CN103897031A - 化学修饰的胸腺五肽及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化学修饰的胸腺五肽及其合成方法，其具有以下结构：A-Arg-Lys-Asp-Val-Try-OH或H-Arg-Lys(A)-Asp-Val-Try-OH，所述A为小分子配体，所述小分子配体为与人血清白蛋白亲和性结合的脂肪酸，或与人血清白游离巯基偶联的马来酰亚胺衍生物。本发明的化学修饰的胸腺五肽修饰位点精确，化学结构明确，合成方法工艺简练，经化学修饰的胸腺五肽在静脉注射后立即特异性地与人体自身的血清白蛋白结合，将以人体自身的血清白蛋白作为缓释载体，从而大大延长其半衰期，显著增加有效药物浓度的持续时间，生物利用度高。

Description

化学修饰的胸腺五肽及其合成方法

技术领域

本发明属于生物化学药物合成领域，更具体地，本发明涉及一种化学修饰的胸腺五肽及其合成方法。

背景技术

胸腺五肽是我国第一个自主研发的化学合成多肽药物，也是医院销售额最高的化学合成类多肽药物之一，并且在我国医药市场中的用药规模逐年快速增长。胸腺五肽在临床上可用于多种恶性肿瘤的免疫治疗，以及手术、放疗和化疗的辅助治疗，并有效防治继发感染等并发症。此外，胸腺五肽也临床用于慢性病毒性肝炎、重大外科手术及严重感染、自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎和红斑狼疮等)、严重烧伤、II型糖尿病以及年老体弱免疫功能低下等疾病的治疗或辅助治疗，临床应用领域十分广阔。

药代动力学研究表明：胸腺五肽在人血浆中很快由蛋白酶和氨肽酶降解，半衰期约为30秒。目前在临床使用的制剂是注射用胸腺五肽冻干粉针，因而半衰期很短，极易在血浆中被酶降解而失去生物活性，生物利用度很低，临床使用时需要多次反复和长期注射等缺陷是目前胸腺五肽产品的主要问题。

目前主要采用微球制剂或聚乙二醇(PEG)化学修饰两大技术方案延长多肽药物的半衰期：微球注射剂目前是多肽缓释最成功的制剂技术之一，本技术以生物可降解聚合物如PLGA为骨架材料包裹多肽药物，使其在体内达到缓释效果，近10年来取得了许多成功的先例，如法国IPSEN公司研发的曲普瑞林PLGA微球、日本武田制药开发的亮丙瑞林微球等。但是，微球制剂技术目前存在包封率低，突释效应明显以及制剂工艺技术要求高，因此目前在国内多肽药物行业还难以推广。

PEG修饰在化学修饰法延长蛋白类药物取得了成功：如先灵葆雅公司的PEG化IFNα-2b、罗氏公司的PEG化IFNα-2a等。PEG修饰在化学修饰法的缺点是：由于PEG本身是聚合物，难以得到修饰位点精确、产物化学结构唯一的产物。此外，PEG分子量大，修饰后药物的生物活性大大下降。

近年来，以白蛋白的亲和性小分子配体如肉豆蔻酸修饰蛋白和多肽药物取得了极大的成功。诺和诺德(Novo Nordisk)公司的胰岛素产品诺和平(Levemir)就是以白蛋白的亲和性小分子配体肉豆蔻酸修饰的多肽药物，其半衰期从原来的4-6分钟延长至5-7小时。此后，诺和诺德公司利用类似的技术推出了肉豆蔻酸修饰的胰高血糖素(GLP-1)(商品名：Victoza)，将其半衰期从1.5-2分钟延长至11-15小时。然而，诺和诺德公司这两种产品的工艺都是先用基因工程表达胰岛素或胰高血糖素，而后通过肉豆蔻酸修饰得到最终产物。由于胰岛素或胰高血糖素中存在多个氨基修饰位点，因此应用本工艺难以得到修饰位点精确、产物化学结构唯一的产物。

发明内容

基于此，本发明提供了一种新的化学修饰的胸腺五肽及其合成方法，化学修饰的胸腺五肽修饰位点精确，化学结构明确，在保持胸腺五肽疗效的基础上，延长了胸腺五肽的半衰期，提高了胸腺五肽的生物利用度。

