CN109608518A - 一种五肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种五肽，所述五肽的氨基酸序列为：Lys‑Phe‑Phe‑Ser‑Cys。本发明的五肽能够与血清白蛋白特异性结合，能够用于从混合物中分离纯化或清除血清白蛋白。

Description

一种五肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种五肽及其应用。
背景技术
血清白蛋白是脊椎动物血浆中含量最丰富的蛋白质，具有结合和运输内源性与外源性物质，维持血液渗透压，清除自由基，抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能。血清白蛋白的氨基酸序列非常保守，不同来源的血清白蛋白都有类似的空间结构。血清白蛋白广泛应用于生物、医药和化工等领域，社会经济效益可观。目前血清白蛋白多采用盐析、离子交换层析来分离，分离过程复杂，且分离效果不尽如人意。所以血清白蛋白的分离纯化技术依然有待提高。
亲和分离是利用某些亲和配体特异识别和可逆结合生物大分子的特性而建立起来的一种分离纯化方法，通常只需一步处理即可得到纯度较高的某种蛋白质。亲和配体是亲和分离的核心，因此开发血清白蛋白亲和配体，对血清白蛋白的分离纯化技术提高至关重要。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种五肽，其能够与血清白蛋白特异性结合，从而能够从混合物中分离纯化或清除血清白蛋白。
本发明提供一种五肽，所述五肽的氨基酸序列为：Lys-Phe-Phe-Ser-Cys。
本发明还提供上述五肽在特异性结合血清白蛋白中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1)高效：血清白蛋白吸附肽可以与血清白蛋白特异性结合。
2)安全：血清白蛋白吸附肽序列短，无免疫原性，安全无毒。
3)经济：血清白蛋白吸附肽由固相合成而得，技术十分成熟。
4)Cys末端的巯基实现定向交联，介质制备简单。
因而采用本发明的血清白蛋白吸附肽作为亲和配体，可以实现血清白蛋白从混合物中的分离纯化或清除。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1多肽合成
1)活化树脂：称取1000mg Fmoc Cys-wang Resin，在DMF中浸泡30min溶胀。
2)脱保护：抽滤除去DMF，加入含20％哌啶的DMF溶液氮气吹沸20min，压滤除去；用异丙醇洗涤树脂三次，DMF洗三次，而后用茚三酮法检测树脂Fmoc脱除状况。
3)缩合反应：连接氨基酸Ser，称取1.4mmol FMOC-Ser，以TBTU/HOBt/DIEA的DMF混合溶液为反应液，室温下氮气吹沸反应3h。反应后，用异丙醇洗涤树脂三次，然后用DMF洗涤树脂三次，分别抽滤除去，茚三酮法检测。Fmoc合成为C端开始，N端结束。
4)重复步骤2)～3)：依次将Ser、Phe、Phe和Lys连接完毕，完成多肽链延伸。多肽自N端至C端如下：Lys-Phe-Phe-Ser-Cys。
5)多肽切割：用氮气将多肽-树脂复合物吹干，采用phenol/H2O/thioanisole/EDT/TIS的TFA混合溶液为切割试剂，磁力搅拌3小时，抽滤液直接滴入冷冻***中，3000r/min离心收集沉淀，冻干至恒重即得粗肽。
6)粗肽用HPLC纯化至95％以上，纯化条件为将粗肽复溶于10％乙腈溶液中，以乙腈为流动相，采用10％至100％的乙腈流动相梯度洗脱30分钟，收集最大的峰，得到纯化后的多肽，多肽序列为：Lys-Phe-Phe-Ser-Cys，多肽纯度为97％。
实施例2亲和介质制备
1)取10mg步骤1制备的多肽溶解于20mL Hepes缓冲液，pH7.0。
2)取GE公司巯基活化后的Sephadex凝胶2mL。
3)上述两者混合反应4小时。
4)反应后，Hepes缓冲液洗涤凝胶颗粒，得到亲和介质。
实施例3血清白蛋白吸附肽分离纯化血清白蛋白
1)配制10mmol/L Hepes缓冲液，pH7.0，NaCl含量0.15M。设定流速1mL/min。
2)以1)中配制液体为流动相，运行AKTA蛋白纯化***。
3)取实施例2中亲和介质5mL填装分离柱。
4)分别上样血清白蛋白待分离液10mL。
5)配制pH2的0.1M HCl-Gly缓冲液作为洗脱液。
6)上样洗脱液15mL，收集洗脱液。
7)分别测定血清白蛋白待分离液和洗脱液中血清白蛋白含量和纯度，计算提取率。
表1血清白蛋白吸附肽介质吸附特性
由表1可知，本发明的血清白蛋白吸附肽可以实现将血清白蛋白从混合物中的分离纯化或清除。
实施例4亲和介质制备
1)取10mg步骤1制备的多肽溶解于20mL Hepes缓冲液，pH7.0。
2)取GE公司巯基活化后的Sepharose凝胶2mL。
3)上述两者混合反应4小时。
4)反应后，Hepes缓冲液洗涤凝胶颗粒，得到亲和介质。
实施例5血清白蛋白吸附肽清除血清白蛋白
1)配制10mmol/L Hepes缓冲液，pH7.0，NaCl含量0.15M。设定流速1mL/min。
2)以1)中配制液体为流动相，运行AKTA蛋白纯化***。
3)取实施例4中亲和介质5mL填装分离柱。
4)分别上样血清白蛋白与血红蛋白混合液10mL。
5)配制pH2的0.1M HCl-Gly缓冲液作为洗脱液。
6)上样洗脱液15mL，收集洗脱液。
7)洗脱液于截留分子量30000的超滤离心管，5000rpm离心10min，收集剩余洗脱液。
8)重复4)、5)、6)步骤一次。
7)分别测定血清白蛋白与血红蛋白混合液和洗脱液中血清白蛋白与血红蛋白含量和纯度，计算总清除率。
表2血清白蛋白吸附肽介质吸附特性
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南阳师范学院
<120> 一种五肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Phe Phe Ser Cys
1 5

Claims (3)

1.一种五肽，其特征在于：所述五肽的氨基酸序列为：Lys-Phe-Phe-Ser-Cys。
2.权利要求1所述的五肽在特异性结合血清白蛋白中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述五肽在非疾病的诊断和治疗目的分离纯化血清白蛋白或清除血清白蛋白中的应用。
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CN110818776A (zh) * 2019-12-04 2020-02-21 南阳师范学院 一种亲和肽及其应用

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CN102781959A (zh) * 2010-02-05 2012-11-14 埃博灵克斯股份有限公司 能够结合血清白蛋白的肽和包含所述肽的化合物、构建体和多肽
CN103897031A (zh) * 2012-12-25 2014-07-02 深圳先进技术研究院 化学修饰的胸腺五肽及其合成方法

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