CN102337225A - 高氮鲜酵母和抽提物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酿酒酵母及其制备方法。一种高氮鲜酵母的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：（1）准备菌种：Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.5004；（2）培养基按质量重量比；（3）甜高粱汁液的预处理；（4）发酵；（5）经过适应期4-6小时后，且通风量为0.8-1.2V.V.m，搅拌速度为300-500转/min，添加营养盐（NH₄）₂SO₄0.2-3%、MgSO₄0.03-1.5%、KH₂PO₄0.2-1.5%；（6）经过10-20h的对数生长期后，发酵逐渐进入到衰退期，发酵温度32-35℃，通风量为0.3-0.5V.V.m，搅拌速度为80-150转/min，停止流加糖液，测定发酵酪液中残糖浓度，小于0.5%视为发酵终了；（7）发酵液处理。甜高粱汁液作为发酵液中的碳源，与其他碳源培养基如:糖蜜、甜菜相比预处理工艺简单，节省能耗，提高生产效率。

Description

高氮鲜酵母和抽提物的制备方法

技术领域

本发明涉及酿酒酵母及其制备方法。 

背景技术

面包酵母在分类学上属于酿酒酵母。酵母是一种单细胞微生物，其形态为圆形、椭圆形、卵圆形，大小随菌种的差异而不同。 

酵母细胞中含水分65%-70%，其中约有15%为游离水；含碳水化合物为25%-35%，大多以多糖形式存在；含蛋白质40%-60%，酵母含有完整的氨基酸群，包括人体必需的8种氨基酸，特别是在谷物蛋白中含量较少的赖氨酸，在酵母中含量较高。此外，酵母中的氨基酸比例接近***粮农组织(FAO)推荐的理想氨基酸组成值，故其营养价值较高。灰分5%-10%，大多以磷和钾的含量较多。酵母也是天然的营养来源和营养载体，其营养成分具有“三低四优”的特点，即低脂、低糖、不含胆固醇，富含优质完全蛋白质、完整的B族维生素、以生命结合态形式存在的多种矿物质和功能膳食纤维。 

在自然界中，所选育的酵母存在自身蛋白含量低、生物量积累缓慢等缺点。因此有必要对酵母细胞进行诱变和筛选，最终得到蛋白含量高，生物量积累快的优良菌种。为今后工业化生产奠定坚实的基础。 

目前所使用的微生物菌种选育技术主要包括物理方法如：紫外线诱变，化学方法如，亚硝基胍、氯化锂、硫酸乙二酯（DES）等单一诱变或几种物质相结合诱变的方法。采用上述的物理、化学方法均存在着工作量大，诱变效率低下等诸多问题。且对菌种自身会产生不同程度的抗性。另一种主要采用基因工程育种的方法，主要包括原生质体融合技术、DNA重组技术。原生质体融合技术是目前最常用也是最有效的菌种诱变手段之一，优点是细胞结构简单，生长迅速，所需设备简单，操作方便。缺点是突变率低，诱变剂效果不稳定。DNA重组技术其优点在于目的性强，能按照人们意愿改造目的基因。但缺点在技术难度大，mRNA贮存时间短，操作过程复杂。 

甜高粱[Sorghum bicolor (Moench)]是普通高粱的变种，全身是宝，不仅可用于生产粮食、制糖、饲料、造纸等，是最有希望的可再生能源作物。甜高粱属于C4植物，具有很高的光合效率，是目前世界上生物产量最高的作物，被称为“高能作物”。 

甜高粱秸秆汁营养丰富，以质量分数计：含糖量最高可达17％一24％、干物质28．2％、粗蛋白9．5％、粗脂肪2．76％、粗纤维29．5％，并富含18种必需氨基酸。其含有的糖分主要为果糖等可发酵性糖。甜高粱汁液作为一种新型的发酵碳源与糖蜜、淀粉等相比具有原料预处理工艺简单，能源消耗少，环境污染小等优点，因此，越来越受到世界各国的重视。 