一种化学修饰的胸腺五肽，具有以下结构：

A-Arg-Lys-Asp-Val-Try-OH或H-Arg-Lys(A)-Asp-Val-Try-OH，所述A为小分子配体，所述小分子配体为与人血清白蛋白亲和性结合的脂肪酸，或与人血清白游离巯基偶联的马来酰亚胺衍生物。

在其中三个实施例中，所述脂肪酸为肉豆蔻酸，白蛋白上有多个结合位点能够高亲和性、高选择性地与肉豆蔻酸相结合。所述化学修饰的胸腺五肽的结构为：Myr-Arg-Lys-Asp-Val-Try-OH或H-Arg-Lys(Myr)-Asp-Val-Try-OH。

在其中一个实施例中，所述马来酰亚胺衍生物为马来酰亚胺的羧酸衍生物如丁酸、己酸或辛酸等。马来酰亚胺能够选择性地与白蛋白游离巯基发生亲核加成反应。

本发明还提供了上述化学修饰的胸腺五肽的合成方法，包括以下步骤：

(1)以Fmoc保护的酪氨酸王树脂为起始原料，按照标准Fmoc策略合成Fmoc保护的载有胸腺五肽的王树脂；

(2)以20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱去末端氨基Fmoc保护基团后，将小分子配体溶于二甲基甲酰胺，以HBTU和DIEA活化后与载有胸腺五肽的王树脂混合，缩合1小时后抽干，DMF洗涤，得到载有小分子配体修饰的胸腺五肽的王树脂；所述小分子配体与Fmoc保护的酪氨酸王树脂的摩尔比为2～6∶1；

(3)用三氟乙酸切割王树脂，得到小分子配体修饰的胸腺五肽粗产物，纯化、冻干得到纯产物。

在其中一个实施例中，所述小分子配体与Fmoc保护的酪氨酸王树脂的摩尔比为4∶1。

或包括如下步骤：

(1)以Fmoc保护的酪氨酸王树脂和Fmoc-Lys(Dde)-OH为起始原料，按照标准Fmoc策略合成Fmoc保护的载有胸腺五肽的王树脂；

(2)脱去赖氨酸侧链氨基Dde保护基团后，将小分子配体溶于二甲基甲酰胺，以HBTU和DIEA活化后与载有胸腺五肽的王树脂混合，缩合1小时后抽干，DMF洗涤四次后，得到载有小分子修饰的胸腺五肽的王树脂；所述小分子配体与Fmoc保护的酪氨酸王树脂的摩尔比为2～6∶1；

(3)用三氟乙酸切割王树脂，得到小分子配体修饰的胸腺五肽粗产物，纯化、冻干得到纯产物。

在其中一个实施例中，所述小分子配体与Fmoc保护的酪氨酸王树脂的摩尔比为4∶1。

在其中一个实施例中，所述DMF溶液中肼的体积百分含量为2％。

或包括如下步骤：

(1)将小分子配体偶联到Fmoc-Lys-OH上得到Fmoc-Lys(A)-OH；所述小分子配体与Fmoc-Lys-OH的摩尔用量比为1～3∶1；以Fmoc保护的酪氨酸王树脂和Fmoc-Lys(A)-OH为起始原料，按照标准Fmoc策略合成Fmoc保护的载有胸腺五肽的王树脂；其中A为小分子配体；

