CN101870732B

CN101870732B - 用固-液相结合法进行单聚乙二醇化胸腺五肽的合成方法

Info

Publication number: CN101870732B
Application number: CN 200910022329
Authority: CN
Inventors: 倪京满; 王锐; 王长林; 李倩
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2009-04-22
Filing date: 2009-04-22
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2029-04-22
Also published as: CN101870732A

Abstract

本发明涉及一种采用固-液相相结合法合成聚乙二醇化胸腺五肽(mPEG-TP5)的方法。首先采用液相合成技术将修饰化的聚乙二醇(mPEG-SCM)连接到氨基保护的赖氨酸侧链氨基上；再采用固相合成技术合成mPEG-TP5。通过透析、高效液相进行分析和纯化；通过核磁、质谱进行产物结构鉴定。本发明合成的聚乙二醇化胸腺五肽改善了原母体药物胸腺五肽的生物降解速度快，酶解稳定性差，生物半衰期短等缺点，具有很高的应用前景。

Description

用固-液相结合法进行单聚乙二醇化胸腺五肽的合成方法

技术领域

本发明涉及采用液相和固相相结合的合成技术进行聚乙二醇化的胸腺五肽的合成。

背景技术

胸腺五肽(Thymopentin，TP5)是一种由5个氨基酸残基的人工合成小分子肽，与内源性的胸腺生成素II具有相同的调节机体免疫平衡的生物活性。对于多种免疫功能紊乱或低下，TP5都能通过促进或抑制的双向调节作用使免疫功能趋于正常。目前，其已广泛应用于临床，可用于治疗：(1)恶性肿瘤；(2)慢性肝炎；(3)手术及严重感染；(4)糖尿病；(5)自身免疫性疾病；(6)更年期综合症；(7)衰老体弱等。但是TP5注射于人体后很快由蛋白酶和氨肽酶降解，药物原型的半衰期仅为30秒。然而，TP5治疗的疾病一般都需要长期用药，而目前可供临床应用的又仅有冻干粉针剂和溶液型注射剂。所以，TP5只能采取频繁注射或静脉滴注的方式给药，给患者带来了很大的痛苦和精神压力。急需要研制新的长效制剂产品。

药物的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰，即PEG化(pegylaytion)是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白质、多肽、小分子有机药物和脂质体上，从而改进药物的性质。使目的药物在输送、疗效和体内半衰期等方面都有显著改善，从而提高其临床价值和商业价值。1977年Abuchowski等首先应用聚乙二醇修饰药物蛋白(J.Biol.Chem.252，3582-3586.)，结果修饰后的蛋白质疗效优于未修饰的原型药物，其生物半衰期明显得到延长。此后，聚乙二醇修饰技术得到了迅速的发展并成功地开发出许多聚乙二醇修饰的蛋白质药物(或多肽药物)。

发明内容

胸腺五肽作为一种具有双向免疫调节作用的药物，应用非常广泛，具有进一步开发利用的价值和研究背景。为了改善其体内生物降解速度快，生物半衰期短的问题，本发明提供一种采用固相和液相结合方法合成聚乙二醇化胸腺五肽新技术。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

a.采用液相合成方法将单甲氧基聚乙二醇修饰物(mPEG-SCM)连接到α氨基保护的赖氨酸的侧链氨基(ε-NH₂)上；反应物芴甲氧羰基保护的赖氨酸盐酸盐(Fmoc-lys-OH.HCl)和单甲氧基聚乙二醇修饰物(mPEG-SCM)摩尔比为7∶1，反应体系为氯仿和二氧六环，体积比为1∶4；，常温下滴加二异丙基乙胺(N，N′-Diisopropylsilane，简称DIEA)，使PH保持9.0，磁力搅拌下，反应过夜；反应体系减压旋转抽干，反应物加水溶解，过滤掉水不溶物，用透析袋(MW，3500)透析48小时，冷冻干燥得白色粉末(Fmoc-lys(PEG)-OH)；

反应方程式如下：

b.采用固相合成法合成聚乙二醇化的胸腺五肽，具体步骤如下：

①Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂加入到二氯甲烷(DCM))浸泡30分钟，真空泵抽干，二甲基甲酰胺(DMF)洗涤，洗三次，每次三分钟；用含20％哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液机械搅拌0.5小时，脱Fmoc保护基；二甲基甲酰胺(DMF)溶液洗三次，每次三分钟；加入5％茚三酮醇溶液茚检试剂，沸水中加热三分钟，显蓝色；

②将Fmoc保护的缬氨酸(Fmoc-Val-OH)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、1-羟基苯并***(HoBt)分别溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，加二异丙基乙胺(DIEA)启动活化酯；反应常温下进行，体系用氩气保护，Fmoc-Arg(OtBu)-OH使用量为Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂的2.5～3倍，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和1-羟基苯并***(HoBt)为氨基酸的2倍，二异丙基乙胺(DIEA)为氨基酸的2倍，启动后将体系加入到已加入处理好树脂的固相合成仪中，机械搅拌45分钟，用二甲基甲酰胺(DMF)冲掉壁上的树脂，再搅拌15分钟后抽；二甲基甲酰胺(DMF)溶液洗三次，每次三分钟；茚检试剂检测无色，至此一个循环完成；