酵母抽提物（YE）是酵母行业的一个重要产品，作为增鲜剂和风味强化剂而广泛应用到各种食品中。国际水解蛋白委员会在1977年规定：“酵母抽提物是用作天然调味料的食品配料。其主要成分：（1）氨基酸、肽以及多肽，是由食用酵母中的天然酶使肽键发生分解而产生的；（2）酵母细胞的水溶性成分。 

酵母抽提物是一种天然调味料，具有纯天然、营养丰富、味道鲜美、香味醇厚的优点，因此可广泛应用于食品加工、保健食品等诸多行业。由于生活水平与饮食***的迅速发展，消费者对食品安全、营养、健康的追求与人民的生活水平及饮食习惯发生了很大的提高和变化，酵母抽提物作为一种天然、安全、健康的食品配料，市场需求将不断扩大。 

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种高氮鲜酵母的制备方法。利用甜高粱汁液培养重离子辐照处理后筛选得到的高氮面包酵母，采用流加的发酵工艺，通过控制甜高粱汁液的初糖浓度，发酵过程中的温度、pH值、溶氧量以及甜高粱汁液的流加速度等。可以得到高生物量的面包酵母湿菌体，为后续酵母抽提物的生产提供优质的原料。 

本发明的还有一目的在于提供一种高氮鲜酵母抽提物的制备方法。 

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种高氮鲜酵母的制备方法，其主要特点是包括以下步骤： 

（1）准备菌种：Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No 5004，保藏日期为2011年6月29日；

（2）培养基按质量重量比：以固形物含量甜高粱汁液5-20Bx°为溶液，添加酵母粉0.5-5%，（NH₄）₂SO₄0.2-3%，MgSO₄0.03-1.5%，KH₂PO₄0.2-1.5%；

（3）甜高粱汁液的预处理：将压榨后的甜高粱汁液进行高温70-90℃蒸煮，时间为1-2小时，冷却后在3000-4000r/min离心分离，收集上清液备用；

（4）发酵：待发酵罐内灭菌后的甜高粱汁液降低到25-30℃的温度后，将酵母菌悬液按比例5%-10%接入到发酵罐内进行发酵；起始4-6小时可不通风或间歇通风；搅拌转速维持在50-100转/min；3-6小时后即进行流加糖液；

（5）经过适应期4-6小时后，且通风量为0.8-1.2V.V.m，搅拌速度为300-500转/min，添加营养盐（NH₄）₂SO₄ 0.2-3%、MgSO₄ 0.03-1.5%、KH₂PO₄ 0.2-1.5%；

（6）经过10-20h的对数生长期后，发酵逐渐进入到衰退期，发酵温度32-35℃，通风量为0.3-0.5V.V.m，搅拌速度为80-150转/min，停止流加糖液，测定发酵酪液中残糖浓度，小于0.5%视为发酵终了；

（7）发酵液处理：发酵酪液经过离心机分离，转速3000-4000转/min，维持10-15分钟后收集酵母湿菌体，加入5-15倍蒸馏水反复水洗2-3次，每次分离参与第一次水洗条件相同，洗涤完毕后得到含水分10%-30%的鲜酵母。

所述的高氮鲜酵母的制备方法，还包括以下步骤： 

所述步骤（1）准备菌种的步骤包括有：

A.准备菌种：Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母：

B.制备固体培养基按体积：按质量百分比葡萄糖3.0%-5.0%、蛋白胨0.5%-1.0%、酵母浸出粉0.2-1.0%、NH₄SO₄0.2%-3%、MgSO₄0.03%-1.5%、KH₂PO₄0.2%-1.5%，琼脂0.5%-1.5%，其余的为水的质量；

C.制备液体培养基：按体积百分比葡萄糖3.0%-5.0%、蛋白胨0.5%-1.0%、酵母浸出粉0.2-1.0%、NH₄SO₄ 0.2%-3%、MgSO₄ 0.03%-1.5%、KH₂PO₄ 0.2%-1.5%，其余为水：