(2)脱去末端氨基Fmoc保护基团后，用三氟乙酸切割王树脂，得到小分子配体修饰的胸腺五肽粗产物，纯化、冻干得到纯产物。

在其中一个实施例中，所述小分子配体与Fmoc-Lys-OH的摩尔用量比为1∶1。

在其中一个实施例中，上述制备方法中三氟乙酸的用量为1ml/100mgFmoc保护的酪氨酸王树脂。

本发明根据人血清白蛋白的结构特征及其与小分子亲和性配体的结合方式，选择和优化高特异性、高亲和力的小分子配体定点修饰胸腺五肽，小分子配体包括人血清白蛋白亲和性结合的脂肪酸如肉豆蔻酸等，以及能够特异性地与人血清白游离巯基偶联的马来酰亚胺(maleimido)衍生物如马来酰亚胺基己酸等。由于人血清白蛋白能够特异性结合小分子配体，因此，小分子配体偶联的药物分子进入血液后快速与白蛋白结合，而人血清白蛋白的半衰期长达19天，因此配体偶联的胸腺五肽在静脉注射后立即特异性地与人体自身的血清白蛋白结合，将以人体自身的血清白蛋白作为缓释载体，从而大大延长其半衰期，显著增加有效药物浓度的持续时间，生物利用度高，克服了临床使用时需要多次反复和长期注射等缺陷，为研发新一代长效胸腺五肽提供了新工艺。

本发明通过改进的化学全合成胸腺五肽工艺，可以利用特殊的保护基团选择性地保护所要修饰的氨基酸位点，从而得到修饰位点精确，化学结构唯一的产物。本发明胸腺五肽的合成也可直接将小分子配体修饰赖氨酸的侧链氨基，然后用固相多肽合成法将配体修饰的赖氨酸整合到胸腺五肽中，得到化学修饰的胸腺五肽产物。

采用本发明的化学修饰的胸腺五肽的合成方法工艺简练，可在现有固相多肽合成法的基础上直接应用，也可用于液相多肽合成法合成的胸腺五肽，所得产物的修饰位点精确，化学结构清楚，完全符合国家食品药品监督管理局

(SFDA)关于化学合成多肽类新药的要求。

具体实施方式

以下结合具体实施例来详细说明本发明。

以下实施例中，Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂购自天津南开和成科技有限公司，各种保护的氨基酸原料、肽键缩合剂(HBTU、DIEA)以及三氟乙酸均购自吉尔生化(上海)有限公司。

实施例1化学修饰的胸腺五肽的合成方法

包括以下步骤：

(1)称量200毫克Fmoc保护的酪氨酸王树脂(Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin

0.25mmol/g)于手动固相多肽合成器中，加入DCM(二氯甲烷)溶胀30分钟。依次以Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH和

Fmoc-Arg(Pbf)-OH为氨基酸原料，以苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)为多肽缩合剂，树脂与每种保护氨基酸以及多肽缩合剂的当量比为酪氨酸王树脂∶氨基酸∶HBTU∶DIEA＝1∶3∶3∶6，按照标准Fmoc策略合成Fmoc保护的载有胸腺五肽的王树脂(化合物1)。

(2)以2毫升哌啶脱保护剂(哌啶∶DMF＝20∶80(v/v))脱去末端氨基Fmoc保护基团后，将46毫克肉豆蔻酸(0.2mmol)溶于2毫升二甲基甲酰胺(DMF)，以HBTU和DIEA活化后与载有胸腺五肽的王树脂混合，树脂与肉豆蔻酸以及多肽缩合剂的当量比为酪氨酸王树脂∶肉豆蔻酸∶HBTU∶DIEA＝1∶4∶4∶8，室温缩合1小时后抽干，DMF洗涤四次后，得到载有肉豆蔻酸修饰的胸腺五肽的王树脂；

(3)用三氟乙酸(TFA，2毫升)室温切割2小时得到肉豆蔻酸修饰的胸腺五肽粗产物，经高效液相色谱纯化后冻干得到纯产物肉豆蔻酸修饰的胸腺五肽——化合物2(收率39％)。

该实施例的化学修饰的胸腺五肽的合成反应方程式如下：

实施例2化学修饰的胸腺五肽的合成方法

包括以下步骤：

(1)称量200毫克Fmoc保护的酪氨酸王树脂(Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin

0.25mmol/g)于手动固相多肽合成器中，加入DCM(二氯甲烷)溶胀30分钟。

依次以Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH和

Boc-Arg(Pbf)-OH为氨基酸原料，以苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)为多肽缩合剂，树脂与每种保护氨基酸以及多肽缩合剂的当量比为酪氨酸王树脂∶氨基酸∶HBTU∶DIEA＝1∶3∶3∶6，按照标准Fmoc策略合成载有胸腺五肽的王树脂(化合物3)。