③再分别以Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(PEG)-OH，和Fmoc-Arg(pbf)-OH为氨基酸原料，重复以上①、②步骤，顺次完成mPEG-TP5的合成，得产物，产物的结构为：H-Arg-Lys(mPEG)-Asp-Val-Tyr-OH；

④按上述b①脱Fmoc保护，茚检试剂检测呈蓝色，体系用二氯甲烷(DCM)先洗2次，甲醇(MeOH)洗一次，每次三分钟；再用二氯甲烷(DCM)洗1次，MeOH洗2次，每次三分钟；移开搅拌器，用胶塞密封合成仪上端，用循环水式多用真空泵(SHB-III)抽2小时，加入切割试剂，反应3小时，每隔15分钟机械搅拌1分钟，收集切割剂，再用三氟乙酸(TFA)洗涤2次，合并切割剂与三氟乙酸(TFA)，体系在40℃下，减压旋转抽干，加20％冰醋酸的水溶液溶解，冻干；用双蒸水将冻干粉溶解，过滤掉水不溶物，透析48小时(透析袋，MW，3500)，冻干；反相高效液相色谱仪(RP-HPLC)进行进一步纯化，洗脱液为含有0.1％TFA的乙腈和水。

反应方程式如下：

本发明的优点和产生的有益效果：

1、本发明先采用液相合成技术将修饰化的聚乙二醇(mPEG-SCM)连接到氨基保护的赖氨酸侧链氨基上；再采用固相合成技术合成mPEG-TP5。通过透析、高效液相进行分析和纯化，合成具有潜在长效作用的聚乙二醇化的胸腺五肽。

该复合物结构上不易被体内蛋白酶水解，由于分子量大，可降低肾清除率，大大延长体内循环时间，从而达到显著延长半衰期、提高生物利用度的目的。

2、本发明提供的一种采用固相和液相相结合的方法，合成具有潜在长效作用的mPEG-TP5。目标产物结构准确，合成路线成熟，稳定。本发明提供的合成和分析纯化方法操作相对简单，所需成本低。有较好的大规模生产基础。

附图说明

图1为本发明合成产物的MALDI-TOF质谱图。

具体实施方式

一种用固-液相法合成聚乙二醇化胸腺五肽的方法，其步骤分为：

a.采用液相合成方法将单甲氧基聚乙二醇修饰物(mPEG-SCM)连接到α氨基保护的赖氨酸的侧链氨基(ε-NH₂)上；400mg芴甲氧羰基保护的赖氨酸盐酸盐(Fmoc-lys-OH.HCl)与700mg单甲氧基聚乙二醇修饰物(mPEG-SCM)反应，反应体系为6ml氯仿和24ml二氧六环；，常温下滴加二异丙基乙胺(N，N′-Diisopropylsilane，简称DIEA)800μl，使PH保持9.0，磁力搅拌，反应过夜；反应体系减压旋转抽干，反应物加40mL水溶解，过滤掉水不溶物，用透析袋(MW，3500)透析48小时，冷冻干燥得白色粉末600mg(Fmoc-lys(PEG)-OH)，产率78.5％。

产物核磁数据如下：

¹H-NMR(DMSO)7.31-7.77(8H，Fmoc-aromatics)，0.85(2H，-OCH₂CH₂-)，3.60(3H，-OCH₃)。HPLC检测：mPEG-SCM(紫外下没有吸收)，

Fmoc-lys-OH·HCL(t_R＝17.06)，产物(t_R＝20.35)。通过核磁和HPLC的判断，可知产物结构为Fmoc-Lys(PEG)-OH。

①Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂0.2g用二氯甲烷10ml(DCM))浸泡30分钟，然后用真空泵抽干，用二甲基甲酰胺(DMF)5ml洗涤，共三次，每次三分钟；用含20％哌啶的DMF溶液15ml机械搅拌0.5小时，脱Fmoc保护基；5mlDMF溶液洗三次，每次三分钟；加入4滴5％茚三酮醇溶液(茚检试剂)，沸水中加热三分钟，显蓝色。

②将Fmoc-Val-OH 75.34mg、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)84.14mg、1-羟基苯并***(HoBt)30mg分别溶解于DMF，加二异丙基乙胺73.4μl(DIEA)启动活化酯；反应常温下进行，体系用氩气保护，启动后将体系加入到已加入处理好树脂的固相合成仪中，机械搅拌45分钟，用二甲基甲酰胺(DMF)2ml冲掉壁上的树脂，再搅拌15分钟后抽；二甲基甲酰胺(DMF)溶液5ml洗三次，每次三分钟；茚检试剂检测无色，至此一个循环完成。

③分别以Fmoc-Asp(OtBu)-OH 91.35mg，Fmoc-Lys(PEG)-OH 588mg(1.5倍过量)，Fmoc-Arg(pbf)-OH 144mg为氨基酸原料，重复以上步骤，顺次完成mPEG-TP5的合成，得目标产物。产物的结构为：H-Arg-Lys(mPEG)-Asp-Val-Tyr-OH。