D.斜面培养：将培养皿内的单菌落挑取后接入到已灭好菌的所述的固体培养基斜面上，25-35℃静置培养；

E.种子培养：挑取斜面菌种接入到已灭好菌的所述的液体培养基中，液体培养基为pH4-6，在25-35℃的温度下，摇床培养8-12小时，摇床转速为100-300r/min、接种量：5%-10%；

F.重离子辐照处理：待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比98-102比例的稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为：20Gy-100Gy；

G.酵母菌种在温度在-80℃保藏，若是斜面保藏在4℃保藏即可。

所述高氮鲜酵母抽提物的制备方法，其主要特点是包括以下步骤： 

（1）酵母菌悬液的调配：将权利要求1步骤7的鲜酵母加水稀释至5%-15%；

（2）酵母菌悬液的自溶：酵母细胞自溶，水解温度：50℃-60℃、自溶及水解时间：15-25h、自溶促进剂：葡萄糖0.5%-5%、氯化钠0.3%-5%、乙醇0.2%-6%，其余为水，Ph值（5-7）；             

（3）酵母菌悬液的酶解：木瓜蛋白酶、5′-磷酸二酯酶；水解温度：50℃-60℃、水解时间10-12h、水解酶添加量：木瓜蛋白酶：0.05-0.5%、5′-磷酸二酯酶0.05-1.0% ；

（4）水解液的处理：将反应完成后的水解液升温至90℃-95℃，维持10-15分钟；待水解液冷却至30-50℃，经过离心机分离，转速3000-4000转/min分离，维持10-15分钟后，回收上清液，将残渣用蒸馏水清洗1-2次后得到的上清液与之前的混合进行浓缩处理，真空度在0.05-0.08Pa；得初浓缩的酵母抽提物；

   （5）膏状酵母抽提物制备：将初浓缩的酵母抽提物进行进一步的浓缩，真空度维持在0.05-0.08Pa，待固形物含量达到70-75%时完成浓缩，得到膏状酵母抽提物。

所述高氮鲜酵母抽提物的制备方法，还包括以下步骤： 

（6）粉状酵母抽提物制备：将初浓缩的酵母抽提物进行喷雾干燥，维持干燥塔进风温度为180-220℃，出风温度为80-90℃。

本发明有益效果：利用重离子辐照诱变处理微生物菌种，为发酵行业提供优良目的菌株并使之产业化体现出其实用性及其可操作性。丰富了菌种诱变的方法，并为今后以重离子诱变微生物开拓了新的天地。重离子诱变技术的主要优点表现在：(1)变异率高，一般比自然变异率高1000倍以上；(2)变异谱宽，即变异的类型多，能够得到新类型的微生物菌种；（3）变异稳定性强，能够得到相对稳定的菌种（正、负突变同时存在）且能够缩短筛选周期；（4）突变可操作性强，能够较容易地完成对微生物的辐照诱变。 

1通过重离子辐照诱变处理得到了高氮的酵母菌种。利用重离子诱变技术能够有效地筛选出所需的目的菌种，与现有的诱变技术相比具有独到的诱变优越性。 

2利用简单的破壁方法：利用热蒸馏水进行速效破壁，省去了酵母自溶的时间、与超声破壁和高压均质破壁相比节省设备费用，降低筛选成本。 

3.甜高粱汁液作为发酵液中的碳源，与其他碳源培养基如:糖蜜、甜菜相比预处理工艺简单，节省能耗，提高生产效率。 

4.利用重离子辐照诱变后筛选的高氮菌种作为出发菌株进行生产，有利于得到高品质的高氮鲜酵母原料，为后续产品提供优良的原材料。 

5.利用上述生产酵母抽提物的工艺可生产出优良品质的高氮鲜酵母抽提物产品。 

利用碳重离子对酵母悬浮液进行辐照处理，通过多次实验对辐照剂量、菌悬液浓度、半致死率以及正突变率的研究确定了最佳的辐照剂量。并通过筛选工作得到了含氮量为50%-60%的高氮酵母菌种，较初发菌种含氮量提高了10%-15%。重离子辐照作为一种新型的微生物诱变方法具有广阔的应用前景，同时得到的高氮酵母菌种为今后生产酵母系列产品奠定了坚实的基础。 