(2)以2ml肼的体积百分含量为2％的二甲基甲酰胺(DMF)溶液室温下反应2分钟脱去赖氨酸侧链氨基Dde保护基团后，将46毫克肉豆蔻酸(0.2mmol)溶于2毫升二甲基甲酰胺(DMF)，以HBTU和DIEA活化后与载有胸腺五肽的王树脂混合，树脂与肉豆蔻酸以及多肽缩合剂的当量比为酪氨酸王树脂∶肉豆蔻酸∶

HBTU∶DIEA＝1∶4∶4∶8，室温缩合1小时后抽干，DMF洗涤四次后，得到载有肉豆蔻酸修饰的胸腺五肽的王树脂；

(3)用三氟乙酸(TFA，2毫升)室温切割2小时得到肉豆蔻酸修饰的胸腺五肽粗产物，经高效液相色谱纯化后冻干得到纯产物肉豆蔻酸修饰的胸腺五肽——化合物4(收率37％)。

该实施例的化学修饰的胸腺五肽的合成反应方程式如下：

实施例3化学修饰的胸腺五肽的合成方法

包括以下步骤：

(1)先将肉豆蔻酸(460毫克，2mmol)溶于100毫升二氯甲烷(DCM)，以等当量的HBTU(759毫克，2mmol)和DIEA(260毫克，2mmol)活化2分钟后，

加入Fmoc-Lys-OH(736毫克，2mmol)，室温反应1小时后，减压蒸发DCM，将粗产物经HPLC纯化后得到Fmoc保护的肉豆蔻酸修饰侧链的赖氨酸

(Fmoc-Lys(Myr)-OH)872毫克，收率为76％。

反应方程式如下：

(2)称量200毫克Fmoc保护的酪氨酸王树脂(Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin

0.25mmol/g)于手动固相多肽合成器中，加入DCM(二氯甲烷)溶胀30分钟。

依次以Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Myr)-OH和

Boc-Arg(Pbf)-OH为氨基酸原料，以苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA))为多肽缩合剂，树脂与每种保护氨基酸以及多肽缩合剂的当量比为酪氨酸王树脂∶氨基酸∶HBTU∶DIEA＝1∶3∶3∶6，按照标准Fmoc策略合成Fmoc保护的载有肉豆蔻酸修饰胸腺五肽的王树脂(化合物5)。

(3)以20％哌啶DMF溶液脱去末端氨基Fmoc保护基团，DMF洗涤四次后，得到载有肉豆蔻酸修饰的胸腺五肽的王树脂；

(4)用三氟乙酸(TFA，2毫升)室温切割2小时，得到肉豆蔻酸修饰的胸腺五肽粗产物，经高效液相色谱纯化后冻干得到纯产物肉豆蔻酸修饰的胸腺五肽——化合物6(收率42％)。

该实施例的反应方程式如下：

实施例4化学修饰的胸腺五肽的合成方法

包括以下步骤：

(1)先将马来酰亚胺己酸(422毫克，2mmol)溶于100毫升二氯甲烷(DCM)，以等当量的HBTU(759毫克，2mmol)和DIEA(260毫克，2mmol)活化2分钟后，加入Fmoc-Lys-OH(736毫克，2mmol)，室温反应1小时后，减压蒸发DCM，将粗产物经HPLC纯化后得到Fmoc保护的马来酰亚胺已酸修饰侧链的赖氨酸

(Fmoc-Lys(Mal)-OH)960毫克，收率为83％。

反应方程式如下：

(2)称量200毫克Fmoc保护的酪氨酸王树脂(Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin

0.25mmol/g)于手动固相多肽合成器中，加入DCM(二氯甲烷)溶胀30分钟。

依次以Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Mal)-OH和

Boc-Arg(Pbf)-OH为氨基酸原料，以苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)为多肽缩合剂，树脂与每种保护氨基酸以及多肽缩合剂的当量比为酪氨酸王树脂∶氨基酸∶HBTU∶DIEA＝1∶3∶3∶6，按照标准Fmoc策略合成Fmoc保护的载有马来酰亚胺已酸修饰胸腺五肽的王树脂(化合物7)。