④按上述b(1)脱Fmoc保护，茚检试剂检测呈蓝色，体系用二氯甲烷(DCM)5ml先洗2次，甲醇(MeOH)5ml洗一次，每次三分钟；再用二氯甲烷(DCM)5ml洗1次，MeOH5ml洗2次，每次三分钟；移开搅拌器，用胶塞密封合成仪上端，用循环水式多用真空泵(SHB-III)抽2小时，加入切割试剂10ml。切割试剂配比为：三氟乙酸(TFA)∶双蒸水∶三异丙基硅烷＝95∶2.5∶2.5，反应3小时，每隔15分钟机械搅拌1分钟，收集切割剂，再用三氟乙酸(TFA)5ml洗涤2次，合并切割剂与三氟乙酸(TFA)，体系在40℃下，减压旋转抽干，加5ml 20％冰醋酸的水溶液溶解，冻干；用双蒸水5ml将冻干粉溶解，过滤掉水不溶物，透析48小时(透析袋，MW，3500)，冻干。反相高效液相色谱仪(RP-HPLC)进行进一步纯化，洗脱液为含有0.1％TFA的乙腈和水。得白色状粉末8.2mg，产物总产率2％。

合成的目标产物经基质辅助激光解析质谱测分子量和氨基酸测序仪进行测序(见图1、表1)，判断产物的结构为H-Arg-Lys(mPEG)-Asp-Val-Tyr-OH。

表1：上海基康生物技术有限公司出具的氨基酸N端测序结果如下表：

表1说明所测氨基酸数目及序列(从N端到C端)共5个，样品第二个氨基酸被修饰。

Claims

1.一种用固-液相法合成聚乙二醇化胸腺五肽的方法，其步骤分为：

a.采用液相合成方法将单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯(mPEG-SCM)连接到α氨基保护的赖氨酸的侧链氨基(ε-NH₂)上；反应物芴甲氧羰基保护的赖氨酸盐酸盐(Fmoc-lys-OH.HCl)和单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯(mPEG-SCM)摩尔比为7∶1，反应体系为氯仿和二氧六环，体积比为1∶4；常温下滴加二异丙基乙胺(简称DIEA)，使PH保持9.0，磁力搅拌下，反应过夜；反应体系减压旋转抽干，反应物加水溶解，过滤掉水不溶物，透析48小时，冷冻干燥得Fmoc-lys(mPEG)-0H白色粉末；

①Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂加入到二氯甲烷(DCM)浸泡30分钟，真空泵抽干，二甲基甲酰胺(DMF)洗涤，洗三次，每次三分钟；用含20％哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液机械搅拌0.5小时，脱Fmoc保护基；二甲基甲酰胺(DMF)溶液洗三次，每次三分钟；加入5％茚三酮醇溶液茚检试剂，沸水中加热三分钟，显蓝色；

②将Fmoc保护的缬氨酸(Fmoc-Val-OH)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、1-羟基苯并***(HoBt)分别溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，加二异丙基乙胺(DIEA)启动活化酯；反应常温下进行，体系用氩气保护，Fmoc-Val-OH使用量为Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂的2.5～3倍，苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和1-羟基苯并***(HoBt)为氨基酸的2倍，二异丙基乙胺(DIEA)为氨基酸的2倍，启动后将体系加入到已加入处理好树脂的固相合成仪中，机械搅拌45分钟，用二甲基甲酰胺(DMF)冲掉壁上的树脂，再搅拌15分钟后抽滤；二甲基甲酰胺(DMF)溶液洗涤树脂三次，每次三分钟；茚检试剂检测无色，至此一个循环完成；

③再分别以Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(mPEG)-OH，和Fmoc-Arg(pbf)-OH为氨基酸原料，依次按照步骤b的①、②步骤所述的脱Fmoc保护基和偶联步骤连接到树脂上，顺次完成带保护基的mPEG-TP5的树脂合成，得产物，产物的结构为： Fmoc-Arg(pbf)-Lys(mPEG)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂；

④按上述b①脱Fmoc保护基，茚检试剂检测呈蓝色，体系用二氯甲烷(DCM)先洗2次，甲醇(MeOH)洗一次，每次三分钟；再用二氯甲烷(DCM)洗1次，MeOH洗2次，每次三分钟；移开搅拌器，用胶塞密封合成仪上端，用SHB-III型循环水式多用真空泵抽2小时，加入切割试剂，反应3小时，每隔15分钟机械搅拌1分钟，收集切割剂，再用三氟乙酸(TFA)洗涤2次，合并切割剂与三氟乙酸(TFA)，体系在40℃下，减压旋转抽干，加20％冰醋酸的水溶液溶解，冻干；用双蒸水将冻干粉溶解，过滤掉水不溶物，用透析袋透析48小时，冻干；反相高效液相色谱仪(RP-HPLC)进行进一步纯化，洗脱液为含有0.1％TFA的乙腈和水。