附图说明：

图1为本发明高氮鲜酵母抽提物的制备方法流程图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。 

实施例1：  一种高氮鲜酵母的制备方法，包括以下步骤： 

（1）准备菌种：Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No 5004；

（2）培养基按质量重量比：以固形物含量甜高粱汁液5-20Bx°为溶液，添加酵母粉0.5-5%，（NH₄）₂SO₄0.2-3%，MgSO₄0.03-1.5%，KH₂PO₄0.2-1.5%；

（3）甜高粱汁液的预处理：将压榨后的甜高粱汁液进行高温70-90℃蒸煮，时间为1-2小时，冷却后在3000-4000r/min离心分离，收集上清液备用；

（4）发酵：待发酵罐内灭菌后的甜高粱汁液降低到25-30℃的温度后，将酵母菌悬液按比例5%-10%接入到发酵罐内进行发酵；起始4-6小时可不通风或间歇通风；搅拌转速维持在50-100转/min；3-6小时后即进行流加糖液；

（5）经过适应期4-6小时后，且通风量为0.8-1.2V.V.m，搅拌速度为300-500转/min，添加营养盐（NH₄）₂SO₄ 0.2-3%、MgSO₄ 0.03-1.5%、KH₂PO₄ 0.2-1.5%；

（6）经过10-20h的对数生长期后，发酵逐渐进入到衰退期，发酵温度32-35℃，通风量为0.3-0.5V.V.m，搅拌速度为80-150转/min，停止流加糖液，测定发酵酪液中残糖浓度，小于0.5%视为发酵终了；

（7）发酵液处理：发酵酪液经过离心机分离，转速3000-4000转/min，维持10-15分钟后收集酵母湿菌体，加入5-15倍蒸馏水反复水洗2-3次，每次分离参与第一次水洗条件相同，洗涤完毕后得到含水分10%-30%的鲜酵母。

实施例2：所述的高氮鲜酵母的制备方法，所述步骤（1）准备菌种的步骤包括有： 

A.准备菌种：Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母：

B.制备固体培养基按体积：按质量百分比葡萄糖3.0%-5.0%、蛋白胨0.5%-1.0%、酵母浸出粉0.2-1.0%、NH₄SO₄0.2%-3%、MgSO₄0.03%-1.5%、KH₂PO₄0.2%-1.5%，琼脂0.5%-1.5%，其余的为水的质量。

C.制备液体培养基：按质量百分比葡萄糖3.0%-5.0%、蛋白胨0.5%-1.0%、酵母浸出粉0.2-1.0%、NH₄SO₄ 0.2%-3%、MgSO₄ 0.03%-1.5%、KH₂PO₄ 0.2%-1.5%，其余为水。 

D.斜面培养：将培养皿内的单菌落挑取后接入到已灭好菌的所述的固体培养基斜面上，25-35℃静置培养； 

E.种子培养：挑取斜面菌种接入到已灭好菌的所述的液体培养基中，液体培养基为pH4-6，在25-35℃的温度下，摇床培养8-12小时，摇床转速为100-300r/min、接种量：5%-10%；

F.重离子辐照处理：待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比98-102比例的稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为：20Gy-100Gy；

G.酵母菌种在温度在-80℃保藏，若是斜面保藏在4℃保藏即可。

实施例3：一种高氮鲜酵母的制备方法，包括以下步骤：按照甜高粱汁液为1L进行试验，取1L已灭好菌的甜高粱汁液，外观糖含量为5-8Bx°(以此作为发酵的初糖浓度)，按照比例依次添加营养盐，酵母粉5-50g，（NH₄）₂SO₄2-30g，MgSO₄0.3-15g，KH₂PO₄2-15g。培养温度为28-30℃，pH值为4-7，摇床转速为：100-300转，培养时间约为16-24h。 