(3)以20％哌啶DMF溶液脱去末端氨基Fmoc保护基团，DMF洗涤四次后，得到载有马来酰亚胺己酸修饰的胸腺五肽的王树脂；

(4)用三氟乙酸(TFA，2毫升)室温切割2小时，得到马来酰亚胺己酸修饰的胸腺五肽粗产物，经高效液相色谱纯化后冻干得到纯产物马来酰亚胺己酸修饰的胸腺五肽--化合物8(收率38％)。

该实施例的反应方程式如下：

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种化学修饰的胸腺五肽，其特征在于，其具有以下结构：

A-Arg-Lys-Asp-Val-Try-OH或H-Arg-Lys(A)-Asp-Val-Try-OH，所述A为小分子配体，所述小分子配体为与人血清白蛋白亲和性结合的脂肪酸，或与人血清白游离巯基偶联的马来酰亚胺衍生物。

2.根据权利要求1所述的化学修饰的胸腺五肽，其特征在于，所述脂肪酸为肉豆蔻酸。

3.根据权利要求1所述的化学修饰的胸腺五肽，其特征在于，所述马来酰亚胺衍生物为马来酰亚胺丁酸、马来酰亚胺己酸或马来酰亚胺辛酸。

4.一种权利要求1所述的化学修饰的胸腺五肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以Fmoc保护的酪氨酸王树脂为起始原料，按照标准Fmoc策略合成Fmoc保护的载有胸腺五肽的王树脂；

(2)脱去末端氨基Fmoc保护基团后，将小分子配体溶于二甲基甲酰胺，以HBTU和DIEA活化后与载有胸腺五肽的王树脂混合，室温条件下缩合后抽干，DMF洗涤，得到载有小分子配体修饰的胸腺五肽的王树脂；所述小分子配体与Fmoc保护的酪氨酸王树脂的摩尔比为2～6∶1；

(3)用三氟乙酸切割王树脂，得到小分子配体修饰的胸腺五肽粗产物，纯化、冻干得到纯产物。

5.根据权利要求4所述的化学修饰的胸腺五肽的合成方法，其特征在于，步骤(2)中所述小分子配体与Fmoc保护的酪氨酸王树脂的摩尔比为4∶1。

6.一种权利要求1所述的化学修饰的胸腺五肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以Fmoc保护的酪氨酸王树脂和Fmoc-Lys(Dde)-OH为起始原料，按照标准Fmoc策略合成Fmoc保护的载有胸腺五肽的王树脂；

(2)用肼的体积百分含量为2-10％的DMF溶液脱去赖氨酸侧链氨基Dde保护基团后，小分子配体溶于二甲基甲酰胺，以HBTU和DIEA活化后与载有胸腺五肽的王树脂混合，室温下缩合后抽干，DMF洗涤，得到载有小分子修饰的胸腺五肽的王树脂；所述小分子配体与Fmoc保护的酪氨酸王树脂的摩尔比为2～6∶1；

(3)用三氟乙酸切割王树脂，得到小分子配体修饰的胸腺五肽粗产物，纯化、冻干得到纯产物。

7.根据权利要求6所述的化学修饰的胸腺五肽的合成方法，其特征在于，步骤(2)中所述小分子配体与Fmoc保护的酪氨酸王树脂的摩尔比为4∶1。

8.根据权利要求6所述的化学修饰的胸腺五肽的合成方法，其特征在于，步骤(2)中所述DMF溶液中肼的体积百分含量为2％。

9.一种权利要求1所述的化学修饰的胸腺五肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将小分子配体偶联到Fmoc-Lys-OH上得到Fmoc-Lys(A)-OH，所述小分子配体与Fmoc-Lys-OH的摩尔用量比为1～3∶1；以Fmoc保护的酪氨酸王树脂和Fmoc-Lys(A)-OH为起始原料，按照标准Fmoc策略合成Fmoc保护的载有小分子配体修饰的胸腺五肽的王树脂；其中A为小分子配体；

(2)脱去末端氨基Fmoc保护基团后，用三氟乙酸切割王树脂，得到小分子配体修饰的胸腺五肽粗产物，纯化、冻干得到纯产物。

10.根据权利要求9所述的化学修饰的胸腺五肽的合成方法，其特征在于，步骤(1)中所述小分子配体与Fmoc-Lys-OH的摩尔用量比为1∶1。