特异性抗体的方法中的用途。
20.小鼠在制备人用治疗剂中的用途，其中所述用途包含表达编码所述小鼠的免疫球蛋白可变区或免疫球蛋白可变区的片段的多核苷酸，并且其中所述小鼠使用根据权利要求1-11中任一项所述的方法制备。
21.小鼠用于制备永生化的细胞系的用途，其中所述小鼠使用根据权利要求1-11中任一项所述的方法制备。
22.小鼠用于制备杂交瘤或四价体瘤的用途，其中所述小鼠使用根据权利要求1-11中任一项所述的方法制备。
23.小鼠制备编码免疫球蛋白可变区或免疫球蛋白可变区的片段的多核苷酸的用途，其中所述小鼠使用根据权利要求1-11中任一项所述的方法制备。
24.根据权利要求16所述的用途，其中所述小鼠用于制备抗原结合蛋白，并且其中所述抗原结合蛋白选自抗体、多特异性抗体、scFv、双-scFV、双体、三体、四体、V-NAR、VHH、VL、F(ab)、F(ab)2、DVD、SVD或双特异性T细胞接合子。
25.小鼠用于制备治疗人类疾病或病变的药物或者用于制备编码治疗人类疾病或病变的药物的可变序列的多核苷酸的用途，其中所述小鼠使用根据权利要求1-11中任一项所述的方法制备。
26.一种分离的小鼠细胞，所述小鼠细胞的基因组包括：
人源化的免疫球蛋白重链可变基因座，所述重链免疫球蛋白基因座包含至少一个未重排的人VH基因区段、至少一个未重排的人DH基因区段和至少一个未重排的人JH基因区段，其中所述人源化的免疫球蛋白重链可变基因座可操作地与免疫球蛋白重链恒定区基因连接；
人源化的免疫球蛋白轻链可变基因座，包括单一重排的人Vκ1-39/Jκ5序列和/或单一重排的人Vκ3-20/Jκ1序列，并且所述单一重排的人Vκ1-39/Jκ5序列和/或单一重排的人Vκ3-20/Jκ1序列可操作地与免疫球蛋白轻链恒定区基因连接；和，
表达ADAM6蛋白的异位核酸序列。
27.根据权利要求26所述的分离的小鼠细胞，其中所述分离的小鼠细胞是分离的小鼠B细胞。
28.根据权利要求27所述的分离的小鼠细胞，其中所述分离的小鼠B细胞表达：
嵌合的免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含衍生自人重链V基因区段的免疫球蛋白重链可变结构域，所述免疫球蛋白重链可变结构域与非人免疫球蛋白重链恒定结构域融合；以及
嵌合的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含免疫球蛋白轻链可变结构域，所述免疫球蛋白轻链可变结构域衍生自
(a) 重排的人Vκ1-39/J序列；或
(b) 重排的人Vκ3-20/J序列；
其中所述J是Jκ1或Jκ5，并且所述免疫球蛋白轻链可变结构域与非人免疫球蛋白轻链恒定结构域融合。
29.一种杂交瘤，其中所述杂交瘤使用根据权利要求27所述的分离的小鼠B细胞制备。
30.根据权利要求26中所述的分离的小鼠细胞在制备全人双特异性抗体的方法中的用途。
31.根据权利要求29中所述的杂交瘤在制备全人双特异性抗体的方法中的用途。
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