最后得到的酵母湿菌体经过离心分离，离心转速为3000-4000转/min，离心时间为8-12分钟，洗涤分离后的酵母乳2-4次，加水比例为2-5倍于发酵液。完成分离后得到酵母乳固形物含量为15-35%。 

实施例4：见图1，一种高氮鲜酵母抽提物的制备方法，包括以下步骤： 

（1）酵母菌悬液的调配：将权利要求1步骤7的鲜酵母加水稀释至5%-15%；

（2）酵母菌悬液的自溶：酵母细胞自溶，水解温度：50℃-60℃、自溶及水解时间：15-25h、自溶促进剂：葡萄糖0.5%-5%、氯化钠0.3%-5%、乙醇0.2%-6%，其余为水，Ph值（5-7）；             

（3）酵母菌悬液的酶解：木瓜蛋白酶、5′-磷酸二酯酶；水解温度：50℃-60℃、水解时间10-12h、水解酶添加量：木瓜蛋白酶：0.05-0.5%、5′-磷酸二酯酶0.05-1.0% ；

（4）水解液的处理：将反应完成后的水解液升温至90℃-95℃，维持10-15分钟；待水解液冷却至30-50℃，经过离心机分离，转速3000-4000转/min分离，维持10-15分钟后，回收上清液，将残渣用蒸馏水清洗1-2次后得到的上清液与之前的混合进行浓缩处理，真空度在0.05-0.08Pa；

   （5）膏状酵母抽提物制备：将初浓缩的酵母抽提物进行进一步的浓缩，真空度维持在0.05-0.08Pa，待固形物含量达到70-75%时完成浓缩，得到膏状酵母抽提物。

实施例5：高氮鲜酵母抽提物的制备方法，利用1L甜高粱汁液为8-20Bx°，制备出80-120g的鲜酵母。经过分离、洗涤后配制成3-8L的酵母菌悬液。升高温度至50-60℃，加入自溶促进剂：葡萄糖0.5%-5%、氯化钠0.3%5%、乙醇0.2%-6%，Ph值（5-7）自溶10-16小时。调节Ph值5-6，加入木瓜蛋白酶0.05-0.5%、5′-磷酸二酯酶0.05-1.0%水解10-12小时，90-95灭酶℃10-20min。离心机分离上清液，得到固形物为5-7 Bx°的上清液， 利用浓缩设备，真空度为0.05-0.08Pa，浓缩至固形物含量为70-75%即为膏状酵母抽提物。 

实施例6：高氮鲜酵母抽提物的制备方法，与实施例3步骤（1）至步骤（4）相同，还包括以下步骤： 

（6）粉状酵母抽提物制备：将初浓缩的酵母抽提物进行喷雾干燥，维持干燥塔进风温度为180-220℃，出风温度为80-90℃。得到粉状酵母抽提物。

采用本发明制备的粉状高氮鲜酵母抽提物经过甘肃省轻工研究院的检测，总氮含量为11.4%（除盐折干后）氨基态氮含量4.7%的优良品质。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (4)

1.一种高氮鲜酵母的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）准备菌种：Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No 5004；

（2）培养基按质量重量比：以固形物含量甜高粱汁液5-20Bx°为溶液，添加酵母粉0.5-5%，（NH₄）₂SO₄0.2-3%，MgSO₄0.03-1.5%，KH₂PO₄0.2-1.5%；

（3）甜高粱汁液的预处理：将压榨后的甜高粱汁液进行高温70-90℃蒸煮，时间为1-2小时，冷却后在3000-4000r/min离心分离，收集上清液备用；

（4）发酵：待发酵罐内灭菌后的甜高粱汁液降低到25-30℃的温度后，将酵母菌悬液按比例5%-10%接入到发酵罐内进行发酵；起始4-6小时可不通风或间歇通风；搅拌转速维持在50-100转/min；3-6小时后即进行流加糖液；

（5）经过适应期4-6小时后，且通风量为0.8-1.2V.V.m，搅拌速度为300-500转/min，添加营养盐（NH₄）₂SO₄ 0.2-3%、MgSO₄ 0.03-1.5%、KH₂PO₄ 0.2-1.5%；

（6）经过10-20h的对数生长期后，发酵逐渐进入到衰退期，发酵温度32-35℃，通风量为0.3-0.5V.V.m，搅拌速度为80-150转/min，停止流加糖液，测定发酵酪液中残糖浓度，小于0.5%视为发酵终了；

（7）发酵液处理：发酵酪液经过离心机分离，转速3000-4000转/min，维持10-15分钟后收集酵母湿菌体，加入5-15倍蒸馏水反复水洗2-3次，每次分离参与第一次水洗条件相同，洗涤完毕后得到含水分10%-30%的鲜酵母。

2.如权利要求1所述的高氮鲜酵母的制备方法，其特征是还包括以下步骤：

所述步骤（1）准备菌种的步骤包括有：

A.准备菌种：Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母：

B.制备固体培养基按体积：按质量百分比葡萄糖3.0%-5.0%、蛋白胨0.5%-1.0%、酵母浸出粉0.2-1.0%、NH₄SO₄0.2%-3%、MgSO₄0.03%-1.5%、KH₂PO₄0.2%-1.5%，琼脂0.5%-1.5%，其余的为水的质量；

C.制备液体培养基：按质量百分比葡萄糖3.0%-5.0%、蛋白胨0.5%-1.0%、酵母浸出粉0.2-1.0%、NH₄SO₄ 0.2%-3%、MgSO₄ 0.03%-1.5%、KH₂PO₄ 0.2%-1.5%，其余为水：

D.斜面培养：将培养皿内的单菌落挑取后接入到已灭好菌的所述的固体培养基斜面上，25-35℃静置培养；

E.种子培养：挑取斜面菌种接入到已灭好菌的所述的液体培养基中，液体培养基为pH4-6，在25-35℃的温度下，摇床培养8-12小时，摇床转速为100-300r/min、接种量：5%-10%；

F.重离子辐照处理：待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比98-102比例的稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为：20Gy-100Gy；

G.酵母菌种在温度-80℃保藏，若是斜面保藏在4℃保藏即可。

3.一种如权利要求1所述高氮鲜酵母抽提物的制备方法，其特征是包括以下步骤： 

（1）酵母菌悬液的调配：将权利要求1步骤7的鲜酵母加水稀释至5%-15%；

（2）酵母菌悬液的自溶：酵母细胞自溶，水解温度：50℃-60℃、自溶及水解时间：15-25h、自溶促进剂：葡萄糖0.5%-5%、氯化钠0.3%-5%、乙醇0.2%-6%，其余为水，Ph值5-7；             

（3）酵母菌悬液的酶解：木瓜蛋白酶、5′-磷酸二酯酶；水解温度：50℃-60℃、水解时间10-12h、水解酶添加量：木瓜蛋白酶：0.05-0.5%、5′-磷酸二酯酶0.05-1.0% ；

（4）水解液的处理：将反应完成后的水解液升温至90℃-95℃，维持10-15分钟；待水解液冷却至30-50℃，经过离心机分离，转速3000-4000转/min分离，维持10-15分钟后，回收上清液，将残渣用蒸馏水清洗1-2次后得到的上清液与之前的混合进行浓缩处理，真空度在0.05-0.08Pa；

（5）膏状酵母抽提物制备：将初浓缩的酵母抽提物进行进一步的浓缩，真空度维持在0.05-0.08Pa，待固形物含量达到70-75%时完成浓缩，得到膏状酵母抽提物。

4. 如权利要求3所述高氮鲜酵母抽提物的制备方法，其特征是还包括以下步骤：

（6）粉状酵母抽提物制备：将初浓缩的酵母抽提物进行喷雾干燥，维持干燥塔进风温度为180-220℃，出风温度为80-90℃。

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